Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Columnas de HPLC2010 PDF
Columnas de HPLC2010 PDF
de HPLC
1
En esta clase aprenderá lo
siguiente:
Los diferentes usos de las columnas de
HPLC.
Los materiales de relleno de las
columnas.
Cómo seleccionar el diámetro de
partícula adecuado.
Cómo seleccionar el diámetro interno de
columna adecuado.
Cómo seleccionar la longitud de
columna correcta.
2
Columnas de HPLC
Muestreador
Precolumna
Fase móvil
desde la
bomba
3
Columna - Acero inoxidable
estándar
Relleno de
columna
Frita de filtro de
acero inoxidable
Capilar
Tamaño de poro
de 2 um
4
Columna - Columnas de
cartucho
Cartucho de protección
Frita PEEK/Junta
Columna de cartucho
Conexión del
extremo
5
Materiales de relleno de
columnas - Sílice
Esférico
Irregular
Las partículas tienen un diámetro de
3 a 10 mm en las columnas estándar.
6
Materiales de relleno de
columnas - Fases enlazadas
Poros
Cadena de carbono
con forma de cepillo
H3C Si CH3
R1 R1 Si Si
R2 R2
7
Materiales de relleno de columnas - Fases
enlazadas extensamente utilizadas
HPLC de fase inversa CH3
•C18 |
Las columnas de HPLC más utilizadas
•C8 -0-Si- R
•C4
|
Separaciones de proteínas
•C1 CH3
•Fenilo Dipolo débil - dipolo inducido
Interacciones con analitos polares Intercambio iónico
DEAE (dietilaminoetanol)
HPLC de fase normal o inversa QAE (aminoetilo cuaternario)
Carboximetilo
• CN Polaridad intermedia
Exclusión de tamaño
• NH2
8
Materiales de relleno de columnas
Rendimiento mejorado de desoxinucleósidos
utilizando fase enlazada óptima
0 2 4 6 8 min
9
Materiales de relleno de columnas -
Soportes de polímeros
Estireno Divinil benceno Estireno-divinilbenceno
CH = CH 2 CH = CH 2
- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -
Admiten:
Fase normal e inversa
Intercambiadores iónicos
Cromatografía por exclusión de tamaño
10
Tamaño de partícula - Efecto en
la eficacia
Número de platos/metro/103
Teórico
3 -µm
N
5 -µm
10 -µm
Velocidad de flujo Velocidad de flujo de la fase móvil, ml/min
Columnas Zorbax SB-C8; d.i. de columna, 4,6 mm; ciprofloxacina; 22 °C
Fase móvil, 20% ACN/80% acuosa, 0,1% TFA
11
Tamaño de partícula - Efecto en la
eficacia y la resolución
300SB-C8 (4,6 x 50 mm)
6
5µm 2 7 1. Met Encefalina
2. Leu Encefalina
1 5 3. Angiotensina II
4. Neurotensina
9
3 4 10 5. RNasa
6. Insulina
7. Lisozima
8. Calmodulina
8 9. Mioglobina
10. Anihidrasa carbónica
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo de retención, min.
12
Número aproximado de platos (N) y
volumen vacío (Vm) para columnas de 5
mm y 3,5 mm
Si se reducen simultáneamente la longitud de la
columna (N ) y el tamaño de partícula (N ), se
podrá:
◦ Mantener la resolución
◦ Reducir el tiempo de análisis
◦ Reducir el uso de disolventes
Tamaño de la Número de platos Volumen vacío
Tamaño de partícula
columna (N) (Vm )
4,6 x 250 mm 5-m m 20.000 2,5 ml
4,6 x 150 mm 5-m m 12.000 1,5 ml
4,6 x 150 mm 3.5-m m Resolución rápida 20.000 1,5 ml
4,6 x 75 mm 3.5-m m Resolución rápida 10.000 0,75 ml
4,6 x 50 mm 3.5-m m Resolución rápida 6.000 0,5 ml
4,6 x 30 mm 3.5-m m Resolución rápida 3.600 0,3 ml
4,6 x 15 mm 3.5-m m Resolución rápida 2.000 0,15 ml
13
Aumentar la velocidad de análisis
mientras se mantiene la resolución
5 mm 3,5 mm 5 mm 3,5 mm
40% 50%
Tiempo de 30 min Reducción18 min 18 min 9 min
Reducción
análisis (min)
40% 50%
Residuo de 30 ml Reducción 18 ml 18 ml Reducción 9 ml
disolvente
(ml)
14
Conseguir todo el potencial con
mayor velocidad de flujo
Presión mAU Rs2,1 = 2,2 Velocidad
300 Rs7,6 = 2,2 de flujo
200
90 bar 100
0 2 ml/min
mAU
300
200
133 bar 100
0 3 ml/min
mAU Rs2,1 = 2,1
300 Rs7,6 = 2,2
200 30 seg
181 bar 100
0 4 ml/min
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0.6 0.7 0.8 0,9 min
15
Columnas con diámetro interno pequeño y muy
pequeño
dp= 10 dmm Convencional
4,6 mm 1,00 ml/min
dp= 5 dmm
4,6 mm
0 2 4 6 8 10
Diámetro interno
muy pequeño
o
1,0 mm 100 mm
200 mm
0 2 4 6 8 10
Ventajas:
Consumo reducido de disolvente. Inconvenientes:
Idóneas para análisis de trazas si la La instrumentación debe tener un
cantidad de muestra es limitado. volumen externo a la columna muy
bajo.
Fácil conversión de velocidad de flujo
para cambiar el método de columna Las fritas se deben cambiar con más
analítica a columna de diámetro muy frecuencia.
pequeño.
16
Velocidades de flujo típicas
d.i. de columna Flujo
(partículas de 5 mm ) ml/min
4,6 1 –2
3,0 0,4 - 0,8
2,1 0,2 – 0,4
1,0 0,05 – 0,09
17
Separación de alta resolución utilizando
una columna de diámetro interno estrecho
Muestra: 4. Acetanilida
1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol) 5. Aspirina (ácido acetilsalicílico)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4
2. Cafeína 6. Ácido salicílico
4,6 x 50 mm 3. 2-Ac2-Acetoamidofenol 7. Fenacetina (acetofenetidina)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 min
19