Los simbiontes del ciclo del nitrógeno branquial pueden eliminar el amoníaco en las branquias

de los peces

Resumen

El conocimiento de los mecanismos por los cuales los peces excretan sus desechos metabólicos
nitrogenados y los conocimientos sobre el ciclo del nitrógeno en los sistemas de acuicultura es
de suma importancia para mejorar la producción comercial sostenible de peces. En los peces,
la mayoría de los desechos nitrogenados se excretan a través de las branquias como amoníaco,
un compuesto nitrogenado potencialmente tóxico. En este estudio; Se usaron ensayos de
actividad, experimentos fisiológicos, análisis molecular y microscopía para mostrar que las
branquias de los peces albergan una combinación única de microorganismos hasta ahora
pasados por alto en el ciclo del nitrógeno que, en teoría, pueden desintoxicar el amoníaco
excretado al convertirlo en gas dinitrógeno inerte. Al hacerlo, estos microorganismos pueden
beneficiarse del suministro de amoníaco por parte del huésped y evitar la acumulación de este
compuesto a concentraciones tóxicas.

Introducción

Los peces en acuicultura generalmente se alimentan con dietas ricas en proteínas para
maximizar el rendimiento del crecimiento (Ip et al ., 2004 ; Chakraborty et al ., 1992 ), pero esto
también conduce a altos niveles de desechos metabólicos nitrogenados. La mayoría de los
peces son amonotelicos; los desechos nitrogenados se excretan directamente como amoníaco
a través de transportadores específicos de amoníaco en las branquias de los peces
(Chakraborty y otros , 1992 ; Evans y otros , 2005 ; Nakada y otros , 2007 ). El amoníaco es
tóxico para los peces (Schram et al ., 2010 ) y las concentraciones en las branquias deben
mantenerse bajas para evitar daños en los tejidos.

Las branquias de los peces albergan una comunidad microbiana propia; La composición de la
microbiota es sustancialmente diferente de la comunidad microbiana del agua (Trust, 1975 ;
Wang et al ., 2010 ). Se pensaba que estos microorganismos solo pertenecen a unos pocos
taxones (Steinum et al ., 2009 ), pero desde la aplicación de nuevas técnicas de secuenciación,
parece que la microbiota branquial es más compleja de lo que se pensaba (Lowrey et al .,
2015). Debido al suministro constante de nitrógeno, las branquias serían un nicho ideal para los
microorganismos del N-ciclo. Sin embargo, hasta ahora no se ha demostrado la presencia de
microorganismos del ciclo N en las branquias de los peces. Un consorcio de microorganismos
que reducen los nitritos y el nitrato de amoníaco teóricamente puede desintoxicar el amoníaco
excretado y convertirlo en inofensivo gas dinitrógeno dentro de las branquias de los peces.
Simbiosis como esta solo se demuestra para invertebrados, según lo revisado por Dubilier et
al . ( 2008 ).

Investigamos la presencia de un consorcio de bacterias del ciclo N en dos especies de peces

relacionadas; Carpa común ( Cyprinus carpio ) y pez cebra ( Danio rerio ). Se demostró que los
peces efectivamente producen gas dinitrógeno. Las bacterias oxidantes y desnitrificantes de
amoníaco podrían detectarse en tejido branquial utilizando técnicas moleculares (PCR y FISH) y
microscopía (FISH y TEM). En conjunto, los datos de este estudio muestran que las branquias
de los peces albergan un consorcio activo de bacterias del N-ciclo y peces teleósteos que
pueden arrojar nueva luz sobre el manejo del nitrógeno por parte de estos animales.

Resultados y discusión

Excreción de amoniaco por el pescado.

Comparamos las cantidades de amoníaco excretadas por la carpa que se alimentaron de forma
continua utilizando un sistema de alimentación automatizado que suministró pequeñas
porciones de alimentos durante todo el día (alimentado por la demanda; Klaren et al, 2013) .) o
alimentado una vez al día (alimentado a mano). Las concentraciones de amonio en los tanques
con peces alimentados por la demanda se mantuvieron relativamente estables durante el día
(Información de apoyo, Fig. S1), mientras que las concentraciones de amonio en los tanques
con peces alimentados manualmente alcanzaron un máximo de 1 a 5 h después de la
alimentación. Estos datos se utilizaron para calcular la excreción de amonio por estos grupos de
peces como un porcentaje del aporte total de nitrógeno (basado en la cantidad de alimentos
consumidos). Cuando se corrigió el consumo total de alimentos y nitrógeno utilizado para el
crecimiento, el 18% y el 31% de la ingesta de nitrógeno se detectó como amonio en el agua
para los peces alimentados por la demanda y los alimentados a mano, respectivamente. Esto
indica que se pudieron rastrear menos desechos nitrogenados en el agua del tanque para los
peces que fueron alimentados por la demanda. La producción de gas dinitrógeno por un
consorcio microbiano puede explicar la discrepancia en la excreción de amoníaco. Como se
muestra en la Información de apoyo, Fig. S1, los peces alimentados por la demanda excretan
amonio durante todo el día y, por lo tanto, los microorganismos en las branquias enfrentan un
suministro constante de amonio. Esto puede resultar en un aumento en el recambio de
amoníaco por la microflora de las branquias de los peces, lo que explica la diferencia en la
cantidad de nitrógeno rastreado en el agua.

Producción de gas nitrógeno por microorganismos presentes en las branquias de los peces.

Con el fin de probar si los peces de hecho producir gas nitrógeno, peces se transfirieron a
tanques herméticos con un pequeño espacio de aire lleno de una atmósfera de argón / O 2
mezcla de gases (80/20%). La acumulación de gas nitrógeno en este espacio de cabeza fue
seguida por mediciones de GC. De hecho, el dinitrógeno gaseoso fue producido por la carpa
(303 ± 113 µmol en 150 min, n  ≥ 5) y pez cebra (1.2 ± 0.9 µmol en 65 min, n  = 3). Los peces no
alimentados produjeron significativamente ( P  <0.05) menos gas nitrógeno en comparación
con los peces alimentados (26 ± 4 µmol en 150 min y 0.4 ± 0.04 µmol en 65 min para carpa sin
deshuesar y pez cebra, respectivamente), lo que sugiere que la producción de gas nitrógeno
depende al menos en parte Sobre la excreción del amoníaco derivado del catabolismo proteico
dietético. Exposición del pez cebra a 15El amonio marcado con N a través del agua ambiente
no dio lugar a la producción de 29 N 2 o 30 N 2, lo que demuestra que el amoníaco transmitido
por el agua no contribuye significativamente a la producción de gas nitrógeno.

Las branquias son los principales órganos excretores del amoníaco, por lo que se planteó la
hipótesis de que la conversión del amoníaco en gas dinitrógeno se produce en las branquias.
Para probar si el gas dinitrógeno fue efectivamente producido por microorganismos asociados
con branquias, las branquias de carpa disecadas se incubaron con amonio marcado con 15 N o
nitrito marcado con 15 N en presencia o ausencia de oxígeno (Fig. 1 ). En presencia de oxígeno,
las branquias produjeron 30 N 2 de amonio y nitrito marcados con 15 N. Adición de 15El
amonio N marcado en ausencia de oxígeno no dio lugar a la formación de gas dinitrógeno
marcado. Estos resultados sugieren que el gas dinitrógeno se produce por la actividad
simultánea de microorganismos que oxidan y desnitrifican amoníaco. El primer grupo requiere
oxígeno para formar nitrito, mientras que las bacterias desnitrificantes no requieren oxígeno
para la reducción de nitrito a gas dinitrógeno. En general, se supone que la denitrificación está
inhibida por el oxígeno, pero la actividad de los microorganismos desnitrificantes en huéspedes
multicelulares se ha descrito anteriormente; también en presencia de oxígeno (Schläppy et al .,
2010). La ejecución de los experimentos de este y otros estudios que utilizan hospedadores no
vertebrados fue comparable a los experimentos realizados en este estudio. En nuestros
experimentos, no se pudo observar ninguna actividad de desnitrificación dentro de los 90
minutos de la incubación con nitrito en condiciones anóxicas. Sin embargo, se ha demostrado
anteriormente que la desnitrificación aeróbica a veces tiene una larga fase de retraso antes de
que se observe la conversión de nitrato o nitrito en gas dinitrógeno (Su et al ., 2015 ). De
hecho, la incubación prolongada (4 h) de las branquias en condiciones anóxicas con nitrito
finalmente dio como resultado 30 N 2 La producción, pero como la estructura branquial se
desintegró completamente después de este tiempo de incubación, es difícil sacar conclusiones
de estas observaciones.

Imagen

Figura 1

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Producción de gas nitrógeno por branquias disecadas de carpa común. Las branquias disecadas
se incubaron durante 90 minutos con amonio o nitrito marcado con 15 N en presencia o
ausencia de oxígeno. La producción de nitrógeno gaseoso marcado se muestra mediante un
aumento en la relación de 30 N al nitrógeno total. Los valores son la media ± DE ( n  = 6).

Análisis molecular de las branquias de los peces.

El ADN aislado de branquias (van Kessel et al ., 2011 ) se usó para el análisis de PCR con
cebadores que apuntan a los genes marcadores tanto de amoniaco oxidante (subunidad A de
amoníaco monoxigenasa, amo A) como de desnitrificación (nitrito reductasa, nir )
microorganismos (Tabla de información de respaldo S1). No se detectó el gen amoA de las
arqueas, mientras que se recuperaron los genes amoA y 16S rRNA de las bacterias oxidantes de
amoníaco (AOB) similares a Nitrosomonas (Información de respaldo, Fig. S2). El mismo análisis
se realizó utilizando muestras de agua de las unidades de acuicultura en las que se
mantuvieron los peces. Las nitrosomonas que prevalecenLas especies en el agua eran
filogenéticamente diferentes de las especies asociadas con las branquias. Se usaron reductasas
de nitrito ( nir S y nir K) como genes marcadores para las bacterias desnitrificantes. Solo las PCR
dirigidas al gen nir S dieron un producto (Información de apoyo, Fig. S3). Los organismos que
contienen estas secuencias nirS se han mostrado anteriormente en branquias de diferentes
especies de peces (Wang et al ., 2010 ; Steinum et al ., 2009 ). Sin embargo, hasta ahora no se
ha demostrado que estas bacterias puedan desnitrificarse en las branquias de los peces.

Microscopía sobre branquias de pescado.

La hibridación in situ de fluorescencia (FISH, Tabla de información de apoyo S2) y la

microscopía electrónica de transmisión (TEM) se aplicaron a las branquias de carpa para
estudiar el consorcio microbiano con más detalle. Las agallas de la carpa albergan grupos de
bacterias cerca de los vasos sanguíneos (Información de apoyo, Fig. S4). Estos grupos
bacterianos se hibridaron con sondas específicas contra especies de Nitrosomonas (Fig. 2 ). No
todas las bacterias objetivo de la sonda betaproteobacteriana fueron atacadas por la sonda
específica de Nitrosomonas . La presencia de otras especies betaproteobacterianas en las
branquias está en línea con los resultados obtenidos con el análisis molecular dirigido al nirS;
Las secuencias obtenidas también pertenecían a especies betaproteobacterianas. Los grupos
bacterianos se localizaron intracelularmente (Fig. 2 ), que es similar a los simbiontes de
mejillón (Duperron et al ., 2005 ). Se conocen bacterias intracelulares en las branquias de los
peces, pero estas bacterias están rodeadas por membranas dobles (Toenshoff et al ., 2012 ).
Las bacterias en nuestro estudio estaban rodeadas por una sola membrana. Además, los peces
que tienen bacterias intracelulares sufren reacciones tisulares (Toenshoff et al ., 2012). Nuestra
carpa estaba sana y no se observaron signos de daño tisular ni alteraciones, lo que indica que
las bacterias intracelulares que se observaron en nuestro estudio probablemente no son
patógenas.

Imagen

Figura 2

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Observaciones microscópicas del tejido branquial. Fluorescencia in situHibridación (FISH) en las

branquias de la carpa común (A., B., C.). A. FISH utilizando eubmix (Eub I, II, III, etiquetado con
Cy3) que apunta a todas las bacterias. B. FISH dirigido a beta-proteobacterias (bet42a +
competidor, etiquetado con FLUOS). C. FISH dirigido a bacterias beta-proteobacterianas que
oxidan el amoníaco (NSO1225, etiquetado con Cy5). Los grupos bacterianos son blanco de las
sondas. Muchas bacterias dentro de los grupos son bacterias oxidantes del amoníaco. Barra de
escala representa 10 µm. Microscopía electrónica de transmisión en branquias de carpa común
(D., E., F.). D. Los grupos de bacterias se encuentran cerca de los vasos sanguíneos dentro de las
branquias de la carpa. E. Las bacterias residen en las células huésped. F. Ampliación de las
células bacterianas en las branquias de la carpa. Las barras de escala representan 5 µm, 5 µm y
500 nm para los paneles D, E y F, respectivamente.

Conclusiones

En conclusión, estos resultados muestran que las branquias de la carpa y el pez cebra albergan
varias bacterias del ciclo N (oxidantes de amoniaco y desnitrificadores) en sus branquias. De
acuerdo con los ensayos de actividad realizados en este estudio, el amoníaco excretado por los
peces se convierte directamente en gas dinitrógeno por este consorcio microbiano. Esto puede
ser beneficioso para muchos peces amonotélicos porque puede hacer que las agallas sean
menos vulnerables a las altas concentraciones de amoníaco, pero esto debe investigarse con
más detalle. Al realizar más experimentos en animales con peces alimentados con alimentos
pobres en nitrógeno, se puede investigar la influencia de la cantidad de amoníaco disponible
para las bacterias. Además, se puede comparar la población microbiana en las branquias de los
peces ammonotelicos y ureotelicos. Los peces urreóticos excretan la mayor parte de sus
desechos nitrogenados como urea en lugar de amoníaco y, por lo tanto, son menos vulnerables
a las concentraciones tóxicas de amoníaco en sus branquias. Este es el primer estudio que
indica que la microflora de las branquias de los peces alberga bacterias que podrían ser
beneficiosas para los peces y esto puede ser de gran importancia para nuestro conocimiento
sobre la excreción de desechos nitrogenados en los peces.

Expresiones de gratitud

Liesbeth Pierson es reconocida por su ayuda con la microscopía confocal. Maartje van Kessel
cuenta con el apoyo de una subvención ERC (232937). Mike Jetten es compatible con ERC
232937, ERC 339880 y OCW / NWO Gravitation Grant (SIAM 024002002). Laura van Niftrik
cuenta con el apoyo de NWO VENI subvención No. 863.09.009. Los autores declaran no tener
intereses financieros en competencia.