La Espectrometría de Masas es una poderosa técnica microanalítica usada para identificar

compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y

propiedades químicas de moléculas. La detección de compuestos puede ser llevada a cabo con
cantidades realmente pequeñas (algunos pmoles) de muestra y obtener información característica
como el peso y algunas veces la estructura del analito. En todos los casos, alguna forma de energía
es transferida a las moléculas a analizar para afectar la ionización. En la técnica clásica de impacto
electrónico (electron ionization EI), algunas de las moléculas ionizadas del analito “explotan” en
una variedad de fragmentos ionizados, el patrón de fragmentación resultante así como los iones
residuales constituyen el espectro de masas. En principio, el espectro de masas de cada
compuesto es único y puede ser usado como se “huella química” para caracterizar el analito. El
proceso de análisis por espectrometría de masas comienza en llevar el compuesto a analizar a fase
gaseosa, la muestra debe tener una presión de vapor de que 10-2 mmHg, debido a que las
moléculas deben migrar por difusión desde el sistema de entrada hacia la cámara de ionización.
Las muestras pueden ser introducidas al espectrómetro de masas usando una sonda directa o por
entrada en lote (batch) para sólidos puros o líquidos volátiles. Analitos purificados por diferentes
técnicas de separación (cromatografía de gases, cromatografía de líquidos, electroforesis capilar,
etc.) pueden entrar al espectrómetro de masas tan pronto como vayan saliendo. Ya que las
moléculas neutras difunden en forma aleatoria por la fuente de ionización, solo una porción es
ionizada. El proceso de ionización más común en análisis en fase gaseosa es el de ionización
electrónica (EI), en el cual se transfiere energía a la molécula neutra en estado de vapor, dándole
suficiente energía para expulsar uno de sus electrones y de ese modo tener una carga residual
positiva. Este proceso produce un ion con carga positiva y un electrón suelto. La molécula ionizada
puede tener energía excesiva que puede ser disipada a través de la fragmentación de ciertos
enlaces químicos. El rompimiento de varios enlaces químicos permite la producción de fragmentos
de ion cuya masa es igual a la suma de las masas atómicas de un grupo de átomos que retienen la
carga positiva durante el proceso de fragmentación. Para compuestos no volátiles, iones de la
molécula intacta son producidos al pasar la solución por un campo eléctrico (electrospray
ionization) o por bombardeo de partículas (fast atom bombardment) o por interacción con
especies fotoexcitadas (matrix-assisted laser desorption). Después de producir los iones, el
siguiente paso es su análisis en el analizador de iones de acuerdo a su relación masa/carga (m/z).
Los iones tienen una carga eléctrica que les permite ser controlados por campos eléctricos; son
separados por su valor m/z en el analizador de masas. Existen diferentes tipos de analizadores de
masas: magnéticos, de cuadrupolo, trampa de iones cuadrupolo, trampa de iones magnética, o
tiempo de vuelo (time-of-flight). Los iones son analizados de acuerdo a su abundancia a lo largo de
la escala m/z. Durante el proceso de adquisición de datos provenientes del detector, los datos
pueden ser organizados en forma tabular o en formato de gráfica de barras para dar finalmente el
espectro de masas de la muestra analizada.

EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS
Un Espectrómetro de Masas es un instrumento que mide las masas de moléculas individuales que
han sido convertidas en iones. Un espectrómetro de masas no mide la masa molecular
directamente, pero mide la relación masa/carga de los iones formados de las moléculas. Los
espectrómetros de masas tienen siete componentes mayores: un sistema de entrada, una fuente
de iones, un analizador de masas, un detector, un sistema de vacío, un sistema de control y un
sistema de datos. El sistema de entrada, junto con la fuente de iones y el tipo de analizador de
masas definen el tipo de espectrómetro y las capacidades del sistema. Los instrumentos usados
están compuestos de una combinación de sistemas de entrada, fuentes de iones, y analizadores
de masas (Tabla 1). Tabla 1. Variantes de componentes del sistema de espectrometría de masas
COMPONENTE VARIANTES Sistema de entrada 1. Directo. 2. Columna capilar cromatografía
líquida. Fuente de iones 1. Impacto electrónico. 2. Ionización Química. 3. Ionización de campo. 4.
Deserción de campo. 5. Bombardeo con Átomos Rápidos. 6. Electrospray, incluyendo nanospray y
microspray. 7. Matrix-assisted laser desorption (MALDI) Analizador de masas 1. Cuadrupolo. 2.
Trampa de iones (Ion-trap). 3. Tiempo de vuelo (Time-of-flight TOF). 4. Analizador FT-ICR Los
procesos básicos asociados con la espectrometría de masas abarcan desde la generación de iones
en fase gaseosa de un analito, y la medición de las relaciones masa/carga (m/z) de estos iones. La
formación de iones de la muestra en fase gaseosa es un prerequisito esencial en el proceso del
espectrómetro de masas en el proceso de verificación de masas moleculares o análisis. Aunque los
primeros espectrómetros de masas requerían que la muestra estuviera en forma gaseosa, nuevos
desarrollos han permitido incluir muestras en soluciones líquidas o en una matriz sólida.
Dependiendo del tipo de entrada y técnica de ionización usada, la muestra puede ya estar en
forma de iones en solución, o puede ser ionizada en conjunto con su volatilización por otros
métodos en la fuente de iones. El estudiar el analito como un ion en fase gaseosa le dan dos
características fundamentales. La primera característica fundamental es que el movimiento de los
iones en fase gaseosa puede ser controlado en forma precisa en campos electromagnéticos que
contienen los iones a estudiar y pueden ser manipulados para probar el movimiento del ion en el
campo. Debido a que el movimiento de los iones es proporcional a la relación m/z del ion, esto
justifica la medición de la m/z y por lo tanto la masa del analito. Los detalles concernientes a
diferentes tipos de técnicas de análisis de masas y técnicas de ionización utilizadas determinan
factores tales que la precisión y exactitud de la medición de m/z, la resolución, y el rango de m/z
del analizador. La segunda Figura 2. Componentes básicos de un espectrómetro de masas
Espectrometría de Masas 7 característica fundamental es que el uso de iones en fase gaseosa
incrementa la sensibilidad del espectrómetro de masas. El movimiento preciso de iones en campos
electromagnéticos que permiten medir m/z también les provee contención y enfoque. Durante el
proceso de medida de m/z, los iones son transmitidos con gran eficiencia a los detectores de
partículas que registran la llegada de estos iones. Estas llegadas son detectadas con gran
sensibilidad debido a una combinación de señales de bajo fondo y la eficiente generación de
electrones secundarios que pueden subsecuentemente ser multiplicados por factores de 105 o
mayores. El mantenimiento de la precisión y exactitud de estos movimientos y por lo tanto de la
sensibilidad del análisis requiere operación experta del sistema de espectrometría de masas.
Algunas desventajas del uso de iones en fase gaseosa es la dificultad de generación de los iones y
colocarlos en la fase gaseosa, además de la complejidad de los instrumentos utilizados en este tipo
de experimentos. El desarrollo de la ionización por electrospray y MALDI han aportado dos
importantes métodos para la producción de iones de péptidos y proteínas en fase gaseosa. Otra
consecuencia de la complejidad de los instrumentos es el alto precio de tales instrumentos en
términos su adquisición y costos de mantenimiento. Sin embargo, en general y considerando la
sofisticación, productividad y reproducibilidad de los experimentos desarrollados, se puede
justificar que el costo de la espectrometría de masas es proporcional con los costos asociados con
otros componentes en los proyectos de investigación que requieren este tipo de análisis

SECUENCIACIÓN DEL ADN

es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del

orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN
constituye la información genética heredable que forman la base de los programas de
desarrollo de los seres vivos (de procariotas, de eucariotas en el núcleo celular, y en
los plásmidos, en la mitocondria y en cloroplastos de las plantas). Así pues, determinar la
secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos
fundamentales, así como en campos aplicados, como la investigación forense. Además, se
puede utilizar la secuenciación del ADN para conocer las mutaciones somáticas, como las
sustituciones de bases, generadas entre distintos organismos. El desarrollo de la
secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos
en biología. Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo
cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como
el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la
colaboración investigadora a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN
de muchos genomas deanimales, plantas y microorganismos. A pesar de las distintas técnicas
que permiten secuenciar el ADN, no siempre se puede llegar a conocer el genoma completo
de los organismos. Esto, puede llevar a errores en la reconstrucción de los linajes y en la
estimación del tipo de mutaciones y del número de mitosis generadas.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR del

inglés Reverse transcription polymerase chain reaction) es una variante de PCR,
una técnica de laboratorio comúnmente usada en biología molecular para generar una gran
cantidad de copias de ADN, proceso llamado "amplificación". En la RT-PCR, sin embargo, una
hebra de ARN es retrotranscrita en ADN complementario (ADNc) usando
una enzima llamada transcriptasa inversa, y el resultado, se amplifica en
una PCR tradicional. PCR en Transcripción Reversa no debe ser confundido con la PCR en
tiempo real, PCR cuantitativa o Q-PCR, la cual a veces de manera errónea se abrevia como
RT-PCR.

La amplificación exponencial mediante PCR en Transcripción Reversa supone una técnica

altamente sensible, que puede detectar un número de copias de ARN muy bajo. Los
principales usos de la RT-PCR están relacionados con el campo del Diagnóstico Molecular y
con la investigación científica. Puede utilizarse como método de detección molecular de
genes, para estudiar el genoma de virus de ARN como los retrovirus (tales como el VIH) o el
virus de la gripe (virus de la influenza). Otro de sus usos se relaciona con la cuantificación de
la expresión génica, mediante la combinación de esta técnica con el análisis de Northern blot.
Una de las características más importantes es que en el proceso de RT-PCR, el ADNc
generado ya no lleva los intrones que sí tendría el ADN original. De este modo, al expresar el
ADNc producto de la RT-PCR, se generará un ARNm formado exclusivamente por exones.
Esto ha permitido darle a esta técnica uno de sus usos más importantes: insertar genes
eucariotas en organismos procariotas.
PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction)
es, sin lugar a dudas, la técnica más importante y revolucionaria en biología molecular, debido a
que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ácido desoxirribonucleico
(ADN) a partir de una sola molécula. La PCR se basa en la replicación celular en la que actúan
varias proteínas para sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como
molde. En procariontes se han encontrado al menos 12 proteínas involucradas

en la replicación. Estas proteínas actúan en diferentes actividades, como: 1) la identificación del

sitio de origen de la replicación; 2) el desenrollamiento de la doble hélice; 3) la estabilización de la
estructura desenrollada; 4) la generación de cadenas iniciadoras complementarias con un extremo
3’ libre que sirve de iniciador para que la ADN polimerasa comience su actividad catalizadora; 5) el
avance de la bifurcación replicadora por desenrollamiento; 6) los pasos finales del ensamblaje de
dos cadenas complementarias; 7) la identificación de los sitios de terminación y 8) el
superenrollamiento de las dos nuevas moléculas de ADN (Figura 1). Sin embargo, la enzima más
importante en la replicación es la polimerasa del ADN dependiente de ADN, comúnmente
conocida como ADN polimerasa, porque es la encargada de incorporar nucleótidos durante la
síntesis de las nuevas cadenas de ADN (Bohinski 1991).

Origen de la técnica de PCR La PCR surgió en 1971 cuando Gobind Khorana describe la técnica al
explicar la replicación de un fragmento de ADN usando dos iniciadores (Kleppe et al. 1971). Pero
fue en 1983 cuando Kary Mullis y sus compañeros de la compa- ñía californiana Cetus Corporation
la llevaron a cabo por primera vez mientras trabajaban en la fabricación de oligonucleótidos y en
el uso de iniciadores para la secuenciación de ADN. Mullis y colaboradores usaron dos iniciadores
que se alineaban con cada una de las hebras del ADN, adicionaron ADN polimerasa I de Escherichia
coli y nucleótidos trifosfatados. Como resultado obtuvieron la replicación exponencial del
fragmento de ADN flanqueado por los iniciadores (Mullis y Faloona 1987). En un principio, para
llevar a cabo el ciclo de PCR, se calentaba la mezcla en baño María, pero cuando llegaba a más de
90 ºC para desnaturalizar la doble hélice, la ADN polimerasa de E. coli se inactivaba. Por este
motivo, cada que se calentaba a estas temperaturas se tenía que adicionar nueva enzima a la
mezcla. El proceso original era poco eficiente, utilizaba grandes cantidades de ADN polimerasa y
necesitaba de supervisión durante todo el proceso (Mullis y Faloona 1987)
La tinción hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tinción
hematoxilina y eosina es uno de los métodos más populares de tinción utilizado
en histología y medicina diagnóstica.

El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica,
tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos azul y púrpura,como por ejemplo los núcleos
celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos (acidófilos) en tonos de color rosa,
gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma.

Técnica[editar]
 Sumergir los preparados histológicos en xilol para eliminar los excesos de parafina. El xilol
es un alcohol tóxico pero existen reactivos (como el Hemo-D) que ejercen la misma
función aclarante de parafina sin la toxicidad del xilol.
 Luego pasan por una serie de alcoholes en concentración decreciente para rehidratar la
muestra (100°, 95° y 70°).
 Se lava en agua para eliminar exceso de alcohol
 Se sumerge en hematoxilina por 10 minutos, luego se lava en agua para eliminar excesos
y se pasa rápidamente por alcohol ácido.
 Se lava nuevamente
 Se sumerge 30 segundos en eosina.
 Se pasa por otra serie de alcoholes, esta vez en orden creciente (70°, 95° y 100°) para
deshidratar la muestra y que se pueda realizar el montaje con un pegamento no soluble
en agua.
 Finalmente se deja remojar 10 minutos en xilol, antes de realizar el montaje final.

Batería usada durante la tinciónhematoxilina-eosina.

Resultados[editar]
 Núcleo celular: Violeta
 Citoplasma: Rosa
 Musculatura: Rojo , rosa o fucsia
 Glóbulos rojos: Rojo, anaranjado
 Fibrina: Rosa
INMUNOHISTOQUIMICA

Corresponde a un grupo de técnicas de inmunotinción que permiten demostrar

una variedad de antígenos presentes en las células o tejidos utilizando
anticuerpos marcados. Estas técnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos
de unirse específicamente a los correspondientes antígenos. Esta reacción es
visible sólo si el anticuerpo está marcado con una sustancia que absorbe o emite
luz o produce coloración.

En las técnicas de inmunofluorescencia se utilizan como marcadores compuestos

de fluoresceína que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible,
que depende de la naturaleza del compuesto. El isotiocianato de fluoresceína
emite luz verde amarillenta intensa. Estas técnicas necesitan muestras en fresco y
congeladas, sin fijación convencional, pues los antígenos están presentes en
superficies celulares o son muy lábiles a la fijación en formalina. La
inmunofluorescencia directa, es decir con anticuerpos conjugados con
fluoresceína, se aplica corrientemente en el diagnóstico de las enfermedades
cutáneas en donde tiene indicación y utilidad muy precisas como en
enfermedades ampollares, vasculitis y mesenquimopatías . Esta técnica pese a ser
muy sensible, presenta inconvenientes como la falta de permanencia de la
fluorescencia, requiere de microscopía especializada y el detalle morfológico es
pobre. Para documentar cada caso, es necesario fotografiar la reacción.

En las técnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas

capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas
más frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos
diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de
tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamene
al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos
(secundarios) o sustancias como biotina o proteína A.

El espectro de anticuerpos disponibles comercialmente crece día a día y

actualmente es posible encontrar marcadores para una amplia gama de antígenos
(Tabla).

EJEMPLOS DE MARCADORES INMUNOHISTOQUIMICOS

Anticuerpo Células/antígenos detectados

CD1a célula de Langerhans
CD4 linfocito T de auxilio
 CD8 linfocito T citotóxico
CD30 célula de Reed-Sternberg
CD45 leucocitos
CD68 macrófagos
S100 células de Schwann
HMB-45 melanocitos
AE1 citoqueratinas de bajo peso molecular
AE3 citoqueratinas de alto peso molecular
DESMINA células musculares
GFAP glía
CEA antígeno carcino-embrionario
AFP alfa-fetoproteína
REN receptores nucleares de estrógenos
VIM sarcomas

Las técnicas inmunohistoquímicas enzimáticas permite una localización más

precisa de las reacciones, ya que la tinción es permanente, estable, puede
contrastarse y puede ser evaluada con microscopio de luz. El material así
estudiado puede archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción.
Los anticuerpos monoclonales ha permitido aumentar la especificidad,
sensibilidad y gama de esta técnica. Desventajas existen: presencia de reacción
inespecífica, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales, algunos
reactivos son potencialmente carcinógenos y su manipulación debe ser
cuidadosa, requieren estandarización precisa y estricto control de calidad. Existen
diversos tipos de técnicas, cuya indicación dependerá del anticuerpo a utilizar
(monoclonal o policlonal), material disponible (fresco, congelado o fijado en
formalina) y antígenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmáticos o
nucleares).

Estas técnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y

negativos. El control negativo se obtiene realizando la misma técnica, pero con
omisión del paso de incubación con anticuerpo primario. Existen sistemas
automatizados que permiten la tinción de un gran número de casos
simultáneamente con la ventaja de pasos definidos y estandarización de las
variable usuales con costo relativamente bajo y en mucho menor tiempo.
La inmunohistoquímica tiene utilidad diagnóstica en identificación de
diferenciación y de marcadores pronósticos de neoplasias (marcadores
tumorales). Por ejemplo, es posible la identificación de los productos de
oncogenes y de genes supresores de tumores con anticuerpos monoclonales,
especialmente contra c-erbB-2, bcl-2, p21, Rb1 y p53; la identificación de
marcadores de diferenciación como HMB-45 para melanocitos (melanoma), AE1
para carcinomas, vimentina para sarcomas y CD45 para leuocitos (linfomas).

Un elemento importante a considerar es la óptima preservación del tejido y por

ende de los antígenos. La mayoría de los antígenos se conservan adecuadamente
después de la fijación en formalina e inclusión en parafina. Algunos son más
lábiles y sólo se detectan en cortes de congelación.

Uno de los problemas actuales con estas técnicas no es la técnica en sí, manual o
automatizada, o la posibilidad de acceder a los numerosos anticuerpos existentes,
sino la interpretación de los resultados. Los errores de interpretación disminuyen
a nivel aceptable cuando el patólogo y sus colaboradores tiene experiencia en
estas técnicas y los resultados se analizan a la luz de los demás hallazgos clínico-
patológicos.

Biología molecular aplicada a histopatología

Este conjunto de técnicas, que han sido tomadas tanto de la genética molecular
como de la bioquímica, nos permite analizar fenómenos biológicos y patológicos
en el nivel molecular. Al igual que la microscopía electrónica y la
inmunohistoquímica, estas técnicas pueden aplicarse para refinar el diagnóstico
en Anatomía Patológica.

Pueden enumerarse las siguientes técnicas: hibridación in situ, reacción en

cadena de polimerasa (PCR), in situ-PCR , análisis de polimorfismo de
fragmentos de restricción, Southern blot, Western blot y Northern blot. Todas las
técnicas mencionadas pueden aplicarse al material obtenido por biopsia, autopsia
e incluso muestras citológicas.

La técnica de Southern blot permite el análisis de ADN genómico o fragmentos

definidos de ADN después de digestión con endonucleasas de restricción. La
técnica de Northern blot permite estudiar ARN en forma análoga. El Western
blot es una técnica inmunológica derivada , que se utiliza para analizar antígenos
proteicos. Las proteínas se separan mediante electroforesis y se transfieren a una
membrana sólida o membrana o filtro. La membrana se incuba con anticuerpos,
los que se detectan ulteriormente con sondas marcadas radioactivamente o con
enzimas.

INSITU

Hibridación in situ es una técnica que detecta secuencias de ácidos nucleicos en células,
cromosomas o tejidos preservados. La detección in situ provee una visualización directa de la
localización espacial de secuencias específicas que es crucial para dilucidar la organización y
función génica, por lo que el método de hibridación in situ se ha convertido en una técnica
importante en diversos campos, incluyendo diagnóstico de rearreglos cromosomales, detección de
infecciones virales y análisis de la función génica durante el desarrollo embrionario. La hibridación
in situ toma como fundamento la complementaridad de los ácidos nucléicos, la cual puede ser
DNA y/o RNA, a través de puentes de hidrógeno formados entre las bases: adenina–timina (DNA)
o uracilo (RNA) y citosina-guanina (DNA y RNA). Este apareamiento da lugar a una doble cadena en
la cual una cadena, tiene la orientación opuesta a la otra con respecto al esqueleto azúcar-fosfato.
La secuencia es leída de 5' a 3'. Secuencia DNA RNA 5'… TGATCCGTTA…3' 5'…UGAUCCGUUA…3'
3'… ACTAGGCAAT…5' Transcripción

III. Pasos y consideraciones para la hibridación in situ. La técnica involucra: a) Generación de

ácidos nucleicos marcados para una detección subsecuente. b) Fijación de tejidos (seccionados),
preparación de cromosomas. c) Preparación del tejido para incrementar el acceso del ácido
nucleico marcado. d) Hibridación de la sonda marcada en cromosomas o tejidos. e) Lavados
selectivos que remuevan las sondas que no hibridan

RETARDAMIENTOS

1. retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) Se centra en el estudio de la

regulación genética y en la determinación de la interacción DNA/RNA-proteína.La
técnica se basa en la observación de que los complejosDNA/RNA-proteína migran
mas lentamente que las moléculas deDNA libre cuando se somete a electroforesis en
gel de agarosa ode poliacrilamida no desnaturalizante.• Michael Fried and Donald M.
Crothers. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by
polyacrylamide gel electrophoresis Nucl. Acids Res. (1981) 9 (23): 6505-6525. doi:
10.1093/nar/9.23.6505• Garner MM, Revzin A. A gel electrophoresis method for
quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components
of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 1981 Jul
10;9(13):3047-60.
2. 4. Marcadores del DNA• Radioisótopos Autoradriografía• Fluorocromos fluorescencia•
Biotina quimioluminiscencia32P fosfato. Barato, sensibilidad (≤10 -18 moles), y no
introduce estructuras artificiales. DNA/RNA 32P
3. 5. Competidores no específicos• Acido nucleico no marcado usado como agente
bloqueador en la reacción de unión para minimizar la unión de proteínas no
especificas a el DNA marcado.• Mas usados poly(dl.dC)• DNA de esperma de salmón
sonicado
4. 6. Competidores específicos• Importante control usado para verificar la especificidad
de una banda resultante de la unión de proteínas a la sonda marcada.• Secuencia
 idéntica a la sonda marcada ó• Contiene secuencias de uniones conocidas a la
proteína blanco.• 200 moles de exceso son suficientes para competir
5. 7. Utilidad EMSA Caracterizar los mecanismos de regulación transcripcional de varios
genes. Caracterizar eventos transcripcionales conocidos para determinar el efecto de
diversos estímulos u otras proteínas que se requieren para llevar a cabo la
interacción Identificar la unión proteínas implicadas en procesos de replicación,
recombinación y reparación.o No puede identificar si son varias proteínas las que se
unen al RNA/DNAo No puede saberse con exactitud que proteína se une al DNA/RNA
6. 8. Super Retardamiento• El ensayo EMSA es lo suficientemente sensible como para
añadir un anticuerpo específico que causa un “super-retardamiento” al unirse a la
proteína que esta unida al DNA/RNA.• La movilidad de el complejo; anticuerpo-
proteína-RNA/DNA es mucho menor a la de la proteína-RNA/DNA que sirve como
control, y a la del DNA/RNA libre.
7. 9. Utilidad Identificar particularmente la proteína que se esta uniendo al complejo
DNA/RNA.o Reconocer complejos de proteínas que se unen al DNA/RNAo Conocer el
peso molecular de las proteínas o de los complejos proteína/DNA-RNA
8. 10. Entrecruzamiento (Crosslinking)• Técnica para detectar el peso molecular del
complejo RNA/DNA-proteína.Cuando se forma el complejo y se irradia con luzUV,
ocasiona la formación de enlaces covalentes entre pirimidinas y ciertos residuos de a.a
que están cercanos al DNA.
9. 11. SDS page• Por el SDS (sodium dodecyl sulfate) page, desnaturaliza y da carga
negativa a las proteínas revelando el peso molecular del complejo formado.
10. 12. Pasos1. Contacto proteína recombinante o pull de proteínas con DNA/RNA2. Laser
UV3. Poner complejo en contacto con SDS4. Correr electroforesis
11. 13. Utilidad Determinar el peso molecular de complejo formado Medir la afinidad de
DNA-proteína por constantes de unión Cuantificar la cantidad de DNA que se une a
proteínas especificas Revelar complejos heteroméricos y cofactores envueltos en la
unión.

Explantes
(Biotecnología Vegetal). Tejido vivo separado de su órgano propio y transferido
a un medio artificial de crecimiento. El nombre “explante” es una versión
castellanizada del vocablo inglés “explant”; acuñado especialmente para identificar
a los tejidos vegetales cultivados in vitro y sin otro significado. La selección del
explante es un aspecto clave para tener éxito en el Cultivo de Tejidos, ya que
dependiendo de su ubicación en la planta, del tipo de tejido que contiene, de su
edad cronológica y fisiológica, de su contenido endógeno de hormonas, entre
otros, se comportará de una manera o de otra.

Naturaleza de los explantes

Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células
sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas. Con excepción de los
óvulos y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células
somáticas. El tipo de explante a usarse en los procesos
de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los
objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas
axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para
reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales
que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias
son más bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad
en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con
una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya
que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de
cultivo.

Elección del Explante en el Cultivo de Tejidos

Vegetales
Para la elección del explante apropiado se debe tener en cuenta los siguientes
aspectos:

Objetivo del cultivo

Pueden ser aplicaciones para: Estudios básicos. En este caso, los explantes
cultivados pueden ser diversos. Si lo único que se quiere lograr es un sistema de
callos para estudiar algún proceso fisiológico, se puede cultivar cualquier órgano,
tejido o célula viva. En este caso –en que lo único que se busca es la inducción de
callos– lo ideal es cultivar explantes jóvenes, derivados de semillas en
germinación, donde se obtienen respuestas rápidas y, en general, hay menores
problemas de contaminación con microorganismos. Obtención de plantas con
sanidad controlada. Es muy común la utilización del cultivo de tejidos para la
obtención de plantas libres de virus. El explante ideal para ello es el meristema
(dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de
un par de primordios foliares. Micropropagación. En este caso dependerá del
sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotación de
meristemas, los ápices terminales y los segmentos uninodales de ramas jóvenes
constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe
conocer perfectamente la biología de la reproducción de la planta para aprovechar
aquellos explantes que en forma natural son propágulos. En cambio, si se
pretende micropropagar mediante el empleo de semillas sintética el explante
original deberá posibilitar la inducciónde la embriogénesis somática. En este caso,
la utilización de embriones zigóticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes
como explantes. Obtención de híbridos interespecíficos. Una de las primeras
aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituyó su empleo como
ayuda para la obtención de híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos,
donde se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante
cultivado es el embrión cigótico en estadios tempranos de su desarrollo. Con la
misma finalidad también se utilizan ovarios u óvulos fecundados. Obtención de
plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta finalidad los explantes
pueden ser semillas (por ej. orquídeas) o bien, se aíslan los embriones en un
estado temprano de desarrollo («corazón») como en el caso de yerba mate o de
algunas variedades de duraznero. Obtención de plantas haploides:En este caso,
los explantes más utilizados son las anteras, aunque también pueden emplearse
microsporas aisladas, óvulos y ovarios no fertilizados. Inducción de variación
somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la finalidad
de su utilización es la aplicación en planes de mejoramiento genético de plantas,
los explantes utilizados deben posibilitar la regeneración de plantas enteras.
Producción y/o conversión de sustancias útiles. Se puede utilizar una gran
variedad de explantes. Los de raíces suelen ser muy utilizados. Obtención de
híbridos somáticos. Para esta finalidad se recurre a la fusión de protoplastos. En la
mayoría de los casos se aíslan los protoplastos de mesófilos de hojas y de
suspensiones celulares. Conservación e intercambio de germoplasma. Los
meristemos son los explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de
conservación a mediano y largo plazo (crioconservación con nitrógeno líquido) y
para el intercambio de material genético. Establecimiento de suspensiones
celulares. En este caso se recomienda iniciar los cultivos a partir de explantes
extraídos de semillas en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledones, raíces).

Posibilidad de contaminación con microorganismos

De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen en
condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de
contaminación. Por otra parte, es recomendable evitar el uso de «explantes
sucios» (raíces, rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el
campo, dado que en la mayoría de los casos no es posible conseguir una buena
desinfección de los mismos.

Edad fisiológica
Este es un aspecto de gran influencia en la morfogénesis. Como regla general se
puede decir que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a
cultivar, mejor será su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y
axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la
micropropagación de plantas leñosas, la edad del explante es un factor crítico. Si
los tejidos son jóvenes, la micropropagación tiene mayores posibilidades de ser
exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar
tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes.

Tamaño
En general, cuanto más grande sea el explante mayores serán las posibilidades
de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin
embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de
que los cultivos se contaminen con microorganismos. También es necesario tener
en cuenta que existe un tamaño mínimo del explante, que depende de la especie y
del material vegetal, por debajo del cual no es fácil lograr el establecimiento de los
cultivos. Los explantes muy pequeños suelen requerir del empleo de medios más
complejos o de los denominados medios acondicionados.
Época del año
Es un factor que suelen tener mucha importancia en la micropropagación y que
generalmente está asociado al grado de dormición que presentan ciertos
explantes (yemas, por ejemplo) y también con la posibilidad de mayor o menor
proliferación de microorganismos.

CULTIVOS CELULARES
Los cultivos de células in vitro consisten en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un
tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición química definida y en condiciones
de temperatura, pH, aireación y humedad controladas. De esta forma se aseguran su supervivencia y
multiplicación, manteniendo todas sus funciones metabólicas de una manera semejante a las que tenían en el
huésped.

El cultivo celular tuvo su origen en el siglo XIX, como un método para el estudio del comportamiento de las
células animales libres de las variaciones sistémicas ocurridas dentro del organismo y bajo el estrés de un
experimento. En la actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio células procedentes de una amplia gama de
tejidos y organismos diferentes.

Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido original recién extraído, recibe el
nombre de Cultivo Primario. Cuando este cultivo primario es sometido a procesos de transformación que le
confieren capacidad ilimitada de multiplicación, recibe el nombre de Línea Celular.
Los cultivos de células animales también se pueden clasificar de acuerdo a su capacidad de adherencia o no
a una superficie determinada, pudiendo crecer en forma de monocapa o en suspensión.
El silenciamiento génico es un proceso llevado a cabo en los organismos eucariotes, con
diferentes objetivos, dentro de los cuales se destacan la regulación de la expresión y la
eliminación y el control de material genético ajeno o externo (virus y transposones) que podría
causar un daño a la célula. Existe una clasificación que establece dos grandes categorías, el
Silenciamiento Génico Post-Transcripcional (PTGS) y el Silenciamiento Génico
Transcripcional (TGS), los cuales se encuentran en todos los eucariotes, con ciertas
variaciones. El PTGS es un mecanismo que actúa directamente sobre el transcrito de ARN
mensajero, mientras que el TGS actúa indirectamente y va a establecer un control que impide
la transcripción del ADN.1

Se han reconocido diferentes moléculas y sistemas de estas que se encargan de silenciar la

expresión y se encuentran especialmente en el PTGS. Dentro de estas moléculas se
encuentran proteínas “Dicers”, argonautas, con actividad RNAsa, miRNA (micro ARN de
interferencia), siRNA (ARN pequeño de interferencia) con variaciones como nat-siRNA
(inducido durante situaciones de estrés) y ra-siRNA para la transcripción de secuencias
repetidas. Adicionalmente se encuentran complejos que se acoplan con estos elementos
como los RISC (Complejo de Silenciamiento inducido por ARN) que actúa a nivel
citoplasmático acoplando siRNA producido, y el sistema RIST (Complejo de Silenciamiento
Transcripcional Inducido por ARN) cuya actividad se localiza en el núcleo celular.1

Además de estas formas, se han encontrado otros niveles transcripcionales de regulación que
no actúan sobre el ARNm, sino que modifican el ADN a través de procesos de metilación que
van a modificar la cromatina, estableciendo dominios de silenciamiento a los cuales se
enlazan proteínas SIR que evitan la transcripción. En las histonas del ADN también se han
detectado modificaciones como poliadenilación, y deacetilación, cuyo efecto será impedir la
unión del ADN con proteínas enlazantes.2

El silenciamiento, no es un proceso localizado, pues a través de uniones celulares como los

plasmodesmos vegetales, hay un flujo de los elementos ya mencionados, de modo que se
ejerce un efecto sistematizado. Una vez iniciado este proceso, se mantiene el silenciamiento,
y un mecanismo para ello es sintetizar secundariamente siRNA a través de ARN polimerasas
ARN dependientes (ARNdARNp). De esta forma los cambios muchas veces se prolongan por
un tiempo, y en algunos casos, como la modificación de la heterocromatina, son heredados.1