Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Ciencias
Biología

Laboratorio de Biología Molecular de la célula I

Práctica 5 “Electroforesis de Proteínas”

● Arciniega Silva Sagrario Xochipitzahuac

● Hernández Pérez Yuridiana.
● Morales Zarco Martha Azucena
● Velasco Garcia Jhenifer
● Vazquez Ocampo Rebeca Joselyn.

Fecha de entrega : 2/04/2016.

Introducción:
Para conocer mejor el medio que nos rodea y su composición existen diversas técnicas
especializadas para su análisis. Biológicamente un tema muy estudiado son las
biomoléculas debido a su gran impacto en la formación de los organismos. Un método de
estudio para dicho campo es la electroforesis.

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de

estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por
tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.
Esta técnica tiene diversas utilidades, una de las más importantes es la separación de
proteínas, así como, determinar el peso molecular de distintas biomoléculas. (1)

Los fundamentos de la electroforesis son que <<cuando una mezcla de moléculas ionizadas
y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de
atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las
moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y
aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo). El
movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales;
inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que
se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento
browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía
cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor
difusión (2)

La electroforesis se puede realizar mediante distintas técnicas, una de las más comunes es
la electroforesis en gel, la cual se utiliza principalmente en ADN, ARN y proteínas. Este uso
popular de los geles se debe a que reúnen una serie de propiedades idóneas:
transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de
compuestos químicos. En la técnica de electroforesis en gel, la modalidad más utilizada es
la de SDS-PAGE. La cual consiste en mezclar las proteínas con el detergente aniónico SDS
para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La cantidad de SDS
unido a las proteínas es proporcional a su tamaño: el SDS se une en una proporción
aproximada de 1,4 g SDS/g proteína. Los complejos proteína/SDS poseen una estructura
elipsoide o de bastón, donde la cadena proteica es distendida y solubilizada por el
detergente. Dado que la relación final carga/masa queda constante para las distintas
proteínas (se anula su carga intrínseca), estas van a ser separadas en el gel poroso
fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamaño,
mayor movilidad de la proteína, y viceversa. (3)
Metodología:

Para hacer esta práctica se inició con el ensamble de la cámara de electroforesis que se
enjuago con agua desionizada para asegurarse que no tuviera restos de detergente o
grasa. Se colocó los espaciadores en las placas de vidrio una vez ensamblados y alineados
se colocaron dentro del porta geles.

Después se llevó la preparación del gel separador al 10%, 20 mL para cuatro geles. Se
añadieron en un vaso de precipitados de 50mL cada una de las soluciones en este orden;
Mezcla A de acrilamida-bis al 30% 6.6 mL, Amortiguador separador 4x (Tris 1.5 M pH 8.8,
SDS 0.4%) 5 mL, Agua desionizada 8.4 mL, Persulfato de amonio 10% 0.15mL,TEMED
0.015 mL, se agitó la mezcla sin formar burbujas ya que la entrada de oxígeno puede inhibir
la reacción ya obtenida la preparación se aplicó las placas de vidrio hasta una altura
aproximada de 4.5 cm. (minigeles), Se agregó 1 ml de agua desionizada encima del gel y se
dejó polimerizar alrededor de 30 min con la finalidad de evitar la entrada de aire y alinear la
superficie del gel con las placas de vidrio. Ya transcurrido el tiempo se lavó la superficie del
con agua desionizada antes de poner el concentrador.

Ahora para la preparación del gel concentrador al 4% con volumen 10 mL,Se añadió en un
vaso de precipitados de 50mL cada una de las soluciones en este orden; Mezcla A de
acrilamida-bis al 30% 1.3 mL, Amortiguador separador 4x (Tris 0.5 M pH 6.8, SDS 0.4%) 2.5
mL, Agua desionizada 6.20 mL, Persulfato de amonio 10% 0.075mL,TEMED 0.015 mL, se
agitó la mezcla sin formar burbujas ya que la entrada de oxígeno puede inhibir la reacción,
se aplicó en el espacio restante de las placas de vidrio, enseguida se insertó el peine y dejó
polimerizando 30 min.

Para la preparacion del amortiguador de corrida TGS 1x. Se calculo los mL necesarios de
TGS 10x para preparar 1 L de TGS 1x colocado en una probeta de 1,000mL. Aforamos a
1000mL con agua destilada se agregó en la cámara.

Se prepararon las muestras en microtubos como se indica en la siguiente tabla.

Número de tubo Muestras obtenidas Volumen de Muestra Volumen de

de la práctica 3 Amortiguador de
Muestra 4x

1 Leche diluida 1:4 15μL 5μL

2 Sobrenadante 15μL 5μL

diluido 1:1

3 Caseína purificada 15μL 5μL

(0.6 mg/mL)

Se hirvieron las muestras 1 minuto. Enseguida cada equipo cargó sus muestras con una
micropipeta dentro de cada pozo del gel cambiando las puntas para cada muestra, el orden
fue de la siguiente manera.

Carril 1. Vacío
Carril 2. Marcador de peso molecular (5μL)
Carril 3. Leche diluida 1:4 (10μL)
Carril 4. Sobrenadante (10μL )
Carril 5. Caseína purificada (10μL)
Carril 6. Vacío
Carril 7. Leche diluida 1:4 (10μL)
Carril 8. Sobrenadante (10μL )
Carril 9. Caseína purificada (10μL)
Carril 10. Vacío

Se conectaron los cables a la fuente y se aplicaron 170 V para los geles. El tiempo de
corrida fue de aproximadamente 45 min.
Para la tinción de gel una vez que los geles terminaron de correr, se descarta el
amortiguador de la cámara superior y se libera el porta placas; retiramos con cuidado los
separadores de las placas para liberar el gel y con uno de los separadores hicimos un corte
pequeño en el extremo superior izquierdo, donde se colocó la primera muestra, para
identificar la orientación del gel. Se lavó dos o 3 veces con agua para eliminar el SDS antes
de la tinción.Transferimos los geles a una charola que contiene la disolución fijadora. Se
calentó en el horno de microondas durante 1 minuto. Eliminamos el líquido. Después se
cubrió el gel con disolución para TEÑIR/DESTEÑIR y agregamos 1 mL de la disolución de
azul de Coomassie en etanol. Agitamos suavemente. Calentamos en el microondas y se
eliminó el líquido en el bote para ese desecho. Por último cubrimos con agua el gel.

Resultados:

Tabla 1

proteína marcador de logaritmo del distancia RF de marcador

marcador de peso molecular marcador del recorrida por las de peso
peso molecular (DA) peso molecular bandas (CM) molecular

Biorad 14.4 1.15 0.8 10.25

tripsina de soya 21.5 1.33 1.4 5.85

anhidrasa 31.0 1.49 3.7 2.27

carbónica
bovina

ovoalbúmina 45.0 1.65 4.7 1.74

albúmina sérica 66.2 1.82 5.9 1.38

bovina

fosforilasa 97.4 1.98 8 1.02

Tabla 2.
muestras distancias RF peso molecular residuo de los
recorridas por (DA) aminoácidos
las bandas
(CM)

sobrenadante 4 cm 2.25 274.339 2.49

caseína aislada 3.5 cm 2.57 577 5.2454

Discusión

BIBLIOGRAFÍA
- E.D.P. de Robertis, E.M.F. de Robertis I y II. Biología Molecular y Celular (1)
- Nelson, D. (2001) Lehninger Principios de Bioquímica, 3 ed. España, Omega (2)
- Lomonte, B. . (2008). Electroforesis en Gel de Poliacrilamida. Abril 1, 2016, de
Ciencias Biológicas Sitio web: http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/lab-
bioq-gen/archivos/Lomonte (3)