I.

INTRODUCCION

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y
en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos
medios son esenciales en el Laboratorio de biotecnología por lo que un control en su
fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y
reproducibilidad de los resultados obtenidos.

En los laboratorios de biotecnología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que

pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un
medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como
el agar, la gelatina o la sílicagel.

En el año 1962 Murashige y Skoog propusieron como medio de cultivo a la que

posteriormente lo denominaron MS con el cual realizaban la formación de callos o a partir
de meristemos hacían crecer una nueva planta en un ambiente más controlado.

II. OBJETIVOS

Objetivo General:

 Preparar de manera adecuada el medio de cultivo de las plántulas y realizar las

técnicas de propagación in vitro.

Objetivos Específicos:

 Conocer paso a paso las técnicas de propagación de cultivo de tejidos in vitro.

 Identificar paso a paso las técnicas de preparación en medio de cultivo.
 III. MARCO TEORICO
1. ¿Qué es el cultivo de tejido vegetal?
Castillo, A (2004), menciona que, el punto de partida para el cultivo de
tejidos es la iniciación. Este es el proceso por el cual se trae material
vegetal in vivo en un medio de cultivo estéril. Requiere la disección
microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el
propósito de transferir su punto de crecimiento o tejido que crece
activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro
de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las
células y tejidos que crecerán y se desarrollarán desde este inicio
dependerán de los objetivos del cultivo de tejidos.

2. ¿Qué es un medio de cultivo?

López Tévez (2001), menciona que, un medio de cultivo es un
sustrato o una solución de nutrientes que permite el
desarrollo de microorganismos. En las condiciones de
laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el
medio de cultivo elegido las muestras en las que los
microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.
Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra,
pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y
tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de
nichos ecológicos.

Krikorian(1991), los medios nutritivos para el cultivo de células y tejidos

vegetales son, en general, menos complejos que los de cultivos
microbianos y son formulados en forma más o menos empírica. Si bien se
desarrollan periódicamente nuevas fórmulas comerciales, no existe hasta
el presente un diseño racional que tenga en cuenta la composición
centesimal de la célula vegetal y el conjunto de condiciones que
controlan el crecimiento y la diferenciación. No obstante,
normalmente se puede utilizar un medio sencillo y complementarlo
con diferentes componentes y reguladores de crecimiento para llegar
 empíricamente a la fórmula que le brinde al tejido las mejores
condiciones para su crecimiento y producción.

3. Tipos de medio de cultivo

 Sólido.
Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un
agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar.
Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el
inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además
su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (Iicúa a
temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para
cultivos a 37°C, que es la tempera óptima de crecimiento para
muchos microorganismos. Agar-agar: Es un polímero de azúcares
obtenido de algas marinas.
Los gelificantes más usados en el cultivo in vitro son:
Agar: Es una mezcla de polisacáridos extraídos de un alga
marina. La planta no puede digerirlo ni adsorberlo, y no
interactúa con los componentes nutritivos del medio.

 Líquido.
Son los que se presentan en este estado, denominándose por
esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado
caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne,
peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende
la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada
concentración. Facilita la absorción de nutrientes por el explante.

4. Reguladores de crecimiento

 Giberelinas
Constituyen una familia de compuestos químicos tetracíclicos
diterpenoides que regulan varios procesos del crecimiento y desarrollo
como la germinación de semillas, la elongación de tallos, el desarrollo
de raíces y la floración. Las GAs se sintetizan a partir de ácido
 mevalónico en tallos jóvenes y en semillas en desarrollo. Permiten
superar la latencia de semillas y brotes, promueven la floración y
retardan la senescencia.

 Auxinas
Vozmediano (1982), señala que las hormonas de enraizamiento,
son todas sustancias de la familia fisiológica de las auxinas, siendo
las más empleadas las siguientes: Ácido indol acético (AlA), que
es muy activo pero presenta dos inconvenientes en la práctica:
sus moléculas se destruyen fácilmente por oxidación siendo
poco estable. Y es relativamente soluble, su molécula emigra
rápidamente a los tejidos de la planta. Ácido indol butírico
(AIB), que es más estable y menos soluble.

 Citoquininas.
Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas) que inducen
división celular y frecuentemente tallos adventicios y en
muchos casos inhiben la formación de raíces adventicias. Las
citoquininas in vivo incrementan la tasa de división celular, el
transporte de solutos hacia las hojas, semillas, flores y frutos y
producen un retardo de la senescencia de las hojas.

 EI Ácido Abscisico (ABA).

Es un regulador de crecimiento cuya tasa de biosíntesis se modifica
significativamente frente al estrés fisiológico ocasionado por falta de
agua, salinidad del suelo, bajas o altas temperaturas, etc. El ABA
provoca respuestas que ayudan a proteger a las plantas contra estos
factores, como el cierre de estomas y la producción de proteínas
protectoras. También participa en la embriogénesis normal y en la
formación de proteínas de almacenamiento en semillas.

 Etileno.
 El etileno es un compuesto gaseoso reconocido como hormona de
maduración de los frutos pero que además regula diversos
procesos fisiológicos como la germinación de las semillas¡
la senescencia de hojas y flores, la abscisión de hojas y frutos y
la floración de algunas especies. El modo de acción del etileno no
es aún conocido aunque se han detectado cambios en la expresión
genética de algunas proteínas Es producido en cultivos in vitro
de todo tipo y se acumula en la fase gaseosa de los recipientes
de cultivo en concentraciones variables según la clase y peso
del tejido, el volumen y la cubierta del recipiente y las condiciones
de cultivo.

 Poliaminas, Jasmonatos, Ácido Salicílico y Brasinoestroides.

Los compuestos mencionados en los ítems anteriores son
los reguladores de crecimiento corrientemente utilizados en
cultivos in vitre, especialmente las auxinas y citocininas. Sin
embargo, en los últimos años se han descrito otros grupos de
compuestos químicos producidos por las plantas, que afectan su
crecimiento y desarrollo y cuya acción in vitre se ha ensayado,
especialmente, en la producción de metabolitos.

5. Condiciones ambientales de cultivo

Los cultivos de tejidos vegetales deben mantenerse en condiciones
ambientales semejantes a las naturales más favorables. La luz, la
temperatura y la humedad relativa son los principales factores del
ambiente que inciden sobre los cultivos, El comportamiento de muchos
cultivos depende de la calidad, intensidad y fotoperíodo de la luz que
reciben, dado que varias enzimas involucradas en el desarrollo y en el
metabolismo secundario son influenciadas por la luz.

 Micropropagación.
 Las plántulas in vitro, "libres de patógenos", se usan como material
inicial para los programas de semilla de papa, camote y otras especies
de interés económico. Los métodos de Micropropagación usados
dependen principalmente de su volumen de producción y de la
infraestructura disponible. En el caso de la Micropropagación de
papa, los métodos básicos usados son las siguientes.

 Micropropagacion de meristernos:
En los años 50 en estudios realizados sobre dalias dirigidos por
Morel y Martín se descubrió que las plantas obtenidas a partir de
meristemos estaban libres de virus. Después de este trabajo y
ante la evidencia de las aplicaciones de este método, se iniciaron
estudios en busca de las razones por las cuales esto sucedía. Una
primera hipótesis explica la ausencia del virus en el meristemo por
la inexistencia de tejido vascular (tejido a través del cual se
movilizan los virus) en directa relación con el meristemo. Incluso
si el virus fuera capaz de invadir o moverse de célula a célula,
la velocidad de avance de los virus sería inferior a la de crecimiento
del meristemo, lo cual impediría su invasión.

 Micropropagación de nudos:
La Micropropagación por nudos esta basad en el principio de que
el nudo de una plántula in vitro, colocado en un medio de cultivo
apropiado inducirá el desarrollo de la yema axilar y originara una
nueva plántula in vitro. Este tipo de propagación promueve el
desarrollo de una estructura morfológica preexistente. La
condición nutritiva-hormonal del medio rompe la dormancia de
la yema axilar y promueve su rápido desarrollo. Se debe evitar la
formación de callo y la regeneración de plantas a partir de este, en
ambos casos se puede afectar la estabilidad genética de genotipo.

6. Problemas comunes en micropropagacion:

 Contaminación:
 La presencia de microorganismos en los cultivos in vitro reduce el
éxito de los resultados, especialmente durante las primeras etapas.
Esta situación se genera por las condiciones físicas del cultivo que
conforman un ambiente propicio para su desarrollo (Debergh &
Zimmerman, 1991).
La mayor fuente de contaminación en el cultivo de tejidos
vegetales se produce por la presencia de microorganismos
superficiales y sistémicos de la planta donadora.

 Fenolización:
Los explantes frecuentemente se tornan marrones o negruzcos
poco después del aislamiento y cuando esto ocurre, se inhibe el
crecimiento y el tejido generalmente muere, Los tejidos jóvenes
son menos susceptibles al oscurecimiento que los más duros.

 Ausencia de enraizamiento:
Los explantes pueden formar raíces naturalmente durante la
propagación, sin el requerimiento de una etapa adicional de
enraizamiento, como en el caso de la papa. Sin embargo, algunas
especies silvestres de papa pueden manifestar deficiencia en la
producción de raíces.

 Oxidación:
Durante el cultivo in vitro el explante sufre siempre en mayor o menor
medida situaciones de estrés, ocasionadas por daños mecánicos o por
las condiciones del cultivo in vitro (como la composición del medio).
Estas situaciones estimulan el metabolismo de los compuestos
fenólicos. La síntesis de fenoles va a producir una serie de reacciones
de hipersensibilidad, tales como la exudación al medio del contenido
de las células deterioradas (Debergh & Read, 1991).

7. Estadio de cultivo de tejidos

POIROT (1991) manifiesta que el proceso de cultivo de tejidos incluye
cinco fases que son:
 Etapa O: Etapa preparativa:
Consiste en clasificar el material que se encuentra en condiciones
fisiológicas y fitosanitarias adecuadas. Usualmente las plantas que
donan el explante se someten a termoterapia con el fin de eliminar
partículas virales (Hartmann et al., 1997).

 Fase I. Preparación de la planta madre:

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben
obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo
adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a
las plantas madre entre unas semanas o varios meses, en un
invernadero, en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la
nutrición, del fotoperíodo y de la radiación recibida.

 Fase II. Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia:

Una vez escogida la planta madre, se extraen los fragmentos a partir
de los cuales se obtendrán los Explantes, previamente se desinfectara
estos fragmentos para eliminar los contaminantes externos. Una
vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones
de asepsia. Ya en estas condiciones (se trabaja en cámaras de
flujo laminar) se extraen los explantes del material vegetal y se ponen
en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo, para
poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantes.

 Fase III. Multiplicación de los brotes:

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron de la
Fase I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios
entrenudos. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar
en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de
cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en
la cámara de flujo laminar.
  Fase IV. Enraizamiento:
Enraizamiento in vitro: se transfieren los brotes obtenidos durante la
fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento
o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de
flujo laminar. Este método permite ser más flexible a la hora de escoger
los brotes, ya que estos obtienen del medio la fuente de energía para
enraizar, y por lo tanto no es necesario que tengan las hojas muy bién
desarrolladas para realizar la fotosíntesis.

 Fase V. Aclimatación:
Es la etapa conocida como endurecimiento, proceso mediante el cual
las plantas obtenidas en condiciones in vitro se transfieren
gradualmente a un ambiente ex vitro. Para obtener éxito en los
resultados se debe reducir gradualmente la humedad relativa que rodea
a la planta, con el objetivo de lograr que la planta controle la
transpiración y pueda adaptarse a un sustrato en condiciones de campo
(Hartmann et al., 1997).

8. ÁREAS DE UN LABORATORIO DE CULTIVOS VEGETALES

 Sala de lavado:
En esta sala se llevará a cabo el lavado de la cristalería en general;
también puede emplearse para el primer lavado con detergente del
material vegetativo. Aquí se puede instalar la autoclave para
esterilizar tanto el medio de cultivo como el material y tubos o
recipientes contaminados.

 Sala de incubación:
En esta sala deben tenerse muy en cuenta las instalaciones eléctricas,
pues las diferentes fases del crecimiento de los inóculos necesitaran
diferentes fotoperiodos, temperatura, intensidad lumínica, etc.
No debe faltar:
 Aire acondicionado y filtrado.
 Control de temperatura.
 Anaqueles para incubación, con las características siguientes:
 Cada unidad debe construirse en seis niveles, con 50 cm. Entre
cada nivel.
 Iluminación diferencial recibida por plantas colocadas de 15 a
45 cm. De distancia de la fuente luminosa (tubos fluorescentes
de 40 watts, vita lite, TH 12, de 48").
 Termostatos separados para temperatura de día y de noche.
 Apagado automático de temperatura de emergencia para
cada sala.
 IV. MATERIALES Y METODOLOGIA

4.1.Ubicación

La presente práctica de laboratorio se realizó en el laboratorio de cultivos in vitro de

la universidad “Santiago Antúnez de Mayolo” de la facultad de ciencias- Huaraz.

4.2.Materiales
Probeta graduada, vaso de precipitación, matraz de Erlemeyer, frascos ámbar.
Agitador, tubo de ensayo, pinzas, bisturí W 11, tijera quirúrgica, pipeta, frascos
de vidrio 250 ce, magenta, caja Petri, tubos de 16 x 125 mm, 18 x 150 mm y 25
x 150 mm, caja Petri, tubos de ensayo, matraz de Erlemeyer.

4.3.Insumos
Papel de aluminio, sales de Murashige y Skoog (1962), stock de Vitaminas.
(Tiarnina, piridoxina, aeido nicotínico, glicina, mionositol), reguladores de
crecimiento, Phytagel (gelificante), hidróxido de sodio NaOH, Ácido
clorhídrico HCI, alcohol de 96% & 70%, algodón, plántulas In vitro, fósforos

4.4.Equipos
Guantes quirúrgicos, mesa móvil para portar materiales y transportar material
preparado, cámara fotográfica, cámara de flujo laminar, mechero de alcohol,
mascarilla, cubre pelo, guardapolvo, balanza analítica de 8 dígitos, purificador de
agua, potenciómetro, cocina eléctrica, refrigeradora, mesa móvil para portar y
transportar materiales, treparados

4.5.Metodología
Preparación del medio de cultivo
o En un vaso de precipitación se llenó 200 ml de agua destilada.
o Luego se adicionó el M.S. 4.00 gramos.
o Se pesó y adicionó 30 gramos de suerosa o azúcar blanca refinada.
o Se agitó bien, luego se enraza a un litro.
o Seguidamente se medió el pH de 5.6 a 5.7, se observó si el pH está muy
acido elevar con hidróxido de sodio (preparado) y si es muy alto el pH
bajar con ácido clorhídrico.
 o Luego en la cocina eléctrica se puso el vaso para calentar el medio
y se adicionó el Phytagel 3.8 gramos hasta que el color acuoso cambie a
cristalino.
o Seguidamente en los frascos se dispensó 27 mililitros de medio de cultivo
y se selló con bolsa de polietileno.
o En la práctica se realizó dos tipos de medios de cultivo en sólido y en
líquido, en el caso del líquido ya no es necesario calentar ni echar
Phytagel simplemente una vez medido el pH del medio se dispensó en los
Erlenmeyerde 250 ml. 12 mi de medio por frasco, luego se selló y se
esterilizó en la olla autoclave.
o Para el medio solido se dispensó en el Erlenmeyer de 250 ml. 25 ml de
medio por frasco.
o Una vez enfriado el medio se trasladó al cuarto de transferencia para las
respectivas siembras.

Micro propagación
de plántulas

o Se prende la cámara de flujo laminar durante media hora para que el aire
sea purificado luego, se desinfecta con alcohol 70°.
o La Micropropagación durante la práctica se realizó en medio sólido, de
pequeñas plántulas in vitro, de los cuales se cortaron nudos individuales
con hojas.
o Se eligió una planta madre con buenas características físicas, las cuales
fueron traídas del campo con buenas condiciones.
o Las hojas se diseccionan con cuidado, luego los esquejes, se
colocaron sobre la superficie del medio de cultivo,
o Los meristemos apicales a otro frasco y los meristemos laterales en otro
frasco debido a que tienen diferencias en la rapidez de crecimiento,
donde en cada frasco mediano entran 25 esquejes,
o El movimiento de la mano es rápida muy minuciosa en cuanto a la
manipulación de los instrumentos, la respiración debe ser lo más
lenta posible, y si están propagando entre dos personas evitar hablar,
el uso del alcohol en este proceso juega un papel muy importante
tanto en el flameo como en la limpieza continua de las manos
y de los instrumentos de corte o cirugía,
o Luego de la siembra en medio de cultivo, se procede a sellar el frasco,
también se flamea y se sella
o Luego los frascos se trasladaron a la cámara de incubación
donde al cabo de 4 semanas se obtiene una nueva planta con 7 a 8
yemas axilares disponibles para de nuevo ser multiplicados por el
mismo proceso o para pasar a otra etapa como es el invernadero.
 V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

 Se pudo observar los pasos de la preparación de medio de cultivo de forma

detallada.

 Se conoce que las técnicas de propagación para cultivos in vitro de forma

detallada.

 Al momento de realizar el preparado, solución del medio de cultivo, es necesario

medir el pH del cultivo para así evitar complicaciones a la hora desarrollo del
explanto y se de una buena micropropagación con el material del medio de cultivo
hecho de manera adecuada.

 Es necesario tener mucho cuidado en el momento de la propagación con las

condiciones de asepsia, ya que cualquier descuido, así como soltar el material
propagativo fuera del envase y estar expresando puede adquirir hongos maléficos
que contaminan el medio de cultivo y sobre todo a la planta en cuestión, esto hara
que la planta se infecte y no se haya hecho una adecuada propagación.
 VI. BIBLIOGRAFIA

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