INTRODUCCIÓN

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la

detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc.) y
estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la
espectrofotometría son relativamente sencillos.

Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía

interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el
de la fotosíntesis en plantas y bacterias.

El espectro electromagnético

Desde Newton, sabemos que la luz blanca se descompone en los colores que la integran
si la hacemos pasar a través de un prisma. Es el efecto que se repite, por ejemplo en el
arco iris, el cual se dice es el espectro de la luz visible procedente del sol, son las
gotas de lluvia y el aire atmosférico lo que hacen de espectroscopio. La principal
emisión de radiación de los cuerpos es la radiación electromagnética en forma de luz
visible, de la misma manera cada elemento químico absorbe y emite luz de colores
que componen su espectro.

La longitud de onda de la radiación puede ser desde muy pequeña, en el caso de la

llamada radiación gamma, hasta muy grande en las ondas de radio. Se mide, pues,
usando desde nanómetros y ángstrom hasta cientos de metros. Recordemos que un
nanómetro es la milmillonésima parte de un metro (1 m = 109 nm) y que un Ángstrom
es la diez mil millonésima parte de un metro (1 m = 10 10 A), por lo que un nanómetro
equivale a 10 Ángstrom (1nm = 10 A)

La luz que recibimos del Sol es radiación electromagnética que se desplaza a 300.000
Km/s, en su totalidad, pero la longitud de onda no es la misma en todos los fotones
luminosos, sino que varía entre los 4000 A y los 7000 A, aproximadamente, o lo que es
lo mismo, entre los 400 nm y los 700 nm. La luz blanca se descompone, en definitiva,
en un espectro de diferentes bandas coloreadas, cada una definida por una longitud de
onda distinta. Así, la luz de menor longitud de onda es la luz violeta, que es de
alrededor de unos 4000 Ángstrom, y la luz de mayor longitud de onda es la luz roja, que
es de alrededor de unos 7000 Ángstrom.

Sin embargo, hay radiaciones de mayor y también de menor longitud de onda, es decir,
que tienen una longitud de onda inferior a 4000 Ángstrom y que tienen una longitud de
onda superior a los 7000 Ángstrom.

Las radiaciones que van desde el violeta al rojo se dice que forman el espectro visible,
pues proceden de la descomposición de la luz blanca.

Las radiaciones de longitud de onda inferior al violeta se llaman radiaciones

ultravioletas, rayos X y rayos gamma, por orden decreciente en la longitud de onda.

Las radiaciones de longitud de onda superior al rojo son las denominadas infrarrojas,
microondas y ondas de radio, por orden creciente en longitud de onda.
 Colores de la luz visible
Longitud de onda de la Color absorbido Color observado
absorción máx. (nm)
380-420 Violeta Amarillo-verdoso
420-440 Azul-violeta Amarillo
440-470 Azul Naranja
470-500 Verde-azulado Rojo
500-520 Verde Púrpura
520-550 Verde-amarillento Violeta
550-580 Amarillo Azul-violeta
580-620 Naranja Azul
620-680 Rojo Verde-azuloso
680-780 Púrpura Verde

TIPO DE RADIACIÓN Intervalos de las longitudes de onda

Rayos Gamma inferiores a 10-2 nanómetros
Rayos X entre 10-2 nanómetros y 15 nanómetros
Ultravioleta entre 15 nanómetros y 4.102 nanómetros
entre 4.102 nanómetros y 7,8.102 nanómetros
ESPECTRO VISIBLE
(4000 Ángstrom y 7800 Ángstrom)
Infrarrojo entre 7,8.102 nanómetros y 106 nanómetros
Región de Microondas entre 106 nanómetros y 3.108 nanómetros
Ondas de Radio mayores de 3.108 nanómetros

(1 metro = 102 cms = 103 mms = 109 nanómetros = 1010 angstroms)

Componentes básicos de un instrumento analítico:

 GENERADOR DE SEÑAL

SEÑAL ELÉCTRICA, LUMINOSA O FUENTE LUMINOSA

MECÁNICA ESTIMULO ELÉCTRICO

TRANSDUCTOR DE ENTRADA

DISPOSITIVOS ANALÓGICOS
SEÑAL ANALÍTICA ELECTRODO FOTOTUBO TERMOPAR

TRANSFORMADOR DE SEÑALES

AMPLIFICADOR CONVERTIDOR
SEÑAL DE SALIDA FILTRO INTEGRADOR

TRANSDUCTOR DE SALIDA

MEDIDOR O ESCALA REGISTRADOR

Método espectrométrico

Los métodos espectrométricos son métodos instrumentales empleados en química

analítica basados en la interacción de la radiación electromagnética, u otras partículas,
con un analito para identificarlo o determinar su concentración. Algunos de estos
métodos también se emplean en otras áreas de la química para elucidación de
estructuras.

Estos métodos emplean técnicas que se dividen en técnicas espectroscópicas y en

técnicas no espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas son aquellas en las el
analito sufre procesos de absorción, emisión o luminiscencia. El resto corresponde a
técnicas no espectroscópicas.

Las técnicas espectroscópicas se diferencian también según la forma en la que se

encuentra el analito en el momento en el que sufre el proceso espectroscópico, dando
lugar a la espectroscopia atómica y a la espectroscopia molecular.

Según el rango de energía que presente la radiación electromagnética existen diferentes

técnicas, por ejemplo, espectroscopia de infrarrojo, espectroscopia de resonancia
magnética nuclear, etcétera.

Las técnicas no espectroscópicas aprovechan diferentes propiedades de la radiación

electromagnética, como el índice de refracción o la dispersión.

Parámetros de medición
La Transmitancia (T) es la relación entre la intensidad de radiación transmitido por
una muestra (I) y la intensidad de radiación que incide sobre la muestra (I0), medidos
ambos en la misma posición del espectro y con la misma rendija:

Se supone que el haz es de radiación paralela y que incide sobre las superficies planas y
paralelas de la muestra, formando ángulos rectos.

La transmitancia de una muestra está normalmente dada porcentualmente, definida

como:

La Absorbancia (A) es el logaritmo en base diez del recíproco de la transmitancia (T),

en el que el disolvente puro es el material de referencia; esto es:

Las interacciones electromagnéticas con la materia provocan la absorbancia o emisión

de energía REM a través de la transición de los electrones entre niveles cuánticos o
discretos de energía, vibraciones de enlaces, rotaciones moleculares y transición de
electrones entre orbitales de átomos y moléculas.

La espectrofotometría de absorción de infrarrojos es adecuada para análisis orgánicos,

pues los enlaces en alquenos, ésteres, alcoholes y otros grupos funcionales tienen
fuerzas muy diferentes y absorben la radiación de infrarrojos en una gran variedad de
frecuencias o energías. Esta absorción se refleja en el espectrógrafo en forma de picos.
No se deben tomar medidas de absorbancias muy bajas o muy altas puesto que
disminuye la exactitud del método. La absorbancia es adimensional y generalmente se
presenta con mínimo tres decimales.

Longitud de onda, distancia entre dos puntos consecutivos de una onda que tienen el
mismo estado de vibración. La longitud de onda representa un concepto fundamental en
la resolución de cualquier tipo de movimiento ondulatorio, y puede variar de valores
muy grandes por ejemplo, cientos de metros para radio ondas largas a valores muy
pequeños por ejemplo, de millonésimas de millón (10-12) para los rayos gamma. Las
crestas y los valles son aquellos lugares en los que el movimiento transversal es
máximo. La longitud de onda es la distancia entre dos compresiones o enrarecimientos
consecutivos.

MARCO EXPERIMENTAL
Materiales

• Muestra Estándar: Azosulfamida

Violeta de Genciana
• Espectrofotómetro
•
Procedimiento

Preparación de la muestra estándar

a. Estándar: AZOSULFAMIDA 10 ug/ml

b. estándar: VIOLETA DE GENCIANA 5 ug/ml

a. Preparación de azosulfamida de una concentración de 10 ug/ml partiendo de una

concentración de 1mg/ml.

Cálculos:

10 ug/ml se lleva a una fiola de 100ml Equivalencia:

1mg →1ml
10 ug →1ml
1mg ⇔1000 ug
x →100 ml ⇒x =1000 ug

 Se tiene
1mg → que
1mse
l necesita 1ml (1mg) para preparar 100ml de azosulfamida diluida
la cual1tendrá
mg ⇔una
1000concentración
ug de 10ug/ml.

b. Preparación de violeta de genciana de una concentración de 5ug/ml partiendo de

una concentración al 1%

Cálculos:

Se quiere preparar: 5ug →1ml

→ 5ug →1ml
Lo cual se lleva a una500
fiola
ug de 100ml
100 ml y se tiene:
1%
De la muestra que se tiene: 1g →100 ml 500 ug →100 ml

1g ⇔1000000 ug ⇒1000000 ug →100 ml

1%
Al convertir a ug se tiene: 1g→100 ml

Se
1%diluye la muestra tomando
10000001mlug
1y%→
1g ⇔1000000
llevándola
1% 100 ml ⇒ a una
1ml (fiola
10000deug
ug ⇒1000000 ug →100 ml
100ml de la
) →100 ml cual se
(10000 ug )
vuele
1g → a100
tomar
ml 1ml de la muestra diluida
1g 1→ y→se100
g 100 mtiene:
l ml
↓
1g ⇔1000000 1m1000000
ug ⇒1000000 ug)1⇒
l ( xug → ⇔
gug1
100=
xg→
⇔100 ug
1000000
m l1000000
100 ml ⇒ ⇒
ug 1ug (⇒
ml 1000000
1000000
10000 ugug
)→→
ug →m
100
100 100
m
l l(10000
ml ug )

⇒100 ug →1ml
↓
1000000 ug →100 ml ⇒11mmll((10000 )⇒ )x→
xug1000000
ug
1000000
=ug
100
100→
ugugl→
m100
(10000
100 ⇒
ml m ⇒
lug1m) l1(m
10000
l (10000 →
ug )ug →100
) 100 ml (m
10000
l (10000
ug )ug )
500 ug →x ⇒x =5ml
Por
↓
lo tanto, después de una doble↓dilución
↓ 1ml
se tiene:
⇒100 ug →
De la cual requerimos
1ml ( xug ) ⇒x =100 ug
de 500ug, entonces:
1ml1(m
xug )⇒
l ( xug )⇒ x =x100
=100
ug ug
500 ug →x ⇒x =5ml
⇒100 ug →1ml ⇒100
⇒100 →1
ug ug →
ml1ml

500 ug →x ⇒x =5ml 500500 →→

ug ug x⇒
x⇒
x =x5=
ml5ml
Se tiene que tomar 5ml de la muestra diluida (1%) para preparar 100ml de violeta
de genciana que contiene 500ug (5ug/ml)

Medición de transmitancia o absorbancia

• Prender el espectrofotómetro. Permitir al espectrofotómetro calentarse al menos

durante 15 ó 20 minutos para que se estabilice la fuente y el detector.

• Después del periodo de calentamiento, establecer la longitud de onda deseada

mediante los controles de > o < longitud de onda.

• Establecer el modo a transmitancia presionando el control de modo hasta que el

foco indicador a un lado de transmitancia este prendido.

• Ajustar la transmitancia a 0 % con el Interruptor de encendido / Control de cero.

Asegúrese que el compartimiento para la celda este vacío y cerrado.

• Llenar una celda con agua destilada y limpie la celda con una franela para
remover gotas de líquido, polvo o huellas dactilares. Poner la celda en el
compartimiento de la celda alineado la marca guía de la celda con la marca guía
en el frente del compartimiento. Presionar firmemente la celda en el
compartimiento y cerrar la cubierta.

• Ajustar a 100 % de transmitancia con el control de Transmitancia / Absorbancia.

Remover la celda del compartimiento y vaciar el agua.

• Enjuagar la celda con pequeños volúmenes de la solución a medir y llenar con la

dilución. Limpiar la celda con una franela y colocarla en el compartimiento de
muestra. Alinear las marcas guías y cerrar la cubierta.

• Leer la transmitancia/absorbancia en el indicador digital.

• Remover la celda del compartimiento y repetir los pasos 5 a 8 para las demás
longitudes de ondas deseada.

DISCUSIÓN DEL MÉTODO

• Las lambdas obtenidos de la azosulfamida y la violeta de genciana durante el

desarrollo de la práctica, como se muestra en los resultados son de 530nm y 580
nm respectivamente; se puede notar como la absorbancia para dicha sustancia es
la máxima que se obtuvo
• Pero para el caso de la violeta de genciana se observa como los niveles de
absorbancia llegan a tomar valores negativos lo que no asegura que los datos
obtenidos sean 100% confiables.

CONCLUSIONES
La espectrofotometría es un método analítico indirecto porque se basa en la medición de
la absorbancia o transmitancia de las radiaciones; de gran utilidad para la identificación
de un analito en una muestra problema.

Rangos de lectura:

• AZOSULFAMIDA 450nm – 600nm

Rango de lectura Absorbancia Transmitancia

(nm) A %T
450 0,239 57,676
460 0,275 53,088
470 0,330 46,773
480 0,389 40,831
490 0,457 34,914
500 0,522 30,060
510 0,569 26,977
520 0,592 25,585
530 0,596 25,351
540 0,567 27,101
550 0,501 31,550
560 0,417 38,282
600 0,333 46,451
580 0,250 56,234
590 0,176 66,680
570 0,133 73,620

• VIOLETA DE GENCIANA 500nm – 650nm

Rango de lectura Absorbancia Transmitancia

(nm) A %T
500 0,174 66, 9
510 0,232 58, 6
520 0,301 49, 9
530 0,356 44
540 0,393 40, 4
550 0,410 38, 9
560 0,471 33, 8
570 0,521 30, 1
580 0,567 27, 1
590 0,510 30, 9
600 0,404 39, 4
610 0,270 53, 7
620 0,144 71, 7
630 0,057 87, 6
640 0,014 96, 8
650 -0,005 101, 2

CUESTIONARIO
1. Preparar una solución de azul de metileno de 2ug/ml. Si para lo cual se peso 100mg
de cristales de azul de metileno. ¿Qué diluciones se deben hacer?

Cálculos:

Se desea preparar: 2ug →1ml

Se lleva a una fiola de 100ml y se tiene: 2ug →1ml
200 ug →100 ml
Se tiene 100mg de cristales de azul de metileno. 200 ug →100 ml
Al convertir a ug se tiene: 100 mg
1mg →1000 ug
Se llevan los 100mg de 100
azul g →x ⇒
demmetileno =100000
a xuna fiola deug100ml
de la cual
se toman 5ml que luego se llevan a otra fiola 100ml de la cual finalmente
se toma 1ml.
100 mg 100000 ug →100 ml (100000 ug )
↓
100 mg
1mg →1000 ug 5ml ( xug ) ⇒x =5000 ug ⇔5ml (5000 ug ) →100 ml (5000 ug )
100 m
100 mg →x ⇒x =100000 ug g ↓
1mg →1000 ug
1ml ( xug ) ⇒x =50 ug
100mm
100 gg →x ⇒x =100000 ug
1mg →1000 ug
100000 ug → 100
100 mm g
m → x⇒ 50xug
ug=)100000
→1ml ug
1001m ggl →(100000
1000 ug
↓ 200 ug →xml ⇒x = 4ml
100 mg ug
100000 → →x⇒ 100xm= l (100000
100000 ug ug )
5ml ( xug ) ⇒1xm= →1000
g 5000 ug ⇔ ug 5ml (5000 ug ) →100 ml (5000 ug )
↓ 100 mg
↓Entonces se100000
tiene:
100 mg ug → → x⇒100xm= l 100000
(100000 ug ug )
5ml ( xug ) ⇒x100 =5000m g ug ⇔5ml (5000 ug ) →100 ml (5000 ug )
1De
ml (los
xugque
)⇒ se
↓ xrequieren
= 50 ug ug200ug:
↓100000 1mg →→ 1000100ugml (100000 ug )
5ml ( xug ) ⇒x = 5000 ug ⇔5ml (5000 ug ) →100 ml (5000 ug )
↓l (100
1m xug m )g⇒ → x 1=
xm⇒50
g → x=
ug 100000
1000 ug ug
 Por lo50tanto,
ug → se
1mdeben
l↓100000 tomar ug →
5ml ( xug ) ⇒100
4ml 100de mlla(100000
x =5000
dilución ugrealizada
⇔
) a los 100mg de los
) →100 ml (5000 ug )
mg →x ⇒5xm
ug =l 100000
(5000 ugug
cristales200
deugazul de metileno
→xm1l↓ ml⇒ obteniendo
x =) 4⇒
( xug ml x = 50 ug así la concentración deseada (2ug/ml).
↓ug
50 →1ml
5ml ( xug ) ⇒x =5000 ug ⇔5ml (5000 ug ) →100 ml (5000 ug )
1mlug
200 →
( xug
100000 ⇒
)xmugl x⇒→ =100
x=
50 ug4
mml l(100000 ug )
50↓ug →1ml
↓ 100000 ug →100 ml (100000 ug )
2. Buscar en bibliografía las 1mestructuras
200 lug( ug
xug→ ) xm
⇒ l xde
⇒=los x=
50 ugcompuestos
4ml analizados y las lambas (λ)
50 → 1 m l
5ml ( xug ) ↓ ⇒x =5000 ug ⇔5ml (5000 ug ) →100 ml (5000 ug )
óptimos.
200↓ ug →xml 5⇒ ml (xxug = 4)m l x =5000 ug ⇔5ml (5000 ug ) →100 ml (5000 ug )
⇒
50 ug →1ml
Lambdas óptimas: 1ml ( xug ) ⇒ ↓ x =50 ug
200 ug →xml ⇒x = 4ml
1ml ( xug ) ⇒x =50 ug
Violeta de genciana: λ= nm 50 ug → 1 m l
200 ug →50 xmlug⇒ → x1=ml4ml
Azosulfamida: λ= nm 200 ug →xml ⇒x = 4ml

3. ¿Por qué razón no debe usarse un lamba (λ) que no sea el óptimo?

El lamba optimo por ser el mas estable nos permite tener valores constantes como el de
la absortividad molar; a pesar de que la concentración varíe, el lamba optimo seguirá
siendo el mismo. Caso contrario si se utilizara un λ que no sea el óptimo variarían las
constantes.

Estructuras de los compuestos:

Violeta de genciana:
+
H3C

N CH3

H3C
-
Cl
N

H3C

+
N CH3

H3C

Azosulfamida:

O
H2N
S

O
CH3
N OH O

N
NH
O O

S S
O O
O O
Na Na

BIBLIOGRAFÍA
• Fundamentos de Química Analítica
Autor: Skogg D. y West D.

• Index Merck
Autor: Robert E. Buntrock

• Métodos de Análisis Instrumental

Autor: Gary L. Bender