ICIDCA.

Sobre los Derivados de la Caña

de Azúcar
ISSN: 0138-6204
revista@icidca.edu.cu
Instituto Cubano de Investigaciones de
los Derivados de la Caña de Azúcar
Cuba

Rizo-Porro, Mariela; González-Fernández, Nemecio; Pérez-Martínez, Amaury; Beltrán

Ramos-Sánchez, Luis
Diseño de un medio de cultivo con base en sacarosa para la producción de un probiótico
para camarones
ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. 49, núm. 2, mayo-agosto, 2015,
pp. 8-16
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar
Ciudad de La Habana, Cuba

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223143421002

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 Diseño de un medio de cultivo
con base en sacarosa para la producción
de un probiótico para camarones
Mariela Rizo-Porro1, Nemecio González-Fernández2, Amaury Pérez-Martínez1,
Luis Beltrán Ramos-Sánchez11
1. Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Camagüey "Ignacio Agramonte Loynaz", Carretera
Circunvalación Norte, km 5½, Camagüey, Cuba
mariela.rizo@reduc.edu.cu
2. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de Camagüey, Carretera Circunvalación Norte y Ave. Finlay.
Camagüey, Cuba
RESUMEN
En el presente trabajo se informa acerca del desarrollo
de un medio de cultivo industrial para la producción de
un probiótico utilizado en el control de enfermedades en
la camaronicultura. El proceso se desarrolla en tres
etapas: la identificación de los nutrientes más impor-
tantes, la determinación de la influencia de sales y vita-
minas en el crecimiento y la optimización de las con-
centraciones de los componentes del medio. Se obtuvo
un medio compuesto por sacarosa y extracto de levadu-
ra que resulta más eficiente desde el punto de vista de
la productividad y costo unitario que el resto de las
fuentes de nutrientes estudiadas. La adición de sales y
vitaminas no aporta incrementos significativos en el
crecimiento. La optimización de la concentración de los
componentes del medio aporta como resultado 4,01 g/L
de extracto de levadura y 7,49 g/L de sacarosa con los
que se obtienen 14,4 g/L de células probióticas secas en
frascos de cultivo.
PALABRAS CLAVE: Bacillus licheniformis, crecimiento
microbiano, medio de cultivo, optimización, sacarosa.
INTRODUCCIÓN
Los informes sobre medios de cultivo son tan
diversos como microorganismos de uso industrial
existen, cada uno con requerimientos nutriciona-
les diferentes. En dependencia del propósito para
el que se cultiven las poblaciones microbianas, así
serán los requerimientos nutricionales mínimos
en el medio. Sin embargo, los azúcares, tanto en
forma de monosacáridos, como disacáridos y poli-
8 ICIDCA sobre los derivados de la caña de azúcar 49 (2) mayo - agosto, 2015
ABSTRACT
The present paper informs about the development of a
means of industrial cultivation for the production of a
probiotic used in the control of diseases in shrimp cul-
ture. It was developed in three stages: the identifica-
tion of the most important nutrients, the determination
of the influence of salts and vitamins on growth and
optimization of the concentrations of components of the
culture medium. A medium composed by sucrose and
yeast extract resulted to be the best from the point of
view of productivity and unit cost in comparison with
the rest of the studied nutrient. The addition of salts
and vitamins did not produce a significant growth
increase. The optimization of the component concentra-
tion showed an optimum of 4.01 g/L of yeast extract and
7.49 g/L of sucrose resulting in a probiotic biomass con-
centration in cultivation flasks of 14,4 g/L of dry cells.
KEYWORDS: Bacillus licheniformis, growth medium,
microbial growth, optimization, sucrose.
sacáridos, constituyen la fuente de carbono ideal
para la producción industrial de microorganismos
debido a su bajo costo (1).
En todo proceso microbiano para la fabricación
de un producto se requiere minimizar recursos,
para obtenerlo al menor costo posible. Si se cono-
ce que el costo de las materias primas representa
más del 50 % del total de un proceso productivo (2,
3), entonces resulta de vital importancia la opti-
mización de sus principales componentes como
paso previo para lograr que el diseño de un proce-
so sea óptimo y operable, teniendo en cuenta sus
restricciones prácticas (4-6).
Los antecedentes de este trabajo tienen lugar
en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología
de Camagüey donde se realiza el aislamiento de
cepas con antagonismo a patógenos del camarón.
La cepa aislada C-232, identificada como Bacillus
licheniformis, fue capaz de inhibir el crecimiento
del Vibrio harveyi, patógeno por el cual se informan
el mayor número de pérdidas en la cría intensiva
de larvas de camarones Penaeus (7).
Para el cultivo de B. licheniformis se informa
una gran variedad de medios sintéticos pero en la
gran mayoría se propone el uso de la glucosa como
principal fuente de carbono. Este es el caso de la
producción de amilasas en la que se utiliza con-
juntamente con el almidón (8) y en la obtención de
proteasas alcalinas en el que se incorpora el ácido
cítrico, la harina de soya y desechos agroindus-
triales (9-11).
También se conoce que la fuente de carbono
en que se cultiva este microorganismo determina
la formación de ciertos metabolitos como polisa-
cáridos que se producen en presencia de sacaro-
sa (12-14), α-amilasas en almidón (8), ácido γ -
poliglutámico ( γ-PGA) a partir de glicerol con
ácido cítrico y ácido L-glutámico como precurso-
res (15) y ácido láctico a partir de glucosa y celo-
biosa (16).
Todos estos productos, derivados de una posi-
ble situación de estrés en el crecimiento celular,
afectan el rendimiento biomasa/sustrato por lo
que debe evitarse su formación cuando lo que se
desea es potenciar la producción de biomasa.
Sin embargo la mayoría de los informes sobre
el cultivo de B. licheniformis encontrados en la
literatura van dirigidos a la obtención de metabo-
litos secundarios, y no se informan medios especí-
ficos para la producción de biomasa del microor-
ganismo. Solamente un trabajo (17) informa acer-
ca de un medio sintético para producir biomasa de
B. licheniformis.
Un análisis a priori revela que el costo de estos
medios es alto, debido a la utilización de varios
componentes de síntesis.
Todos estos elementos sugieren que los medios
reportados en la literatura no son efectivos para
la producción de biomasa viable de B. lichenifor-
mis, C-232 debido a que no fueron diseñados con
este objetivo. Es por ello que resulta necesario
diseñar un medio de cultivo que proporcione los
mejores crecimientos de la cepa a costos competi-
tivos para su uso como probiótico en la camaroni-
cultura cubana como alternativa al uso profilácti-
co de antibióticos en el control de enfermedades
(18-20).
ICIDCA sobre los derivados de la caña de azúcar 49 (2) mayo - agosto, 2015
MATERIALES Y MÉTODOS
Estrategia general para el diseño del medio
Se partió de la determinación estadística de la
fuente de carbono y de nitrógeno que proporcionan
la mayor productividad a un menor costo por can-
tidad de biomasa obtenida mediante un diseño de
selección. Luego se realizó un diseño exploratorio
para determinar, empleando técnicas de trata-
miento estadístico, las necesidades de macro y
micronutrientes. Por último, para la optimización
de los principales componentes del medio se utili-
zó un diseño de mezcla Simplex Lattice.
Determinación de la fuente de carbono y de nitró-
geno más efectiva en el medio
Diseño del experimento
Para la determinación de la fuente de carbono
y de nitrógeno a emplear en el medio se seleccio-
naron seis fuentes de carbono (sacarosa, glucosa,
glicerol, sorbitol, lactosa y ácido cítrico) y se com-
binaron con seis fuentes de nitrógeno (extracto de
levadura, cloruro de amonio, sulfato de amonio, L-
glicina, glutamato de sodio y urea). Para la combi-
nación de utilizó un diseño de selección mediante
el empleo del programa StatGraphics Centurion
XVI para obtener 36 medios a estudiar (21).
Se utilizó como control un medio compuesto
por 0,9 g/L de sacarosa y 0,25 g/L de extracto de
levadura sin sales, empleado en estudios prelimi-
nares realizados con esta cepa (7).
Determinación de las concentraciones de carbono,
nitrógeno y sales a utilizar
Los medios en estudio se prepararon sobre la
base de evitar la limitación por oxígeno en frascos
de cultivo considerando que, según Meers y
Persen (22), son necesarios 250 mmol de O2/L-h
para mantener un pleno crecimiento aerobio de B.
licheniformis y obtener 2 g/L de biomasa seca con-
siderando un 40 % de rendimiento biomasa/sus-
trato y que el coeficiente de transferencia de oxí-
geno para un erlenmeyer de 50 mL de volumen
con 15 mL de medio es de 24,5 mmol/L-h (23).
En la preparación de los medios se garantizó
un aporte de 0,48 g/L de carbono y 0,032 g/L de
nitrógeno según la relación C:N de 13:1 del llama-
do medio E (24) y una concentración de sales igual
a 0,5 g/L de MgSO4.7H2O;, 0,15 g/L de
CaCl2.2H2O y 0,04 g/L de FeCl3.6H2O; semejante
a la utilizada en este propio medio para la obten-
ción de ácido γ-poliglutámico (15, 25).
9
Condiciones de cultivo
El crecimiento se realizó por triplicado a 37 ºC de
temperatura, pH 6,5 y una agitación de 250 min-1.
La propagación del inóculo se llevó a cabo en pla-
cas con el medio microbiológico agar triptona
soya, seguido de una propagación de 15 h a 37 ºC
y 250 min-1 en frascos de cultivo de 100 mL de
volumen total con 30 mL de caldo nutriente. El
inóculo fue centrifugado y la biomasa resuspen-
dida en igual volumen de agua estéril. A cada
erlenmeyer de 50 mL que contenía 15 mL de
medio se le adicionó un volumen de inóculo sufi-
ciente para garantizar una concentración de bio-
masa al inicio de 0,006 g/L en base seca.
Métodos analíticos y matemáticos empleados
El crecimiento de la biomasa se verificó por
espectrofotometría a 530 nm en un espectrofotó-
metro UV-Vis (Pharmacia-Biotech) cada una hora
hasta las seis horas y una última muestra al final
del crecimiento a las 22 horas.
En los medios con sorbitol, lactosa y ácido cítrico
se observó, de froma experimental, una precipita-
ción al ser formulados en condiciones estériles, pre-
sumiblemente a causa del pH, al no ser posible ajus-
tarlo correctamente bajo estas condiciones, por lo
que en el experimento sólo se considera la sacarosa,
la glucosa y el glicerol como fuentes de carbono.
La determinación de la concentración de bioma-
sa seca (X) se realizó mediante la correlación con el
valor medido de la densidad óptica (DO), emplean-
do una ecuación encontrada a partir de datos de
pesos de biomasa húmeda y seca obtenidos de expe-
rimentos preliminares realizados. De estos experi-
mentos se conoció que como promedio, cada g/L de
DO equivale a 2,533 g/L de biomasa húmeda como
cada g/L de biomasa seca se corresponde con 8,115
g/L de biomasa húmeda. Según esto, la ecuación
que correlaciona la concentración de biomasa seca
con el valor de la densidad óptica medida es:
(ec. 1)
Parámetros dinámicos como criterio de efectividad
en la selección de medios
La data de crecimiento celular fue ajustada con
una ecuación logística (ec. 2) mediante el progra-
ma ModelMaker v4.0 (26) lo que permitió obtener
parámetros dinámicos asociados a la velocidad
específica de crecimiento y a la densidad celular
máximas. Esto no significa que estas sean cons-
tantes cinéticas reales porque este modelo solo es
válido para casos en los que la velocidad específica
de crecimiento no depende de la concentración ini-
cial de sustrato. Sin embargo, como parámetros
empíricos, pueden ser interpretados como una
10 ICIDCA sobre los derivados de la caña de azúcar 49 (2) mayo - agosto, 2015
aproximación de la velocidad de crecimiento en la
fase exponencial y de la máxima densidad celular
alcanzada en cada uno de los medios estudiados.
Estos parámetros ajustados sólo fueron útiles a los
efectos de comparar los medios y no para ser
extrapolados en lo adelante.
(ec. 2)
Los valores de máxima densidad celular
(Xmáx) y de la velocidad de crecimiento máxima
(mmáx) permitieron obtener la productividad
máxima, el tiempo en que se alcanza y el costo de
medio por kilogramo de biomasa para cada medio,
utilizando el programa de cálculo Matlab (27).
Todos estos resultados se muestran en la tabla 1.
Análisis estadístico
Mediante el paquete estadístico StatGraphics
Centurion XVI (21), se realizó un análisis de
varianza simple y una prueba de rangos múltiples
para determinar cuáles medias son significativa-
mente diferentes de otras con un nivel de confian-
za del 95 % e identificar los grupos homogéneos de
forma tal que fuera posible tomar decisiones sobre
el medio más adecuado para el crecimiento del
microorganismo, si se conoce que no existen dife-
rencias estadísticamente significativas entre
aquellos niveles que comparten una misma colum-
na. El método empleado para discriminar entre las
medias fue el procedimiento de diferencia mínima
significativa (LSD) de Fisher. Los resultados se
muestran en las tablas 2 y 3.
Determinación de la influencia de macro y micro
nutrientes en el crecimiento
Diseño del experimento
Para la realización de este experimento se
empleó un medio compuesto por 0,9 g/L de saca-
rosa y 0,25 g/L de extracto de levadura suplemen-
tado con 10 sales solubles de diferentes metales
en una concentración de 0,5 mmol/L. Se preparó
una corrida experimental adicional en la que no
se aportó ninguna sal y otra en la que se suple-
mentó el medio con una combinación de todas
ellas. Las sales a estudiar fueron: CoCl2.6H2O,
ZnSO4 7H2O, NiSO4 6H2O, KCl, CaCl2 2H2O,
FeCl3 6H2O, NaCl, MnCl2 4H2O, CuSO4 y MgSO4
7H2O.
Con la ayuda del programa estadístico
StatGraphics Centurion XVI (21) se realizó un
diseño exploratorio que arrojó 12 experiencias. La
variable respuesta medida fue la velocidad de cre-
cimiento máxima.
 T abla 1. Valores promedios de crecimiento máximo (Xmáx), velocidad de crecimiento máxima
(µmáx), productividad máxima (Prodmáx), tiempo en que esta se alcanza (tmáx), relación entre la
cantidad de biomasa seca obtenida y la cantidad de la fuente de carbono aportada para cada medio y
costo por kilogramo de biomasa obtenida (Costo) para los medios considerados

X máx µm á x Pro dmáx Relac ión tmáx Cos to

M edios
kg /L h -11 kg /L h kg BS /k g FC h $/k g
Sacarosa-extracto de levadura 174,00 1,049 14,00 0,152 4,761 46,00
Sacarosa-L-glicina 69,00 0,149 2,33 0,061 14,286 108,67
Sacarosa-glutam ato de sodio 189,00 0,235 9,00 0,166 17,909 58,33
Glucosa- extracto de levadura 270,00 1,356 15,00 0,216 4,165 60,33
Glucosa-L-glicina 52,00 0,751 3,00 0,039 3,883 190,33
Glucosa-urea 110,00 0,452 3,67 0,084 8,414 90,00
Glicerol- extracto de levadura 552,00 0,936 25,33 0,449 6,642 21736,70
Glicerol-cloruro de amonio 90,00 0,641 4,00 0,079 6,064 136909,00
Glicerol- glutamato de sodio 277,00 1,199 24,00 0,225 4,610 15363,00
Glicerol-urea 332,00 0,410 10,33 0,270 12,213 37499,30

T abla 2. Resultado de la prueba de rangos múltiples T abla 3. Resultado de la prueba de rangos

para los valores de la productividad máxima m últiples para los valores del costo por
(Prodmáx) kilogramo de biomasa seca obtenida
Me dios de cu ltiv o M ed ia G r upos M edios de
Cas o s M ed ia G r upos
es tudiados kg /L h h omo gén eos cu ltivo Caso s
Sacarosa-L-glicina 3 2,33 X $/ kg h omo gén eos
es tudiado s
Glucosa-L-glicina 3 3,00 X Sacarosa- 3 46,00 X
Glucosa-urea 3 3,67 X extracto de
Glicerol-cloruro de levadura
3 4,00 X
amonio Sacarosa- 3 58,33 X
Sacarosa- glutamato de
3 9,00 X
glutamato de sodio sodio
Glicerol-urea 3 10,33 X Glucosa- 3 60,33 X
Sacarosa-extracto extracto de
3 14,00 X
de levadura levadura
Glucosa-extracto Glucosa-urea 3 90,00 X
3 15,00 X
de levadura Sacarosa-L- 3 108,67 X
Glicerol-glutamato glicina
3 24,00 X
de sodio Glucosa-L- 3 190,33 X
Glicerol-extracto de glicina
3 25,33 X
levadura Glicerol- 3 15363,00 X
glutamato de
sodio
Condiciones de cultivo
La propagación del inóculo y el crecimiento se Glicerol- 3 21736,70 X
realizaron igual que para la determinación de la extracto de
fuente de carbono y de nitrógeno. levadura
Glicerol-urea 3 37499,30 X
Método analítico empleado Glicerol- 3 136909,00 X
El crecimiento de la biomasa se verificó por cloruro de
espectrofotometría en iguales condiciones y con la amonio
misma frecuencia que en la experiencia anterior.

ICIDCA sobre los derivados de la caña de azúcar 49 (2) mayo - agosto, 2015 11
 T abla 4. Resultado de la prueba de rangos múltiples para los valores de la
velocidad de crecimiento máxima por medio suplementado con diferentes sales

M edia G ru pos
M ed ios de cu ltiv o es tu diados Caso s
h -11 h omog én eos
Sacarosa-extracto de levadura-CoCl2.6H 2O 3 0,5033 X
Sacarosa-extracto de levadura-ZnSO 4 .7H2 O 3 0,7575 X
Sacarosa-extracto de levadura-NiSO 4.6H2O 3 0,8164 XX
Sacarosa-extracto de levadura-KCl 3 0,9169 XX
Sacarosa-extracto de levadura-CaCl2 .4H2 O 3 0,9314 XX
Sacarosa-extracto de levadura-CuSO 4 3 0,9556 XX
Sacarosa-extracto de levadura-todas 3 0,9813 X
Sacarosa-extracto de levadura-FeCl3.6H2O 3 0,9817 X
Sacarosa-extracto de levadura-NaCl 3 0,9929 X
Sacarosa-extracto de levadura-MnCl2.4H 2O 3 1,0195 X
Sacarosa-extracto de levadura-MgSO4 .7H2 O 3 1,2830 X
Sacarosa-extracto de levadura-sin sales 3 1,9964 X

T abla 5. Diseño experim ental simplex lattice y levadura, buscando modificar la relación C/N de
valores de las variables respuesta manera que se incrementara la productividad de
biomasa del cultivo.
Ex trac to de S ac aros a Pr odmáx Co sto Con vistas a aumentar la sensibilidad de la pro-
Cor rida ductividad del sistema a los cambios que se intro-
lev adur a g /L g/ L g /L h $/g
duzcan, se realizó el experimento con una concen-
1 0,00 11,50 0,012 0,10
tración total de nutrientes diez veces superior a la
2 11,50 0,00 0,273 0,14 que había sido usada hasta el momento, es decir, se
3 11,50 0,00 0,275 0,14 trabajó con una concentración total de nutrientes
4 7,65 3,83 0,330 0,08 de 11,5 g/L. De esta manera, la selección de los
5 5,75 5,75 0,333 0,06 niveles de sacarosa y de extracto de levadura se
6 2,88 8,63 0,270 0,04 hizo siempre con la restricción de que la suma de la
7 0,00 11,50 0,011 0,04 concentración de ambos diera este valor.
La realización del experimento contó con un
8 8,63 2,88 0,303 0,10 diseño de mezcla en plan mixto (Simplex Lattice)
9 3,83 7,65 0,352 0,04 con un modelo cúbico (28). Los niveles de concen-
10 11,50 0,00 0,273 0,14 tración de ambos nutrientes variaron entre 0 y
11,5 g/L. El número total de experimentos en estas
condiciones fue de 10.
Análisis estadístico Las variables respuestas seleccionadas fueron
Se realiza de forma similar a la llevada a cabo en dos: la productividad máxima de biomasa y el
la determinación de la fuente de carbono y de nitró- costo de los componentes del medio por gramo de
geno más efectiva en el medio. Se emplea el procedi- biomasa seca obtenida (ver tabla 5).
miento de diferencia mínima significativa (LSD) de
Fisher. Los resultados se muestran en la tabla 4. Condiciones de cultivo
La propagación se realizó de igual manera que
en experiencias anteriores y el crecimiento se llevó
Determinación de la proporción más apropiada a cabo por triplicado en frascos de cultivo de 250
entre la sacarosa y el extracto de levadura mL con 50 mL de medio en las mismas condiciones
ya descritas previamente.
Diseño del experimento
En experimentos anteriores la selección de los Análisis matemático de los datos
componentes del medio se realizó para una rela- Con los datos dinámicos del cultivo se calculó
ción fija carbono/nitrógeno (C/N) igual a trece, tal la productividad (g/L-h) en cada momento median-
como existía en el medio de referencia (24). En te la ecuación 3:
este experimento el objetivo fue determinar la
mejor concentración de sacarosa y de extracto de (ec. 3)

12 ICIDCA sobre los derivados de la caña de azúcar 49 (2) mayo - agosto, 2015
Tabla 6. Rangos y nivel de importancia de las variables y
funciones objetivos de la optimización multicriterio
L ím ite
Nombr e M eta
inf erior
Extracto de levadura en rango 0,00
Sacarosa en rango 0,00
Productividad
máxima 0,011
m áxima (Prodmáx)
Costo por g de
m ínimo 0,04
biom asa seca (C)
Tabla 7. Valores optimizados de las
concentraciones de nutrientes en el medio y
valores predichos de las variables respuesta
S olu ció n
No . Ex tracto de S acar os a Pro dmáx
levad ur a (g /L) ( g/ L) (h -11)
1 4,01 7,49 1,44
Donde X es la concentración de biomasa puntual
en g/L y X_0 la concentración inicial de biomasa,
dada en las mismas unidades.
Igualmente, la productividad máxima expresa-
da en g/L-h se calculó a partir de la expresión:
(ec. 4)
Donde Xmáx es la concentración máxima de bioma-
sa obtenida en g/L y tmáx el valor del tiempo en que
se alcanza la máxima productividad dado en horas.
El costo de los componentes del medio por
gramo de biomasa seca obtenida se expresó en $/g
y se calculó como:
Donde i es el número de componentes del medio; la
concentración de los componentes se expresa en
g/L; el precio en $/kg y Xmáx en g/L.
Optimización de la concentración de los compo-
nentes del medio de cultivo
Se realizó una optimización multiobjetivo de
las variables respuesta con ayuda del programa
Design-Expert 8.0.5b (28), en base a maximizar la
productividad máxima y minimizar el costo de los
componentes del medio por gramo de biomasa
seca. A ambas variables respuesta se le asignó el
valor máximo de importancia en la optimización
(ver tabla 6). El programa elaboró una función
objetivo basada en los pesos asignados a las varia-
ICIDCA sobre los derivados de la caña de azúcar 49 (2) mayo - agosto, 2015
bles respuestas y devolvió una
solución que satisface las restric-
ciones impuestas. Los resultados
Límite se pueden apreciar en la tabla 7.
Impor tan c ia
s u per ior
11,50 3 RESULTADOS
11,50 3 Selección de la fuente de carbono y
de nitrógeno a utilizar
0,352 5
Los medios conformados por
sacarosa-cloruro de amonio, saca-
0,14 5
rosa-sulfato de amonio, sacarosa-
urea, glucosa-cloruro de amonio,
glucosa-sulfato de amonio, glucosa-glutamato de
sodio, glicerol-sulfato de amonio y glicerol-L-glici-
na no mostraron una dinámica de crecimiento sig-
nificativa a la concentración en estudio. Los resul-
tados promedios obtenidos para el resto de los
Co sto medios estudiados se muestran en la tabla 1.
($/ g) Los resultados de las pruebas de rangos múlti-
ples derivadas del análisis de varianza realizado
0,04 tanto para los valores de la productividad máxima
como para el costo por kilogramo de biomasa seca
obtenida se muestran en las tablas 2 y 3.
Influencia de macro y micro nutrientes en el creci-
miento
Los resultados de la prueba de rangos múlti-
ples derivada del análisis de varianza realizado a
los valores de la velocidad de crecimiento máxima
determinados como resultado de las corridas expe-
rimentales diseñadas se muestran en la tabla 4.
Optimización de la concentración de nutrientes
El diseño del experimento y los resultados de
las variables respuesta productividad máxima y
costo de los componentes del medio por gramo de
biomasa seca se muestran en la tabla 5.
(ec. 5) En la tabla 6 se muestran los rangos definidos y
el nivel de importancia en la optimización para cada
variable así como las funciones objetivos utilizadas.
La tabla 7 ofrece la solución encontrada para las
funciones objetivos que fueron utilizadas en la opti-
mización de las concentraciones de nutrientes en el
medio.
DISCUSIÓN
Los medios compuestos por glucosa/extracto de
levadura/sales; glicerol/urea/sales y sacarosa/
extracto de levadura/sales, resultan eficientes,
según este orden, en cuanto a productividad, ren-
dimiento máximo y biomasa máxima obtenida.
Se emplearon dos criterios de efectividad para
la selección de las fuentes: uno técnico, la produc-
tividad y otro económico, el costo. En última ins-
13
tancia decidió el criterio económico y sobre esa
base se analizó que el medio formado por glice-
rol/extracto de levadura/sales no resultó factible
en cuanto al costo por kilogramo de biomasa seca
obtenida y ser este un producto de importación.
Sin embargo, este medio resultó el más eficiente
en cuanto a productividad, concentración de bio-
masa seca y rendimiento máximo.
Por su parte, la glucosa es la fuente de carbono
universal en la mayoría de los procesos microbianos y
el sustrato más ampliamente utilizado en el cultivo
del B. licheniformis para la producción de diversos
metabolitos. Se ha informado su empleo en la síntesis
del ácido γ -poliglutámico (15, 29), acetoína (30), ácido
láctico (16) y diversas enzimas (10, 11, 31, 32).
Sin embargo, los medios formados por gluco-
sa/extracto de levadura/sales y sacarosa/extracto
de levadura/sales presentaron criterios de efectivi-
dad similares. Es por ello que se seleccionó la saca-
rosa como fuente de carbono para el crecimiento
de B. licheniformis, C-232. Otra ventaja que pre-
senta la sacarosa sobre la glucosa es su fácil
adquisición y cercanía a los proveedores.
El medio seleccionado está compuesto por saca-
rosa/extracto de levadura/ sales MgSO4.7H2O;
CaCl2.2H2O y FeCl3.6H2O. Este medio es muy
similar al desarrollado e informado previamente
(33) para el cultivo de la bacteria quitinolítica
Tsukamurella paurometabola y al propuesto por
Dahech y col. (34) para la síntesis de la enzima
levanasacarasa a partir de la propia bacteria B.
licheniformis. Adicionalmente, se ha informado
que la sacarosa es la fuente de carbono ideal para
la producción de exopolisacáridos como la levana a
partir de B. licheniformis (14, 35, 36).
Como puede observarse en la tabla 4 el medio
de control utilizado (sacarosa/extracto de levadu-
ra/sin sales) muestra los valores de velocidad de
crecimiento máximos lo que sugiere que la adición
de sales al medio provoca una inhibición en el cre-
cimiento de la cepa, probablemente debido a que el
extracto de levadura, como sustrato complejo,
resulta suficiente para satisfacer las necesidades
fisiológicas del microorganismo. Estos resultados
permiten excluir la adición de sales minerales al
medio de cultivo. En experimentos no mostrados
se intentó sustituir el extracto de levadura con
sales y con vitaminas y no se consiguió una combi-
nación que consiguiera aproximarse a los resulta-
dos logrados con este medio.
De la optimización multiobjetivo se obtiene
una solución que cumple todas las restricciones
impuestas en la que las concentraciones optimiza-
das encontradas por el programa fueron de 7,49
g/L de sacarosa y 4,01 g/L de extracto de levadura
con una productividad máxima predicha de 0,334
g/L-h y un valor de concentración máxima de bio-
14 ICIDCA sobre los derivados de la caña de azúcar 49 (2) mayo - agosto, 2015
masa seca de 1,44 g/L (ver tabla 7). Estos valores
de concentraciones óptimos representan el menor
costo de los componentes del medio por gramo de
biomasa seca obtenida que fue de 0,04 $/g. El costo
que se reporta no es el de producción, es sólo el de
materias primas. Aunque elevado este producto
sustituye el uso de antibióticos y de un probiótico
de importación de costos mucho más elevados,
razón por la cual, actualmente, el resultado está
introducido en el centro de desove de Cienfuegos.
Los medios informados en la literatura para la
producción de diversos productos se encuentran a
una concentración diez veces superior por lo que
para poder comparar los valores de la concentra-
ción máxima de biomasa seca obtenida mediante
estos medios y la que se estima para la relación
óptima de nutrientes encontrada, es necesario
multiplicar este valor por diez lo que resulta en
14,40 g/L que es muy superior a los 5,69 g/L publi-
cados con anterioridad por otros autores (17) para
la predicción del crecimiento de B. licheniformis
mediante redes neuronales artificiales en el que se
utiliza un medio compuesto por almidón, peptona,
NH4Cl, CaCl2, MgSO4, citrato de sodio, NaCl y
FeSO4. A estas concentraciones de nutrientes se
obtienen bajas cantidades de biomasa seca del
orden de 1 a 6 g/L, esto se explica debido a que la
mayoría de estos medios tienen como objetivo la
excreción de un producto metabólico y no el incre-
mento de los niveles de biomasa seca (14, 37).
CONCLUSIONES
Como resultado de la estrategia empleada para el
diseño del medio se obtuvo que un medio compuesto
por sacarosa y extracto de levadura fue suficiente
para un crecimiento efectivo de la bacteria B. licheni-
formis, C-232, desde el punto de vista de la producti-
vidad y del costo por gramo de biomasa obtenida. La
adición de sales no tiene un efecto significativo en la
productividad del proceso de crecimiento. La produc-
tividad máxima alcanzada es notable (0,33 g/L-h)
superior a otros reportes que se enfocan en maximi-
zar la síntesis de productos. El costo de materias pri-
mas de la biomasa seca es de 0,04 $/g, elevado debido
al empleo del extracto de levadura. El valor de máxi-
ma conveniencia se alcanza con 4,01 g/L de extracto
de levadura y 7,49 g/L de sacarosa y es de 0,948.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo recibido del
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de
Camagüey, por los recursos otorgados para desa-
rrollar esta investigación.
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