USO DEL ESPECTOFOTOMETRO Y DETERMINACION DE METABOLITOS EN

SUERO

ANAYA ANGÉLICA, PERTÚZ MARÍA TERESA, RODRÍGUEZ DÍAZ ANDREA

CAROLINA

Informe de Laboratorio

Profesora: Carmiña Vargas Z

UNIVERSIDAD DEL ATLANTICO

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

ATLANTICO, COLOMBIA

2017-2

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 RESUMEN

En este informe se busco determinar la glucosa en sangre en cinco muestras de

personas en la universidad del atlántico por medio de la utilización del
espectrofotómetro. La práctica se llevó a cabo con el fin de determinar la cantidad
de energía que absorbe y transmite una solución en función de longitud de onda.
La espectrofotometría es una técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en una solución. En esta práctica se daría a
conocer las características generales y conceptos relacionados con la
espectrofotometría La explicación del funcionamiento se harán espectros de
absorción con el fin de determinar la longitud de onda donde la muestra presenta
su máxima absorción o concentración para luego cuantificar datos de las distintas
concentraciones.

2
CONTENIDO

1. INTRODUCCION ......................................................................................................................4
2. OBJETIVOS ...............................................................................................................................5
2.1. General...............................................................................................................................5
2.2. Específicos: ......................................................................................................................5
3. MARCO TEORICO ...................................................................................................................6
4. JUSTIFICACION .......................................................................................................................7
5. MATERIALES Y METODOS...................................................................................................7
5.1. METODOLOGIA ...............................................................................................................8
6. RESULTADOS Y DISCUSION ...............................................................................................9
6.1. Curva Patrón De La Glucosa...........................................................................................9
6.2. Para las Muestras: ......................................................................................................... 13
7. CONCLUSION ........................................................................................................................ 16
8. BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 17

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 1. INTRODUCCION

La principal función bioquímica de la glucosa es la de proporcionar energía para

los procesos de la vida. El adenosín trifosfato ("ATP") es la fuente de energía
universal para las reacciones biológicas. La oxidación de la glucosa por las vías
glucolítica y del ácido cítrico es la fuente principal de energía para la biosíntesis
del ATP. El sistema para regular los niveles de glucosa sanguínea funciona para
lograr dos fines. El primero es para almacenar glucosa en exceso en relación a las
necesidades corporales inmediatas en un reservorio compacto (glucógeno) y el
segundo es para movilizar la glucosa almacenada de manera que mantenga el
nivel de glucosa sanguínea. La regulación de la glucosa sanguínea es esencial
para mantener al cerebro, cuya fuente energética primaria es la glucosa,
abastecido por una cantidad constante de la misma. La función de la insulina es
desviar la glucosa extracelular a los sitios de almacenamiento intracelular en la
forma de macromoléculas (como el glucógeno, lípidos y proteínas). Es así que la
glucosa es almacenada en tiempos de abundancia para los momentos de
necesidad.

En respuesta a la baja glucosa en sangre, como en períodos de ayuno, una serie

de agentes hiperglucemiantes actúa en las vías metabólicas intermediarias para
formar glucosa a partir de las macromoléculas almacenadas.

4
 2. OBJETIVOS

2.1. General
 Reconocer el uso adecuado del espectrofotómetro, así como
también aprender a realizar un curva patrón de acuerdo a los
espectros de absorción.
2.2. Específicos:
 Aprender a utilizar adecuadamente el espectrofotómetro.
 Establecer la relación entre la transmitancia y absorbancia con la
concentración de una solución.
 Evaluar la veracidad y estabilidad de un espectrofotómetro con
una longitud de onda de 550nm.
 Relacionar los resultados obtenidos en la práctica de laboratorio
con los principios en los que se fundamentan las mediciones
espectrofotométricas.

5
 3. MARCO TEORICO

La espectrofotometría es un método para el análisis óptico de investigaciones a

nivel biológico, consiste en medir la cantidad de energía radiante que absorbe un
sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a las
mediciones a una determinada longitud de onda, además la absorción de las
radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas dependen de la estructura de las
moléculas y es característica específica para cada sustancia química1. Para
realizar dicha técnica es usado un instrumento llamado espectrofotómetro que
está equipado con un dispositivo que tiene una escala lineal extendida de 0 a
100%. De manera de hacer tal instrumento de lectura directa en porcentaje de
transmitancia, se efectúan dos ajustes, llamados 0%T y 100%T. En el ajuste del
0%T se lleva a cabo mediante un cierre mecánico del detector y en el ajuste de
100%T se hace con el cierre abierto y el solvente en el camino de la luz. Como
consecuencia de interacciones entre los fotones y las partículas absorbentes, la
potencia del haz es atenuada. Para medir la transmitancia y la absorbancia, en el
espectrofotómetro la solución del analizado se debe contener en algún recipiente
transparente, tubo o celda.

Ley de Beer-Lambert: Esta ley se trata de un medio o método matemático, el cual

es utilizado para expresar de qué modo la materia absorbe la luz2, se aplica a una
solución que contiene más de una clase de sustancia absorbente. Siempre que no
haya interacción entre varias especies, la absorbancia total para un sistema
multicomponente está dada por:

A = A1 + A2 + A3 +........... + An = ε1 b c1 + ε2 b c2 + ε3 b c3 +........... + εn b cn

Finalmente la determinación del espectro de absorción del paranitrofenol, se

construye la curva patrón y se determina la concentración de la solución problema.

6
 4. JUSTIFICACION

El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de

técnicas analíticas que permitan si determinación cuantitativa y cualitativa así
como si caracterización físico-química y biológica

Esta práctica le permite al estudiante profundizar en los métodos de separación y

concentración y en las técnicas de espectrofotometría. Así mismo pretende que el
estudiante conozca los fundamentos físicos y químicos en los que se basa dicha
técnica. El estudiante deberá conocer el equipo, aplicaciones, limitaciones y
discutir los resultados obtenidos.

5. MATERIALES Y METODOS
- Micropipetas
- Tubos de ensayos (alrededor de seis)
- Muestras de suero
- Espectrofotómetro

Reactivos

- Solución patrón
- Agua destilada
- Reactivo de trabajo

7
 5.1. METODOLOGIA

Se dividió la práctica en dos sesiones. La primera que comprendió la utilización de

muestras patrón y la segunda utilizando muestras de suero de estudiantes
(hombres y mujeres). Primeramente, se rotularon los tubos de ensayo tanto para
solución patrón de la glucosa como también para la muestra de sangre. Se
procedió a pipetear las muestras con las cantidades asignadas a cada estudiante
y fueron depositadas en el tubo de ensayo correspondiente tanto la muestra
patrón como la réplica. Luego de depositar las muestras se agregó 2mL de
reactivo de trabajo y se procedió a homogenizar las muestras y dejar reposar por
15 min.

Mientras se dejaba reposar las primeras muestras en segunda instancia se

procedió a pipetear las muestras de sangre, (entregados por la docente) se
depositaron en los tubos de ensayo 20 μL de la muestra y la réplica diferente para
cada estudiante y se le añadió 2ml de reactivo de trabajo. Se procedió a
homogenizar las muestras y dejar reposar

Luego procedemos a determinar los puntos máximos de absorbancia de cada

muestra patrón y su respectiva réplica. Posteriormente, se calibró el espectrómetro
a cero con "muestra en blanco" (consistía en reactivo de trabajo) Y
finalmente se procede a determinar la absorbancia para la muestra patrón y la
réplica de cada estudiante, luego calculamos la media de cada absorbancia,
anotamos.

8
 6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1. Curva Patrón De La Glucosa

Tubos Responsa Sol. Agua Reacti A1 A2 Medi C/A

ble Patro destila vo de (replic a de
n De da trabaj a) Aa []
Gluco o 500n
sa m

Patron ANGELIC 5 μL 20 μL 2 mL 0.06 0.074 0.07 20 283.

1 A 7 05 mg/ 6
/Replic dL
a P1

Patron ANDREA 10 μL 15 μL 2 mL 0.13 0.090 0.11 40 361.

2 1 05 mg/ 9
/Replic dL
a P2

Patron ZULEIMA 15 μL 10 μL 2 mL 0.21 0.222 0.21 60 273.

3/Repli 6 9 mg/ 9
ca P3 dL

Patron VALENTI 20 μL 5 μL 2 mL 0.16 0.322 0.24 80 327.

4/Repli NA 7 45 mg/ 1
ca P4 dL

Patron JESÚS 25 μL 0 μL 2 mL 0.40 0.396 0.40 100 249.

5/Repli 5 05 mg/ 6
ca P5 dL

9
 Tendencia A1
y = 0.0036x - 0.0164
0.4 R² = 0.7707

0.3 Tendencia A1
Linear (Tendencia A1)

0.2 Linear (Tendencia A1)

Linear (Tendencia A1)
Linear (Tendencia A1)
0.1

0
0 20 40 60 80 100 120

Tendencia A1(Replica)
0.45 y = 0.0044x - 0.042
R² = 0.9641
0.4

0.35

0.3 Tendencia A1(Replica)

0.25
Linear (Tendencia
0.2 A1(Replica))
0.15 Linear (Tendencia
A1(Replica))
0.1

0.05

0
0 20 40 60 80 100 120

10
 Curva patron de la glucosa(media de A)
0.4
y = 0.004x - 0.0292
R² = 0.9421
0.3
Absorbancia

0.2 Tendencia
Linear (Tendencia)
Linear (Tendencia)
0.1 Linear (Tendencia)

0
0 20 40 60 80 100 120
Concentracion en mg/dl

La glucosa es la principal fuente de energía para el metabolismo celular. Se

obtiene fundamentalmente a través de la alimentación, y se almacena
principalmente en el hígado, el cual tiene un papel primordial en el manteniemiento
de los niveles de glucosa en sangre (glucemia). Para que esos niveles se
mantengan y el almacenamiento en el hígado sea adecuado, se precisa la ayuda
de la insulina, sustancia producida por el páncreas.

Como se puede observar el la Tabla 1 los niveles de glucosa en suero se

encuentran entre los 250 y 350 mg/dl, lo que indica que probablemente haya
indicios de diabestes ya que al analizarlos con datos establecidos, un nivel de 125
mg/dl o mayor casi siempre significa que el individuo presemta esta enfermedad.
Para los niveles normales de los valores de glucosa en sangre se debe tener una
absorbancia entre los 60-100mg/dl, en cambio los niveles que se encuentran entre
100-125 mg/dl significa que hay una alteración de la glucosa, dando origen a un
tipo de prediabetes.

Los niveles aleatorios de glucosa en la sangre superiores a los normales pueden

ser un signo de diabetes como ya lo habiamos mencionado anteriormente,
ádemas cuando este nivel de glucos es superior se le denomina hiperglucemia.

11
CALCULOS:

- Cálculos de la concentración: C1V1 = C2V2

Para P1  C2 = (100 mg/dL) (5 μL) / (25 μL) ; Asi que C2 = 20 mg/dL

Para P2  C2 = (100 mg/dL) (10μL) / (25 μL) ; Asi que C2 = 40 mg/dL

Para P3  C2 = (100 mg/dL) (15μL) / (25 μL) ; Asi que C2 = 60 mg/dL

Para P4  C2 = (100 mg/dL) (20μL) / (25 μL) ; Asi que C2 = 80 mg/dL

Para P5  C2 = (100 mg/dL) (25μL) / (25 μL) ; Asi que C2 = 100 mg/dL

- Cálculos de C/A

Para P1  (20 mg/dL) / 0.0705  283.68

Para P2  (40 mg/dL) / 0.1105  361.9

Para P3  (60 mg/dL) / 0.219  273.9

Para P4  (80 mg/dL) / 0.2445  327.1

Para P5  (100 mg/dL) / 0.4005  249.6

- Calculo de Fc [Factor de la curva]

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 []
∑
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
𝑛

Entonces tenemos que: Fc = 299.22

283.6 + 361.9 + 273.9 + 327.1 + 249.6

= 299.22
5

12
 6.2. Para las Muestras:

Curva Patrón De La Glucosa

Muestras Suero Reactivo A A(replica) Media de las Concen- C/A

de de Absorbancias tracion
sangre: trabajo a 500nm
Hombres []
y
mujeres

Abimael 20 μL 2 mL 0.282 0.245 0.2635 100 379.50

mg/dL

Luis 20 μL 2 mL 0.195 0.211 0.203 100 492.61

Felipe mg/dL

Margarita 20 μL 2 mL 0.205 0.205 0.205 100 487.80

mg/dL

Angie 20 μL 2 mL 0.275 0.276 0.2755 100 362.97

mg/dL

Liseth 20 μL 2 mL 0.200 0.220 0.21 100 476.19

mg/dL

13
 Curva patron de la glucosa
0.27

0.26

0.25
Absorbancia

0.24
Tendencia
0.23 Linear (Tendencia)
Linear (Tendencia)
0.22 Expon. (Tendencia)
Linear (Tendencia)
0.21

0.2
0 20 40 60 80 100 120
Concentracion en mg/dl

CALCULOS:

- Cálculos de la concentración: C1V1 = C2V2

Para Abimael  C2 = (100 mg/dL) (20 μL) / (20 μL) ; Asi que C2 = 100 mg/dL

Para Luis Felipe C2 = (100 mg/dL) (20 μL) / (20 μL) ; Asi que C2 = 100
mg/dL

Para Margarita  C2 = (100 mg/dL) (20 μL) / (20 μL) ; Asi que C2 = 100
mg/dL

Para Angie C2 = (100 mg/dL) (20 μL) / (20 μL) ; Asi que C2 = 100 mg/dL

Para Liseth  C2 = (100 mg/dL) (20μL) / (20 μL) ; Asi que C2 = 100 mg/dL

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 - Cálculos de C/A

Para Abimael  (100 mg/dL) / 0.0705  379.50

Para Luis Felipe (100 mg/dL) / 0.1105  492.61

Para Margarita  (100 mg/dL) / 0.219  487.80

Para Angie  (100 mg/dL) / 0.2445  362.97

Para Liseth  (100 mg/dL) / 0.4005  479.16

Calculo de Fc [Factor de la curva]:

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 []
∑
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
, Entonces tenemos que: Fc = 440.008
𝑛

379.50 + 492.61 + 487.80 + 362.97 + 479.16

= 440.008
5

15
 7. CONCLUSION

La absorbancia es la capacidad que tiene algunos compuestos para absorber la

radiación electromagnética, por tal razón pudimos observar que dependiendo de la
concentración y la longitud emitida se puede alcanzar un punto de absorción,
según esto la longitud y la absorbancia son proporcionales hasta alcanzar el punto
máximo.

Se pudo conocer el adecuado uso del espectrofotómetro que Permitió el cálculo

de concentración de metabolitos en suero.

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 8. BIBLIOGRAFIA

1. Cuantificación Calorimétrica de Biomoléculas. Nieves Abril Díaz, J. Antonio

Bárcena Ruiz, Emilio Fernández Reyes, Aurora Galván Cejudo & Fermín Toribio
Meléndez. Departamento de Bioquímica y Biología Celular. Facultad de Medicina-
Universidad de Rabanales. Córdoba, España.

2. Introducción a la Espectroscopia de Absorción Molecular Ultravioleta, visible e

Infrarrojo cercano. Ing. Carlos Brunatti. Lic. Ana María Martín.

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