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Julio 2012
DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL GENOTÓXICO DE LAS
NANOPARTÍCULAS DE PLATA MEDIANTE EL ANÁLISIS DEL
CICLO CELULAR, LA APOPTOSIS Y EL ENSAYO DEL COMETA
EN LA LÍNEA CELULAR BEAS-2B.
Memoria presentada para optar al grado de Máster en Genética Avanzada por Lourdes
Amparo Vela Romero.
Primeramente a Dios por darme la oportunidad de continuar con mis estudios, guiarme a lo
largo del camino y por ayudarme a lograr mis metas y mis sueños.
Al Dr. Ricard Marcos por haberme dado la oportunidad de formar parte de su equipo de
investigación, y por la ayuda otorgada a lo largo del presente trabajo de investigación.
Gracias también a todos mis compañeros del Máster de Genética Avanzada y del laboratorio
por darme su amistad, y por haberme permitido compartir buenos momentos dentro y fuera
del laboratorio.
Agradezco a mi familia por su apoyo incondicional, por su confianza y por estar a mi lado a
pesar de la distancia. Gracias a mi padre por alentarme a seguir adelante con mis estudios y
por confiar en mí, gracias a mi madre por darme ánimos para seguir adelante y apoyarme
siempre, gracias a mi hermana por estar a mi lado en cada momento y por hacerme sentir
cerca de mi hogar, gracias a mi cuñado Luis Cerón por cuidar de mi familia en mi ausencia y
gracias a Dennys Páez por alentarme, apoyarme y por seguir a junto a mí a pesar de la
distancia y del tiempo.
A Yanara Astudillo por su amistad y por ser mi testigo y compañera a lo largo de esta
aventura. A todos mis amigos que a través de la distancia me han apoyado y han estado
conmigo animándome a seguir adelante. A todos los amigos becarios SENESCYT por ser mi
grupo de apoyo en buenos y malos momentos, y por haberme permitido vivir momentos de
esparcimiento en su compañía.
1. Introducción ...............................................................................................................................1
1.1. Nanotecnología: antecedentes y momento actual ................................................................1
1.2. Propiedades de los nanomateriales ......................................................................................2
1.3. Nanopartículas de plata ........................................................................................................3
1.4. Riesgos para la salud ............................................................................................................4
1.5. Toxicidad y genotoxicidad de las nanopartículas ...................................................................6
1.6. Análisis de la toxicidad y genotoxicidad ................................................................................7
1.6.1. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo .................................................7
1.6.2. Análisis apoptosis mediante citometría de flujo ..........................................................7
1.6.3. Ensayo del cometa.......................................................................................................8
2. Objetivos .................................................................................................................................. 11
3. Materiales y métodos............................................................................................................... 13
3.1. Cultivos celulares ............................................................................................................... 13
3.2. Protocolo de descongelación .............................................................................................. 13
3.3. Mantenimiento y pasaje de los cultivos .............................................................................. 13
3.4. Nanopartículas de plata ..................................................................................................... 14
3.4.1. Protocolo de dispersión de la nanoplata .................................................................... 14
3.4.2. Caracterización de las nanopartículas de plata ........................................................... 15
3.5. Ensayos de toxicidad y de genotoxicidad ........................................................................... 15
3.5.1. Ensayo de toxicidad ................................................................................................. 15
3.5.2. Análisis del ciclo celular a mediante citometría de flujo............................................ 17
3.5.1. Análisis de apoptosis mediante citometría de flujo .................................................. 17
3.5.2. Ensayo del cometa ................................................................................................... 18
4. Resultados ................................................................................................................................ 21
7. Bibliografía ............................................................................................................................... 43
RESUMEN
Estimas recientes indican que en los últimos años ha habido un crecimiento exponencial
de productos que contienen nanomateriales, hasta el año 2010 se estimó que
aproximadamente unos 1300 productos comerciales contenían nanomateriales,
esperándose que en el trascurso de los próximos años la cantidad de productos
incremente de manera significativa (Woodrow Wilson database). Entre los productos que
contienen nanomateriales se encuentran los cosméticos, cremas solares, aditivos
alimenticios, sistemas de administración de medicamentos, productos terapéuticos,
biosensores, y fármacos, entre otros (Wijnhoven et al., 2009; Liu et al., 2010).
Desde el punto de vista biofísico, las características biocinéticas de las nanopartículas son
cualidades atractivas para su aplicación en medicina como dispositivos de diagnóstico y
terapéuticos, así como en herramientas para investigar y entender los procesos
moleculares y las estructuras en las células vivas (Akerman et al., 2002). Por ejemplo, para
la administración de fármacos a tejidos que son difíciles de acceder como el sistema
nervioso central, o para la lucha contra el cáncer o para procedimientos de diagnóstico e
imagen (Oberdorster et al., 2005a).
Las nanopartículas tienen propiedades únicas debido a su pequeño tamaño. Todas las
nanopartículas, sin tomar en cuenta su constitución química, poseen una proporción área/
volumen que es extremadamente grande, ya que al reducir el tamaño de un material hay
un incremento del área con respecto al volumen. También muchas otras de las
propiedades físicas de las nanopartículas como la solubilidad y la estabilidad están
determinadas por la naturaleza de la superficie de la nanopartícula (Oberdorsen et al.,
2005b; Wijnhoven et al., 2009).
Otro factor importante es la relación superficie con el total de átomos, la cual incrementa
exponencialmente con la disminución del tamaño de la partícula. Así, a menor tamaño,
mayor proporción de átomos en la superficie, incrementando la reactividad de la
superficie de las nanopartículas, que pueden reaccionar con diferentes estructuras o
compuestos (Oberdorsen et al., 2005b)
Se predice que las nanopartículas exhiben gran actividad biológica por unidad de masa en
comparación con partículas de mayor tamaño (Oberdorsen et al., 2005a). Este incremento
de la actividad biológica puede ser positivo y deseable (como en el caso de la actividad
antioxidante), o ser portador de capacidad terapéutica y atravesar las barreras celulares
para la administración de fármacos, entre otras) o ser negativo e indeseable (mayor
toxicidad, inducción de estrés oxidativo y disfunción celular), entre otros (Oberdorsen et
al., 2005a).
Además del tamaño, la forma de las nanopartículas también les confiere propiedades
distintas, ya que la forma afecta directamente a la superficie expuesta, de tal manera que
afecta a su reactividad ya que a más superficie expuesta hay mayor reactividad en la
nanopartícula.
Los mayores fabricantes de productos de consumo en el área médica ya han tomado nota
de las propiedades antimicrobianas de la nanoplata y la están utilizando en productos
como vendajes de heridas, medias para prevenir infecciones en los pies y diversos
ungüentos (Foldjerg et al., 2009; Wijnhoven et al., 2009). Adicionalmente la nanoplata se
ha utilizado para prevenir la colonización bacteriana en varias superficies como catéteres y
prótesis (Foldbjerg et al., 2009). En la vida diaria se puede encontrar nanoplata en
productos como aerosoles, detergentes de lavandería, purificadores de agua, pinturas de
pared, así como en textiles para la fabricación de ropa , ropa interior, medias, etc (Lee et
al., 2011).
Por lo que respecta a su estructura, las partículas de nanoplata son menores de 100 nm y
consisten en alrededor de 20-15000 átomos de plata (Oberdorster et al., 2005 a; b; Lee et
al., 2011). En la nanoescala las partículas de plata, al igual que las demás nanopartículas,
exhiben propiedades físico-químicas diferentes a los materiales a gran escala, y estas
propiedades pueden estar afectando su toxicidad; sin embargo, a pesar del rápido
crecimiento de los nanoproductos en el mercado, existe un gran desconocimiento con
respecto al posible riesgo que supone la exposición a nanopartículas (Wijnhoven et al.,
2009).
A pesar del aparente beneficio de las nanopartículas, tanto en los usuarios como en la
economía, el incremento en su uso puede resultar en un aumento de la exposición tanto
en investigadores, trabajadores de la industria nanotecnológica, como consumidores, en
los que se pueden generar efectos adversos en su salud. Debido a su tamaño
extremadamente pequeño los nanomateriales son capaces de entrar en el cuerpo
humano por inhalación, ingestión, a través de la piel, inyección intravenosa o por
dispositivos médicos, pudiendo interactuar con las macromoléculas intracelulares. Debido
a su gran estabilidad las nanopartículas son capaces de mantenerse en el organismo y en
el ambiente durante largos períodos de tiempo; además, como ya se ha comentado, la
información de sus potenciales efectos adversos sobre la salud es bastante limitada. Así,
las mismas propiedades que hacen atractivas a las nanopartículas para el desarrollo de
procesos industriales específicos y en nanomedicina, puede provocar efectos deletéreos
cuando las nanopartículas interactúan con las células, aunque no se conoce a que
concentración o tamaño estas nanopartículas pueden exhibir efectos perniciosos (Xia et
al., 2009).
El daño oxidativo usualmente supone una interferencia con el desarrollo del ciclo celular.
Dependiendo del tipo de daño las células se van a acumular en la fase G1, en la fase S o en
la fase G2/Mitosis (G2/M). Cuando el daño es irreversible las células entran en apoptosis
(AshaRani et al., 2009). Así, los estudios básicos de toxicidad se pueden complementar con
el análisis del ciclo celular y de la apoptosis , dado que comparten mecanismos comunes.
Tanto los efectos sobre el ciclo celular como sobre la apoptosis se pueden valorar
mediante la técnica de citometría de flujo. El análisis del ciclo celular permite cuantificar la
cantidad de DNA en cada etapa del ciclo celular, y para su determinación se emplean
fluorocromos (yoduro de propidio, DAPI o naranja de acridina) que se intercalan de
manera estequiométrica en el DNA, por lo que es posible determinar el contenido relativo
en cada una de las células y por lo tanto diferenciar la fase del ciclo en que se encuentra
cada una de ellas. Así, las células en la fase G0 o G1 presentan un contenido de DNA=2N,
cuando entran en división e inician la síntesis de material genético la cantidad de DNA es
mayor (fase S), mientras que las células en mitosis tienen exactamente el doble de DNA
justo antes de separase en dos células hijas (fase G2 y M), siendo su contenido igual a 4N;
las células apoptóticas en las que hay una degradación de la cromatina, presentan un
contenido menor a 2N, cuantificándose por la aparición de un pico en la región Sub G0.
(Nicoletti et al., 1991; McCloskey et al., 1994).
El ensayo del cometa es una herramienta rápida y sencilla que permite detectar roturas de
simple cadena (SSBs) y de doble cadena (DSBs), sitios álcali-lábiles (apurínicos y
apirimidínicos), así como roturas ocurridas durante el proceso de reparación por escisión
(Karlsson, 2010).
El principio del ensayo se basa en lisar células fijadas en una matriz de agarosa, cuyo DNA
es sujeto a electroforesis bajo condiciones neutras o alcalinas, dependiendo de si uno
quiere detectar predominantemente roturas de doble cadena (neutro) o roturas de simple
cadena (alcalino). Posteriormente el DNA se marca usando un agente fluorescente o
intercalante como el SYBRGold o el bromuro de etidio. La imagen (el cometa) que se
forma comprende el DNA intacto (la cabeza) y las cadenas de DNA dañado (cola) que
emigran del núcleo. Las imágenes del cometa sirven para determinar el porcentaje de
daño en el DNA, de manera que cometas con colas largas suponen un mayor número de
roturas del DNA (Petersen y Nelson, 2010).
El ensayo del cometa alcalino se puede modificar especialmente para detectar la
presencia de purinas oxidadas o de pirimidinas oxidadas, mediante la incorporación de
enzimas que intervienen en la reparación por escisión de bases (BER). Para detectar
purinas oxidadas generalmente se utiliza formamidopirimidina glicosilasa (FPG) y para
pirimidinas oxidadas la endonucleasa III (Endo III) (Petersen y Nelson, 2010). La enzima
FPG reconoce diversas purinas oxidas como la 8-oxo-7,8-dihidro-2-guanosina (8-oxo-G),
que representa un importante daño genotóxico en las bases, y se considera como un
indicador de daño oxidativo en las bases del DNA (Asare et al., 2012). Estas enzimas
incrementan la especificidad y la sensibilidad del ensayo porque reconocen daños en
bases particulares y crean roturas adicionales en el DNA incrementando la cantidad de
DNA migrado (Karlsson, 2010). Por tanto, el uso de enzimas BER en el ensayo del cometa
permite estimar el nivel relativo de daño oxidativo inducido en las bases del DNA.
Aunque una de las ventajas que tiene el ensayo del cometa es su alta sensibilidad, esta
técnica es muy variable ya que pequeños cambios en las soluciones, concentraciones de
agarosa y condiciones de electroforesis, pueden variar los resultados obtenidos.
2. OBJETIVOS
GENERALES:
ESPECÍFICOS:
2) Establecer si las nanopartículas de plata son capaces de alterar las fases del ciclo
celular en la línea celular BEAS-2B, a través de la utilización de citometría de flujo.
Se utilizó la línea celular BEAS-2B para la los distintos ensayos de toxicidad, genotoxicidad
determinación del daño en el ciclo celular e inducción de apoptosis.
Las BEAS-2B son células epiteliales aisladas a partir del epitelio bronquial humano normal,
obtenidas a partir de la autopsia de individuos no cancerosos y, posteriormente
infectadas con el virus hibrido adenovirus 12-SV49 (Ad12SV40) para su inmortalización.
Estas células crecen en suspensión y se cultivan en medio BEGM libre de suero (Lonza/
Clonetics Kit Catalog No. CC-3170); este medio consiste en un medio de cultivo para
Células de Epitelio Bronquial Basales (BEBM, 550 mL almacenado a 4 °C) y suplementos de
crecimiento como extracto pituitario bovino BPE (2 mL), hydrocortisona (0,5 mL),
epinefrina (0,5 mL), trasferrina (0,5 mL), insulina (0,5 mL), ácido retinoico (0,5 mL),
triyodotironina (0,5 mL), GA-1000 (0,5 mL). Todos los componentes se deben almacenar a
-20 °C hasta su uso.
Las células se mantienen congeladas en un tanque de nitrógeno líquido a -196 °C. Para
descongelarlas se las calentó en baño maría a 37 °C y posteriormente se diluyeron en
medio fresco para después centrifugarse a 130 g durante 7 min con la finalidad de
eliminar el DMSO del medio. Finalmente las células se resuspendieron en medio de
cultivo BEMG precalentado a 37 °C.
Una vez establecidos los cultivos de las células se incrementó el número de éstas para
obtener suficiente material para los distintos experimentos. Para ello se hizo un lavado del
cultivo celular con PBS 1X (tampón fosfato salino) y posteriormente las células se
tripsinizaron con tripsina 1X durante algunos minutos. Para inactivar la tripsina se colocó
medio celular con 10% de suero o PBS 1X con 1% de suero. Para eliminar el suero
presente en la suspensión, ésta se centrifugó a 130 g y las células se resuspendieron en
medio BEMG precalentado a 37 °C.
Aproximadamente cada dos días se llevó a cabo el cambio de medio de cultivo y una vez
que el cultivo llega a la confluencia se tripsinizó para establecer nuevos cultivos o para
llevar a cabo los ensayos.
Para realizar todos los ensayos (caracterización, toxicidad, genotoxicidad, ciclo celular y
apoptosis) es necesario llevar a cabo una buena dispersión de la nanoplata. En este
estudio se ha utilizado el protocolo "Nanogenotox" desarrollado dentro del proyecto
europeo del mismo nombre. Este método permite obtener un estado altamente disperso
de las nanopartículas. Para realizar la dispersión y las diferentes concentraciones de los
tratamientos el nanomaterial a ser utilizado (solución stock) debe tener una
concentración fija de 2,56 mg/mL, para lo cual se pesaron 15,36 mg de nanoplata pre
humedecida con 30 L de etanol absoluto. Posteriormente la nanoplata se dispersó en 6
mL de albúmina de suero bovino (BSA-agua al 0,05% w/v, Sigma Aldrich). La
homogenización de la dispersión se realizó por sonicación con el sonicador Branson Digital
Sonifier modelo S250-D equipado con una sonda de disrupción de 13 mm durante 16 min
a 400 W y 10% de amplitud, en un baño de hielo. Este protocolo asegura una dispersión
estable durante al menos una hora.
Los ensayos de toxicidad son un paso importante en los estudios de genotoxicidad ya que
estos nos dan información del porcentaje de células muertas y vivas en los tratamientos y
nos ayuda a ajustar los rangos de concentraciones a ensayar en los demás ensayos de
genotoxicidad. Para los ensayos de genotoxicidad, y en particular el del cometa, se
necesita que el porcentaje de supervivencia luego de los tratamientos sea de un 70%
como mínimo.
Para realizar el ensayo se sembraron 2 X 104 células por pocillo en una placa de 24 pocillos
y se incubaron durante 24 h. Para el tratamiento se utilizaron las concentraciones de 5,
10, 20, 50, 75, 100 y 200 g/mL de nanopartículas de plata previamente dispersa con el
protocolo de dispersión descrito anteriormente. Para el control negativo se utilizó H2O, y
como control positivo se utilizó 1,25 mM de bromato de potasio (KBrO3), los tratamientos
duraron 24 h.
Para este estudio se sembraron 2,5 X 105 células en placas de 6 pocillos, incubándose
durante 24 h. Éstas células se trataron con concentraciones de 5, 10, 50 y 100 g/mL de
nanopartículas de plata preparadas mediante el protocolo de dispersión anterior. Para el
control negativo se utilizó agua y para el control positivo se usaron las concentraciones de
50 y 100 mM de mitomicina-C (MMC). Las células tratadas se incubaron durante 24 h
luego del tratamiento. Posteriormente se tripsinizaron, lavaron con PBS, se recuperaron y
fijaron en etanol (70%) frio durante 24 h. Posterior a la fijación se eliminó el etanol y se
tiñeron las células con PBS + 40 g/mL de yoduro de propidio (Invitrogen, # de catalogo
SF7949600), y 0,1 mg/mL de RNAsa A ( Sigma-Aldrich, # de catálogo 12091-021).
El yoduro de propidio se utilizó para teñir el DNA de la célula y medir el contenido de DNA
durante el análisis del ciclo celular (Sánchez y Vargas, 2003). El ciclo celular se analizó a
través de citometría de flujo con el citómetro FACSCalibur Flow Cytometer (Becton
Dickinson Company). Los histogramas obtenidos se analizaron con el programa Flow Jo v.
7.2.5.
La tinción con yoduro de propidio nos permite diferenciar las células vivas de las
apoptóticas.
Para llevar a cabo este ensayo se sembraron 2 X 104 células por pocillo en una placa de 24
pocillos y se incubaron durante 24 h. Estas células se trataron con concentraciones de 1,
10 y 100 g/mL de nanopartículas de plata. Para el control negativo se utilizó agua y para
el control positivo se utilizó bromato de potasio (KBrO3) a la concentración de 1,25 mM.
Se incubaron los 3 GBF en una bandeja con solución de lisis (20 mL de DMSO, 2 mL de
Tritón-X en 300 mL de una solución de 2,5 M NaCl; 0,1 M EDTA; 10 mM Tris y 1% lauril-
sarcosinato a pH 10) a 4 °C durante toda la noche.
Dos de los tres GBF se retiraron de la solución de lisis, y se realizó un primer lavado de 10
min con el tampón de enzima ( 0,04 M HEPES; 0,10 M KCl; 0,0005 M EDTA; 0,2 mg/mL BSA
ajustado a pH de 8) precalentado a 37 °C; posteriormente, se realizó un segundo lavado
de 50 min en el mismo tampón. El tercer GBF se utilizó para medir el daño basal, y se
mantuvo en la solución de lisis.
Para detener la reacción se realizó un lavado de 5 min con solución de electroforesis (0,3
M NaOH; 0,001 M de EDTA a pH de 13,2) a 4 °C. Después, se realizó el tratamiento alcalino
colocando los 3 GBF en solución de electroforesis durante 35 min. Tras la incubación se
realizó la electroforesis a 20 V y 300 mA durante 20 min, asegurándose que la cámara de
electroforesis esté nivelada y que los GBF estén cubiertos por la solución.
Una vez finalizada la electroforesis se lavaron los GBF con PBS a 4 °C, y con agua durante
1 min.
Antes de fijar los GBF se les realizó un lavado con etanol absoluto 100% durante 5 min, y
luego se los dejó en un baño con el mismo compuesto durante 1 h. Posteriormente, se los
dejó secar en la oscuridad aproximadamente durante unas 2 h. Finalmente se marcaron
los carriles de los GBF con rotulador.
La tinción se realizó sumergiendo a los GBF durante 20 min en un recipiente que contenía
20 L de una solución stock congelada del fluorocromo SYBRGold (Invitrogen) disuelta en
25 mL de Tris-EDTA (10 mM Tris; 1 mM EDTA a pH 8,0) manteniéndolo en agitación
durante 20 min a 50 rpm (revoluciones por minuto). Posteriormente, se lavaron con agua
destilada y se dejaron secar.
Para llevar a cabo el análisis en el microscopio cada GBF se cortó en dos mitades, se los
colocó sobre el soporte para el microscopio y se los cubrió con un cubreobjetos.
A B
C D
La toxicidad se midió utilizando las concentraciones de 5, 10, 20, 50, 75, 100 y 200 g/mL
de nanoplata luego de 24 h de tratamiento. Se contaron el total de células vivas y muertas
y el porcentaje de células vivas se utilizó para el análisis.
Tabla 1. Porcentaje de células vivas en las diferentes concentraciones de nanoplata (5-200 g/mL) luego de
24 h de tratamiento.
100
* *
*
% de células vivas
*
80
*
60 *
40
20
0
Control- 5 10 20 50 75 100 200 Control +
Concentración g/mL
Una vez tratadas las células con nanoplata (5-100 g/mL) durante 24 h, las células
tripsinizadas y lavadas con PBS se fijaron con etanol y se tiñeron con yoduro de propidio
para medir el contenido de DNA durante el análisis del ciclo celular. El ciclo celular se
analizó por citometría de flujo.
Tabla 2. Porcentaje de células que se encuentran en cada fase del ciclo celular (G1,S y G2/M) después de los
tratamientos con nanoplata a las 24 h de exposición.
G1 S G2
En la Fig. 3 podemos observar los resultados de manera gráfica. Se observa que tanto en
el control negativo como en los diferentes tratamientos con nanoplata hay una mayor
población de células en la fase G1 comparada con las fases S y G2/M. Sin embargo, al
comparar entre el control negativo y las distintas concentraciones de nanoplata no existen
diferencias significativas entre las poblaciones de células que se encuentran en las fases
G1, S y G2/M. En esta línea celular se observa que al tratarse con mitomicina-C (MMC), a
concentraciones de 50, 100 y 300 mM, se observa una disminución significativa de la
población de células en la fase G1 y un incremento de la población de células en la fase
G2/M, en comparación con lo observado en el control negativo.
60
**
50
40
**
% de células
**
G1
30 * * S
G2
20
10
0
Control- 5 10 50 100 50 mM 100 mM 300 mM
MMC MMC MMC
Concentración g/mL
Figura 3. Las células BEAS-2B se trataron con diferentes concentraciones de nanoplata, 5-100 g/mL para
estudiar su efecto en el ciclo celular. Como control positivo se utilizó la mitomicina-C, 50, 100 y 300 mM. No
se observan diferencias significativas entre las poblaciones de células que se encuentran en las fases G1, S y
G2/M de los distintos tratamientos con nanoplata comparados con el control negativo. La significación
estadística se analizó mediante el test de Kruskal-Wallis. El asterisco indica una diferencia estadística
significativa comparando con los controles (*P<0,05, **P<O,01).
Control - 10,59
5 g/mL nanoplata 9,38
10 g/mL nanoplata 9,95
50 g/mL nanoplata 8,55
100 g/mL nanoplata 9,74
200 g/mL nanoplata 9,13
Control + CPT 10mM 30,96
Control + CPT 20mM 27,21
Los resultados anteriores se visualizan en la Fig. 4 donde se puede evidenciar que no hay
un incremento significativo de la población de células apoptóticas en las diferentes
concentraciones de nanoplata, cuando se comparan los valores observados con los del
control negativo. Los controles positivos, camptotecina (CPT) a las concentraciones de 10
y 20 mM si producen incrementos significativos de la población de células apoptóticas en
la línea celular BEAS-2B.
40
*
35
*
30
% Células apoptóticas
25
20
15
10
0
Control - 5 10 50 100 200 Control+ Control+
CPT 10 mM CPT 20 mM
Concentración g/mL
Figura 4. Las células BEAS-2B se trataron con diferentes concentraciones de nanoplata, 5 - 200 g/mL, para
estudiar su efecto en la apoptosis. Como control positivo se utilizó la camptotecina (CPT) a las
concentraciones de 10 y 20 mM. El porcentaje de células apoptóticas es bajo y no se observan diferencias
significativas entre las poblaciones de células apoptóticas de los distintos tratamientos comparados con el
control negativo. Los valores se analizaron mediante el test de Kruskal-Wallis. El asterisco indica una
diferencia estadística significativa comparando con los controles (*P<0,05).
El daño basal lo definimos como aquel que induce la nanoplata en ausencia de la enzima
FPG.
En la tabla 4 podemos observar los porcentajes de DNA en la cola obtenidos con las
diferentes concentraciones de nanoplata (1, 10 y 100 g/mL). Como se observa, ninguno
de estos tratamientos incrementa de manera significativa el porcentaje de DNA en la cola.
Tabla 4. Porcentaje de DNA en la cola producido luego de 24 h de exposición a los distintos tratamientos e
incubados con tampón de lisis.
Los valores del daño genotóxico también se evidencian en la Fig.5. Como se aprecia de manera
gráfica ninguna de las concentraciones de nanoplata parece inducir aumento en los niveles de
daño comparado con el control negativo. Tampoco se observan diferencias significativas en los
tratamientos con KBrO3, que es un agente seleccionado específicamente para inducir daño
oxidativo.
10
9
8
% de DNA en la cola
7
6
5
4
3
2
1
0
Control- 1 10 100 Control+
Concentración g/mL
Figura 5. Las células BEAS-2B se trataron con diferentes concentraciones de nanoplata 1, 10, 100 g/mL,
para analizar el daño basal provocado por la exposición a dichas concentraciones de nanoplata. Como
control positivo se utilizó bromato de potasio (1,25 mM). Para el efecto genotóxico se toma como valor el
porcentaje de DNA en la cola. No se observan diferencias significativas entre el porcentaje de DNA de la cola
en los distintos tratamientos comparados con el control negativo. Los datos se analizaron por el test de
Kruskal-Wallis.
Para medir el daño provocado por el tampón de enzima, las células tratadas durante 24 h
con diferentes concentraciones de nanoplata (1, 10, y 100 g/mL) se embebieron en
agarosa y se incubaron con tampón de enzima. Posteriormente, se sometieron a
electroforesis y se tiñeron con SYBRGold para su visualización.
En la tabla 5 podemos observar los porcentajes de DNA en la cola obtenidos tras los
tratamientos con distintas concentraciones de nanoplata e incubación con el tampón de
enzimas. Estos valores se utilizan como valores de referencia para comparar con los que
se obtienen cuando se utiliza la enzima FPG.
Tabla 5. Porcentaje de DNA en la cola producido luego de 24 h de exposición a los distintos tratamientos e
incubados con tampón de enzima.
Los resultados obtenidos con la incubación con tampón de enzima se presenta de manera
gráfica en la Fig. 6, donde se observa claramente que no hay diferencias significativas
entre las diferentes concentraciones de nanoplata y el control negativo. El control positivo
KBrO3 tampoco muestra una diferencias significativas comparadas con el control negativo.
Estos resultados se asemejan a los obtenidos con tampón de lisis, indicando que el
tampón de enzimas no ejerce ningún tipo de efecto.
10
9
8
7
% de DNA en la cola
6
5
4
3
2
1
0
Control- 1 10 100 Control+
Concentración g/mL
Figura 6. Las células BEAS-2B se trataron con diferentes concentraciones de nanoplata (1, 10, 100 g/mL),
para analizar el efecto del tampón de enzima sobre el daño provocado por la exposición a estas
concentraciones de nanoplata. Como control positivo se utilizó bromato de potasio (1,25 mM). Para
determinar el efecto genotóxico se tomó como valor el porcentaje de DNA en la cola. No se observan
diferencias significativas entre el porcentaje de DNA de la cola en los distintos tratamientos comparados con
el control negativo. Los datos estadísticos se analizaron mediante el test de Kruskal-Wallis.
Para medir el daño oxidativo neto en las células, las células se sometieron a tratamientos
de 24 h a concentraciones de 1, 10, y 100 g/mL de nanoplata, estas células se
embebieron en agarosa y se incubaron con tampón de enzima junto con la enzima FPG,
posteriormente se sometieron a electroforesis y para su visualización se tiñeron con
SYBRGold.
Cuando los tratamientos se incubaron con la enzima FPG se obtuvieron los resultados
indicados en la Tabla 6, donde podemos observar el porcentaje de DNA en la cola luego
del tratamiento con la enzima FPG.
Tabla 6. Porcentaje de DNA en la cola producida luego de 24 h de exposición a los distintos tratamientos e
incubados con la enzima FPG.
Como en los casos anteriores estos valores también se expresan de manera gráfica en la
Fig. 7. En donde podemos observar que ninguna de las concentraciones de nanoplata
producen un incremento significativo del daño oxidativo neto. Hay que remarcar que en el
control positivo (KBrO3) si se produce un incremento significativo del daño oxidativo, con
lo que comprobamos el potente efecto oxidante del KBrO3.
70
**
60
50
% de DNA en la cola
40
30
20
10
0
Control- 1 10 100 Control+
Concentración g/mL
Fig 7. Las células BEAS-2B se trataron con diferentes concentraciones de nanoplata (1, 10, 100 g/mL) para
analizar el daño oxidativo provocado por la exposición dichas concentraciones. Como control positivo se
utilizó bromato de potasio (1,25 mM). Para determinar el efecto genotóxico se tomó el porcentaje de DNA
en la cola. No se observan diferencias significativas entre el porcentaje de DNA de la cola en los distintos
tratamientos de nanoplata comparados con el control negativo. El control positivo (KBrO 3) muestra un
efecto altamente significativo. Los valores se analizaron utilizando el test de Kruskal-Wallis. (**P<O,01).
5. DISCUSIÓN
Son varios los estudios que han evaluado la citotoxicidad de la nanoplata en diversos
sistemas celulares in vitro (Hackenberg et al., 2011), así como en sistemas in vivo
(Hackenberg et al., 2011), sin embargo, existe poca información acerca del potencial
genotóxico de la nanoplata.
Aunque algunos estudios sobre rutas de exposición sugieren que los pulmones son un
blanco fácil para las nanopartículas (Wijnhoven et al., 2009; Lee et al., 2011), pocos
estudios se han dirigido a analizar los posibles efectos tóxicos de la inhalación de
nanoplata. Además se conoce poco acerca de los mecanismos de citotoxicidad de la
nanoplata en células pulmonares in vitro. Es por esta razón que en este estudio hemos
utilizado la línea celular BEAS-2B que son células epiteliales bronquiales humanas para ver
el efecto de las nanopartículas de plata en distintos parámetros como la viabilidad celular,
el ciclo celular, la apoptosis y el daño en el DNA.
Los ensayos de toxicidad son pasos importantes cuando se quiere determinar la respuesta
celular a las sustancias tóxicas. Éstos proveen información sobre la muerte celular y la
supervivencia celular al tratamiento (AshaRani et al., 2009), además de que nos ayudan a
determinar el rango de concentraciones a utilizar en ensayos posteriores, incluidos los de
genotoxicidad. Para los ensayos de genotoxicidad, y cuando se utiliza el ensayo del
cometa, se requiere que el porcentaje de supervivencia de las células luego de los
tratamientos sea de un 70% como mínimo.
En los estudios realizados por Eom y Choi (2010) analizaron la sensibilidad de distintas
líneas celulares a la nanoplata así como a iones de plata. Las distintas líneas utilizadas
Jurkat T, NCI-H460, HeLa, HepG2, MCF-7 y BEAS-2B muestran diferencias de
susceptibilidad entre sí, lo que indica la existencia de factores intrínsecos en cada línea
celular. En dicho estudio no se encontraron diferencias significativas en la disminución de
la viabilidad en células BEAS-2B, NCI-N460 y HeLa expuestas a concentraciones de 0,05,
0,10, 0,5 y 1 mg/L de nanoplata, mientras que las células MCF-7 y HepG2 muestran
decrecimientos de la viabilidad a concentraciones de 1 mg/L. En las células Jurkat T se
observó una disminución de la viabilidad en todas las concentraciones, revelando que esta
línea celular exhibe una alta sensibilidad a la nanoplata (Eom y Choi, 2010).
Esta variación de la sensibilidad de las células frente al estrés químico causado por los
tratamientos, incluyendo la exposición a nanopartículas, ha sido evidenciada con
frecuencia, sin embargo no se han dilucidado los mecanismos subyacentes (Eom y Choi.
2010).
Estudios previos han enfatizado el papel que juega el estrés oxidativo en la toxicidad de
las nanopartículas (Xia et al., 2006; AshaRani et al., 2009). Se asume que la toxicidad de las
nanopartículas actúa mediante la inducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y que
el nivel de ROS depende de la composición química y de la estructura de la nanopartícula.
El estrés oxidativo tiene efectos específicos en las células, incluyendo daño oxidativo a las
proteínas y al DNA.
El estrés oxidativo ocurre cuando la cantidad de ROS excede la capacidad del mecanismo
de defensa antioxidante (Hackenberg et al., 2011). Asharani et al. (2009) sugieren que la
disrupción de la cadena de respiración de la mitocondria por la nanoplata incrementa la
producción de especies de oxígeno reactivas y el daño al DNA puede ser consecuencia de
la interrupción de la síntesis de ATP. Estos autores indican que el estrés oxidativo
producido en células tratadas con nanoplata afectan a la progresión del ciclo celular. Así,
células con daño en el DNA se acumulan en la fase G1, síntesis (S) o en la fase G2/mitosis
(G2/M) del ciclo celular y, además, células con daño irreversible van a sufrir apoptosis
dando lugar a la acumulación de células en la fase sub G1 (AshaRani et al., 2009).
La fase G1 es importante en el ciclo celular porque las células crecen y preparan a los
cromosomas para su replicación. La detención en la fase S permite a las células reparar el
DNA dañado antes de entrar en mitosis; sin embargo, si el daño inducido es severo e
irreparable, o si los mecanismos de reparación fallan, las células derivan hacia apoptosis o
necrosis (Liu et at., 2010).
En estudios previos como los realizados por Lee et al. (2011) en células pulmonares A549,
AshaRani et al. (2009) en células de glioblastoma humano y fibroblastos humanos y por
Eom y Choi (2010) en células Jurkat T, [expuestas a nanopartículas de plata], todas estas
líneas celulares muestran una detención del ciclo celular en la fase G2/M con una
disminución de la población de células en la fase G1. Una detención del ciclo celular en la
fase G2/M o S y un decrecimiento en la fase G1 sugiere que las nanopartículas de plata
están causando un serio daño celular (Eom y Choi, 2010).
A pesar de estos resultados, nuestros estudios con la línea celular BEAS-2B tratadas con
nanopartículas de plata no revelan un decrecimiento de la fase G1, al compararla con el
control negativo, ni tampoco muestran una detención del ciclo celular en la fase G2/M.
Estos resultados pueden estar indicando una ausencia de daño en el DNA o posiblemente
esté ocurriendo una apoptosis temprana, o una resistencia específica de nuestra línea
celular.
Las células con un daño importante van a sufrir apoptosis, dando lugar a la acumulación
de DNA dañado. La apoptosis se ha descrito como el mayor mecanismo de muerte celular
en la exposición a nanopartículas, encontrándose que el incremento de los niveles
celulares de ROS está asociado a la inducción de muerte celular por apoptosis y necrosis
en cultivos celulares (Ott et al., 2007).
Cuando evaluamos el grado de apoptosis generado en nuestra línea celular, los datos del
experimento con anexina-V indican que las células BEAS-2B tratadas con nanopartículas
de plata no están sufriendo apoptosis ni necrosis.
De manera conjunta los datos obtenidos en el análisis del ciclo celular y de la apoptosis
nos indican que las nanopartículas de plata utilizadas en este estudio no están causando
un serio daño al DNA de nuestras células ya que en éstas no se provoca una detención del
ciclo celular en ninguna de las fases y tampoco hay la acumulación de DNA dañado que les
pudiese provocar apoptosis.
Para probar si la nanoplata utilizada está provocando daño al DNA y en especial daño
oxidativo a las bases del DNA en BEAS-2B se realizó el ensayo del cometa.
Otro factor importante es la línea celular elegida para los ensayos de genotoxicidad de
nanomateriales ya que se ha evidenciado que hay diferentes respuestas al daño en el DNA
dependiendo de la línea celular ensayada.
6. CONCLUSIONES Y FUTURO.
De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, podemos concluir que:
2. Esta falta de genotoxicidad se asocia con una falta de alteración del ciclo celular y
la ausencia de apoptosis.
3. Según los resultados obtenidos con la enzima FPG la nanoplata no parece generar
especies reactivas de oxígeno, con lo cual no se estaría generando estrés oxidativo
en las células y por lo tanto el DNA no estaría siendo dañado.
FUTURO
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