DATOS,

CÁLCULOS Y
RESULTADOS
Para la determinación de riboflavina por Según la tabla 1, se realizó la curva de
fluorescencia fue necesario realizar una calibración graficando intensidad vs
curva de calibración por patrón externo. concentración, se muestra a
Primeramente, se preparó 500 mL de continuación:
HCl 0.1 M a partir de HCl al 37%. El
cálculo fue el siguiente:
y = 353,65x + 564,13
R² = 0,9262

Se pesó 6.3 mg del patrón de riboflavina

y se disolvió en un matraz ámbar de 50
mL con el HCl que se preparó. De esta
solución se tomó una alícuota de 20 mL
y se llevó a un matraz ámbar de 50mL. Gráfica 1. Curva de calibración.
De ésta solución se tomó alícuotas para
preparar soluciones estándar (en La ecuación para la curva anterior fue
matraces de 50 mL) con de:
concentraciones entre 1 y 5 ppm.
𝑦 = 353,65𝑥 + 564,13
A partir de la selección de las Ec. 1
longitudes de onda de excitación y
emisión se realizó la medición de Donde:
cada estándar de la curva de b= 353,65
calibración, iniciando con el blanco
a = 564,13
el cual fue el solvente (HCl).

Los datos para la realización y Se calcula �𝑥𝑥, �𝑦𝑦, �� con sus respectivas
resultados de la curva se encuentran a ecuaciones:
continuación
�𝑥𝑥 = ∑(𝑥𝑖 − 𝑥𝑥̅)2 Ec.2
Concentración Intensidad
�𝑦𝑦 = ∑(𝑦𝑖 − 𝑦𝑥̅)2 Ec.3
ppm
1,0 745.59
2,0 1357.02 x́=3,0 ppm
3,0 1817.45 ý=1625,08
4,0 2025.98
𝑥𝑥̅: La media de todos los valores de x 𝑦𝑥̅: La
5,0 2179.36
media de todos los valores de y
Tabla 1. Concentraciones ppm vs
intensidad soluciones patrón
 353,65 ± 183,2563

Se determinó el límite de detección y de

cuantificación con la ecuación 9 y 10.
Ec. 4
3∗S R
Los valores son: LD= =1 , 5460 Ec.9
m
�𝑥𝑥 = 10,0 10∗S R
LC= =5 ,1534 Ec.10
�𝑦𝑦 = 1350312,169 m
�� = 182,2351

Se calcula Sa Resultados de
la muestra
1 x2
sa  S R  fue necesario preparar una solución de
n S xx lectura cuya concentración fue de 3 mg/L
Ec.5
de riboflavina. Se analizó una solución
de complejo B inyectable, la cual
Reemplazando se tiene que: contenía 5000 mg/L de riboflavina, a
continuación, se muestran los cálculos
�a = 191,1297853 realizados para llegar a la concentración
de la solución de lectura.
Intervalo de confianza

a± 𝑡�a Ec.6

𝑡 Con n-2 grados de libertad al 95%:

3,18 Al ser el volumen anterior uno muy
pequeño, fue necesario utilizar una
564,13 ± 607,7927 micro pipeta de 10-100 𝜇�.

SR La medición de la señal en
sb  fluorescencia, para la muestra de
S xx lectura, evidenció un valor inferior al
Ec.7
primer punto de la curva, por esta razón
Reemplazando se tiene se realizó por duplicado la muestra

�b= 57,62779856 Muestras Intensidad

1 725.308
Intervalo de confianza 2 777.842
Tabla 2. Lectura de las muestras

b ± 𝑡�b Ec.8
a continuación se halla la concentración
𝑡 Con n-2 grados de libertad al 95%: de la solución de lectura utilizando la
3,18
ecuación proporcionada por la regresión
lineal.
Se sabe que:
𝑦 = 353,65𝑥 + 564,13
Despejando x se obtiene:
y−564,13
x=
353,65
Ec.11
Al reemplazar la señal obtenida en la
ecuación 1, se tiene que:
𝑥 = 0,6043
Posteriormente, se procede a hallar
la incertidumbre de la concentración
obtenida anteriormente, dónde su
principal fuente de error se
encuentra atribuida a la curva y a
las desviaciones presentadas en
esta, más no a su preparación.
Ec.12
Donde:
��: Desviación estándar de la regresión
𝐷: Número de lecturas de la muestra
𝑛: Número de datos (estándares de la
curva)
𝑦�: Señal de la muestra
𝑦𝑥̅: Promedio de señales de los
estándares
�𝑥𝑥: Suma de los cuadrados de las
desviaciones de las
concentraciones de los estándares
con respecto a la media de estos
𝑚: Pendiente de la curva
Entonces, los valores para cada variable
son las siguientes:
�� = 182,2351
𝐷=1
𝑛=5
𝑦� = 777,842
𝑦𝑥̅ = 1625,08
�𝑥𝑥 = 10,00
𝑚 = 353,65
Reemplazando cada valor se obtiene
que:
�𝑥𝑀 = 0.5049
Con el valor hallado anteriormente de
determina la cantidad de riboflavina
(vitamina B2) en el medicamento.
0,6043mg riboflavina 50 mL
x =
1000mL 0.03 mL muestra
El porcentaje de error se calcula con la
ecuación 13, teniendo como valor teórico
el reportado en la literatura que
corresponde a 5.0mg de riboflavina por
mL de medicamento.
|Valor experimental−Valor teorico|
%Error= x 100 Ec .13
Valor teorico
|1,007−5.0|
%Error= x 100=79,86
5.0
ANÁLISIS DE RESULTADOS.
El fenómeno de la fluorescencia
consiste en la propiedad de algunas
sustancias de absorber la radiación
electromagnética en una longitud de
onda (espectro de excitación) y de
emitirla de inmediato en forma de
fotones, en otra longitud de onda
más larga (espectro de emisión). El
espectro de emisión constituye una
característica intrínseca de cada
sustancia y la intensidad de emisión
es proporcional a la concentración
de la sustancia.1 Dicho de otra
manera, las moléculas absorben
fotones con una determinada
energía, y liberan fotones con menor
energía. Este proceso es casi
inmediato. La luz es recibida y
vuelta a emitir en millonésimas de
segundo, por lo tanto, se puede
decir que la fluorescencia dura tanto
como el estímulo, ya que cuando
este cesa, también cesa el
fenómeno de fluorescencia.2
Excitación (absorción)
�0 + ℎ𝑣𝑒𝑥 → �1
Ec. 14
Fluorescencia (emisión):
�1 → �0 + ℎ𝑣𝑒𝑚
Ec. 15
Figura 2. Fenómeno de fluorescencia.
Una de las características más atractivas
de los métodos de fluorescencia es su
sensibilidad inherente, la cual es, con
frecuencia, de uno a tres órdenes de
magnitud mejor que las de la
espectroscopia de absorción. No
obstante, los métodos de fluorescencia
se aplican mucho menos que los
métodos de absorción debido al número
relativamente limitado de sistemas
químicos que se pueden hacer
fluorescer.3
La fluorescencia tiene lugar en sistemas
gaseosos, líquidos y sólidos, tanto
sencillos como complejos. El tipo más
sencillo de fluorescencia es el que
presentan los vapores atómicos diluidos.
Para diferenciar la fluorescencia de otros
fenómenos de fotoluminiscencia, se
requiere una revisión del spin del
electrón y de los estados singulete.4
El principio de exclusión de Pauli
establece que en un átomo no puede
haber dos electrones con los cuatro
números cuánticos iguales. Esta
restricción requiere que no haya más de
dos electrones en un orbital y, además,
los dos deben tener los estados de spin
opuesto. Cuando esto ocurre, se dice
que los spines están apareados. Debido
al apareamiento de spines, la mayoría
de las moléculas no presentan un campo
magnético neto y se dice, por tanto, que
son diamagnéticas, es decir, no son
atraídas ni repelidas por campos
magnéticos permanentes.
Un estado electrónico molecular en el
cual todos los espines de los electrones
están apareados se llama singulete y
cuando la molécula se expone a un
campo magnético no se produce un
desdoblamiento de niveles de energía.
Cuando uno de los electrones de una
molécula es excitado a un nivel de
energía superior, se forma un estado
singulete o triplete. En el estado
singulete excitado, el spin del electrón
promocionado continúa
Apareado con el electrón del estado
fundamental.4
En el caso de la fluorescencia, sucede
un proceso de relajación de un estado
singulete excitado de baja energía (S1)
hacia el estado fundamental (S0)
mediante la emisión de un fotón. 5
La velocidad a la cual se absorbe un
fotón de radiación es enorme, el proceso
requiere una velocidad del orden de 10-
15 a 10-14 s. Por otro lado, la emisión
fluorescente tiene lugar a una velocidad
significativamente más lenta. El tiempo
de vida del estado excitado se relaciona
inversamente con la absortividad molar
del pico de absorción correspondiente al
Proceso de excitación.4
La mayor o menor capacidad
fluorescente de una sustancia se puede
medir con la siguiente fórmula:
Ec. 16 Rendimiento cuántico de
fluorescencia.
Al resultado de esta relación se le
llama rendimiento cuántico (ϕ). El
máximo rendimiento sería del 100%
cuando todos los fotones absorbidos
son reemitidos. Sustancias con un
cociente de 0.1 (es decir que de 10
fotones que absorben solo uno es
reemitido) aún se consideran
bastante fluorescentes.2
La fluorimetría es la técnica
espectrofotométrica que se basa en
la absorción de radiación por parte
del analito a medir en una muestra y
su posterior emisión. Su
fundamento es la fluorescencia
molecular. Al ser la longitud de onda
de la radiación emitida diferente de
la longitud de onda de absorción,
puede utilizarse esta tanto para
identificar como para cuantificar
sustancias.6
La principal ventaja de las técnicas
fluorimétricas es su sensibilidad,
que permiten detectar cantidades de
sustancias del orden de ng. Las
causas de esta mayor sensibilidad
de la fluorimetría con respecto a la
espectrofotometría de absorción
radican en que las medidas de
fluorescencia utilizan como blanco
un compuesto no fluorescente, que
da una señal cero o muy próxima a
cero en el detector. En cambio, en el
caso de las medidas de absorción,
el blanco transmite la mayor parte
de la radiación incidente y provoca
una gran respuesta en el detector.
Por lo tanto, en los métodos
fluorimétricos es posible aumentar
significativamente la sensibilidad del
detector, permitiendo medir con
precisión cantidades muy pequeñas
de radiación. 6
Las moléculas tienen diferentes
estados llamados niveles de
energía. La espectrometría de
fluorescencia se refiere
principalmente a estados
vibracionales y electrónicos. En
general, las especies objeto de
examen tendrán un estado
electrónico basal (un estado de baja
energía) de interés, y un estado
electrónico excitado de mayor
energía. Dentro de cada uno de
estos estados electrónicos hay
diferentes estados vibracionales. 7
En la espectroscopia de
fluorescencia, primero se excita la
muestra mediante la absorción de
un fotón de luz, desde su estado
electrónico basal a uno de los
distintos estados vibracionales del
estado electrónico excitado. Las
colisiones con otras moléculas
causan que la molécula excitada
pierda energía vibracional hasta que
alcanza el estado vibracional más
bajo del estado electrónico excitado.
La molécula desciende luego a uno
de los distintos niveles de vibración detector y el filtro secundario están en
del estado electrónico basal, una línea que forma un ángulo con la
emitiendo un fotón en el proceso. anterior.1
Como las moléculas pueden caer a
cualquiera de los diferentes niveles
de vibración en el estado basal, los
fotones emitidos tendrán diferentes
energías y, por lo tanto, frecuencias.
Así pues, mediante el análisis de las
diferentes frecuencias de luz emitida
por espectrometría de fluorescencia,
junto con sus intensidades relativas,
se puede determinar la estructura
de los diferentes niveles de
vibración. 7

Figura 3. Estructura básica de un

equipo de fluorescencia.
En un experimento típico, se miden las
diferentes frecuencias de luz La vitamina B2 conocida también
fluorescente emitida por una muestra, como riboflavina, pertenece al grupo
manteniendo la luz de excitación a una de pigmentos amarillos
longitud de onda constante. A esto se le fluorescentes llamados flavinas,
llama espectro de emisión. Un espectro descubierto a principios de 1879 y
de excitación se mide mediante el caracterizado a finales de 1932.
registro de una serie de espectros de
emisión utilizando luz de diferentes La vitamina B2 es una vitamina
longitudes de onda.7 hidrosoluble, amarillenta, constituida
principalmente por un anillo de
Los equipos para la medición de la isoaloxazina, el cual posee dos
fluorescencia se denominan grupos metilo y se une al ribitol,
fluorímetros. En general, el patrón de llamado así por ser un alcohol
construcción es el siguiente: derivado de la ribosa. Dichas
uniones conforman la isoaloxazina,
1. Lámpara de arco de Hg o Xe. a continuación se muestra la
2. Lente de cuarzo o de vidrio. molécula en cuestión.
3. Rendija.
4. Filtro primario (longitud de onda de
excitación).
5. Cubeta para la muestra.
6. Filtro secundario (longitud de onda de
emisión).
7. Fotomultiplicador.
8. Galvanómetro.

En línea recta con la lámpara, el filtro

primario y la cubeta, se sitúa una
superficie de absorción de luz; el

Figura 4. Molécula de riboflavina.
La riboflavina es caracterizada por ser
fotosensible, presentando así una
descomposición de hasta el 50 % de la
cantidad de vitamina disponible, de
encontrarse esta bajo exposición solar
durante aproximadamente 2 horas.
Es importante mencionar que la
estabilidad de la riboflavina aumenta
significativamente en medio ácido, tanto
su resistencia al calor como la foto
sensibilidad, razón por la cual fue
necesario preparar la solución madre de
riboflavina en HCl 0.1 M. Ésta vitamina
en medio neutro es medianamente
inestable y en medio alcalino tiende a
ser muy inestable, tanto que inclusive a
temperatura ambiente es capaz de
hidrolizarse formando un ácido
oxocarbónico y urea.
El análisis por fluorescencia en la
riboflavina es posible gracias a que tiene
una buena rigidez estructural. En este
caso la estructura molecular juega un
papel importante, puesto que esta
determina en gran medida probabilidad
de absorción. El cruce intersistema, que
supone un cambio de multiplicidad,
depende en gran medida de la
interacción espín-órbita, la cual está
favorecida por la presencia de átomos
pesados. El proceso de conversión
interna, transición no radiactiva entre
estados electrónicos de la misma
multiplicidad, es inducido por los
términos de acoplamiento electrónico
despreciados en la aproximación de
Born-Oppenheimer. Este proceso va
seguido de la relajación vibracional
hasta el nivel vibracional más bajo del
estado electrónico.9 En la práctica se
observó un % de error bastante elevado,
lo cual podría atribuirse principalmente a
errores sistemáticos, esto último debido
a que fue necesario tomar un volumen
muy pequeño con el fin de preparar la
solución de lectura 1 (30 uL) y ya que el
analista no conoce los certificados de
calibración de las micropipetas
utilizadas, es posible que hubiese una
diferencia entre el volumen elegido y el
volumen tomado realmente, lo cual
generaría un sesgo positivo o negativo,
según sea el caso. Haciendo a parte la
calibración de las micropipetas, es
probable que el mecanismo utilizado
para tomar el volumen en la micropipeta
se haya presionado más de lo debido,
esto haría que la micropipeta tomase un
volumen mayor al volumen estipulado en
la misma, lo que generaría un sesgo
positivo en dicha solución. Se puede
producir la desactivación de la molécula,
generando una transferencia de energía
cinética entre ellas, y posiblemente su
posterior hidrolización, lo anterior
evitaría la cuantificación puesto que no
sería posible producir la fluorescencia
esperada, sin embargo esto habría
causado un sesgo negativo en el
resultado y ya que el sesgo obtenido fue
bastante positivo, se asume que el error
principal proviene de la toma de la
alícuota de la solución de lectura 2, con
la micro pipeta.
BIBLIOGRAFIA
[1] Fluorimetría (en línea) Visitada el
19 de Julio de 2019;
http://gsdl.bvs.sld.cu/cgi-bin/library?e=d-
00000-00---off0preclini--00-0----0-10-0---
0---0direct-10---4-------0-1l--11-ptZzbr-
50---20-about---00-0-1-00-0-0-11-1-
0utfZz-8-
00&a=d&c=preclini&cl=CL1&d=HASH09
2e43c34fe527df7c134
0.5.5.4
[2] Fluorescencia (en línea) Visitada
el 19 de Julio de
2019;http://quimica.laguia2000.com/conc
eptosbasicos/fluorescencia
[3] Espectroscopia de Fluorescencia
Molecular (en línea)
Visitada el 19 de Julio
de 2019;
http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Qui
mica/Plan%201997/te
marios/671111darchivos/fundamentos/S
EMINARIO%203.PDF

[4] Espectroscopia Luminiscente (en

línea) Visitada el 19 de
Julio de 2019;
http://docslide.us/documents/espectro-
de-dispersion.html

[5] Fluorescencia (en línea) Visitada

el 19 de Julio de
2019;www.scian.cl%2Fportal
%2Fglobals_file.php%3FCS%3D
2960%26ID%3D1409836870.8698%26D
%3DON&usg=AFQjC
NGVwvQytRSo5B_y_QqlTPJEao03Q&si
g2=hzlnXjb7MiYno6Yl
3_b5Cg

[6] Espectrometría de Fluorescencia

(en línea) Visitada el 20 de Julio de
2019;
http://www.espectrometria.com/espectro
metra_de_fluorescenci a

[7] Skoog, D.A.; Holler, F.J.; Crouch

S.R. “Principios de Análisis
Instrumental”, 6° ed., editorial Cengage
Learning, México D.F.

[8] Skoog, D.A.; West, D.M.; Holler,

F.J.; Crouch S.R. “Fundamentos de
Química Analítica”, 9° ed., editorial
Cengage Learning, México D.F. Páginas,
684, 765.

[9] Riboflavina (en línea) Visitada el 20

de Julio de 2019;
http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/
vitamins/riboflavina.ht ml