UNIVERSIDAD DE

GUAYAQUIL

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

Biotecnologia
Deber #2
Tema: Producción de proteína recombinante con
estrategia de clonación virtual
Integrantes:
 Walter Aaron Suarez Noboa
 Maria Fernanda Sanchez Suarez
 Ricardo Israel Paez Sanchez
 Stephany Gabriela Sylva Figueroa
 Patricia Perez

Docente: Ing. Cecilia Uzca Sornoza

Curso: 7-1
Año Lectivo: 2018-2019 CI
INTRODUCCIÓN
El presente trabajo describe la producción de proteínas recombinantes a nivel
virtual, haciendo una clara referencia de cómo se efectúa a nivel de laboratorio.
La producción de proteínas recombinantes en los diferentes tipos de industrias,
cada vez son más imprescindibles. Prácticamente todas las enzimas que se
utilizan en la industria, ya sea esta, (textil, alimenticia, papel, farmacéutica, etc.)
son recombinantes. Para producir estas proteínas recombinantes con fines
farmacéuticos se usa principalmente células huésped de mamíferos. Para la
producción de la proteína recombinante “eritropoyetina” se escoge la línea
celular CHO, ya que debido a las características que posee la convierte en un
huésped idóneo para la producción de esta proteína.

Para la clonación virtual primero se encuentra la secuencia que codifica la

proteína EPO, para esto se recurre a la utilización de la base de datos NCBI. Se
procede al empleo del programa informático serial cloner 2.6, el mismo que será
una herramienta informática para la creación de la proteína recombinante. Las
enzimas de restricción escogidas son BamHI Y XBal, el plásmido que se utiliza
es el pcDNA 3.1, obtenido de la base de dato vectorial.
LÍNEA CELULAR (CHO)
La línea celular CHO constituye en la actualidad la mejor alternativa frente a otros
sistemas de expresión establecidas (bacterias, levaduras) para la producción de
proteínas recombinantes, debido a sus técnicas que permiten transfección,
amplificación y selección de clones productores (Butler, 2005). En CHO (línea
celular obtenida a partir de tejido de ovario de hámster chino), coexiste una
compleja disparidad mutacional, lo cual inevitablemente amplía las
oportunidades de su utilización en el estudio de la genética en eucariontes (Irani,
Beccaria, & J.Wagner, 2013). Tienen un número modal cromosómico de 20-21,
posee 10-13 marcadores cromosómicos bien definidos, posee propiedades que
la hacen competente para estudios de daño genético a nivel cromosómico y de
gen. (Sánchez-Lamar, 2011)

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (BamHI y XBal)

BamHI de Bacillus amyloliquefaciens H (ALDRICH)
BamHI es una endonucleasa de restricción de ADN que se usa en aplicaciones
de biología molecular para escindir ADN en la secuencia de reconocimiento 5'-
G / GATCC-3 'para generar extremos 5'-cohesivos.

XBal de Xanthomonas badrij

XBal es una endonucleasa de restricción de ADN que se usa en aplicaciones de

biología molecular. Su secuencia de reconocimiento es 5'TCTAG
3'AGATCT y da como resultado del corte5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'
Figura/diagrama que muestre la secuencia de DNA (nucleótidos) de la
proteína de su elección y el cDNA (nucleótidos) de la proteína de su
elección.

 La secuencia de CDS de color rosado va desde: 182 hasta 763.

 Información de selección y traducción

Mapa con los sitios de enzimas de restricción en la secuencia de

nucleótidos que codifica la proteína que ha elegido.
  Se muestra en la parte superior e inferior las enzimas de restricción que
tiene nuestra secuencia de cds (la cual está de rosado) de la
Eritropoyetina.

Mapa el plásmido seleccionado de acuerdo con el huésped donde se lo

pretende utilizar (usar referencias). El mapa muestra los sitios de
restricción específicos para la clonación y los sitios relevantes para
expresión
  En el lado superior de la fleca naranja, llamada zona de clonación múltiple,
existen gran cantidad de enzimas de restricción, en ese sitio es donde se
va a insertarse nuestro Gen (EPO)

Lista de enzimas empleadas para la digestión del plásmido, de la secuencia

que codifica la proteína y para insertar la secuencia de ADN en el plasmido.
Use referencias que soporten la selección de enzimas. Muestra la
secuencia del forward y reverse primer con extremos 5’ y 3’
Lista de enzimas: LacO, AmpR, Kan/neoR, Amp prom, Lac, SV40 ORI, bGH PA
  Bases en minúsculas permiten la adición del CDS al plásmido
Se utilizaron las enzimas BamHI y Xbal ya que estas permiten que el fragmento
de DNA se adhiera con mayor facilidad gracias a que los cortes formados son
escalonados y permite que sus extremos se re-asocien muy fácilmente por ser
cohesivos o “pegajosos” (Asensio, 2016)
Mapa de del plásmido recombinante detallado con los sitios de restricción
relevantes, la localización de la secuencia de ADN de interés, y otras
características relevantes para la expresión y purificación de la proteína
Para la obtención del plásmido recombinante se seleccionaron las enzimas de
restricción BamHI y Xbal con ayuda de la librería de enzimas de restricción del
programa SerialCloner
PROCEDIMIENTO PARA LA CLONACIÓN EN LABORATORIO DE LA
INSULINA A PARTIR DE LA LEVADURA
1. Extracción del gen de la glicoproteína llamada Eritropoyetina (EPO)
utilizando como tijeras enzimas de restricción BamH I y XBal dejando los
extremos cohesivos, de la misma forma se corta un segmento del gen del
plásmido pcDNA3 utilizando las mismas enzimas de restricción
empleadas en la EPO.
2. La Enzima ligasa va a unir los extremos cohesivos del plásmido pcDNA3
con el segmento del ADN de la EPO, donde también se incluye un gen de
resistencia al antibiótico, este proceso es conocido como
TRANSFORMACIÓN.
3. En una caja Petri con el cultivo del vector que contiene el plásmido
recombinante se procede a colocar antibiótico, donde solo aquellas
bacterias que contienen el gen de resistencia van a sobrevivir y ser
seleccionadas para los próximos procedimientos. Las bacterias que
contienen en ADN recombinante se multiplicarán.
4. Las células que contienen el ADN recombinante son trasladadas a un
cultivo acuoso.
5. Aislamiento del DNA plasmídico por lisis alcalina.- Llevar una muestra de
las células transformantes a un tubo de ensayo, para colocarlas a
centrifugar por 5 minutos a altas velocidades, donde las bacterias se
asentarán.
6. Añadir 200 uL del buffer de suspensión y mezclar muy bien el contenido,
ya sea por inmersión del tubo o pipeteando algunas veces. El buffer de
suspensión contiene TRIS a un pH de 7.5 y EDTA. El pH alcalino ayuda
a desnaturalizar el DNA. Se incuba el tubo de ensayo en hielo por 15
minutos. Se añade el buffer de lisis que contiene hidróxido de sodio y
SDS, el hidróxido de desnaturaliza el ADN y el SDS rompe la membrana
celular liberando el contenido de la bacteria a la solución, se incuba y
luego aplica buffer de neutralización donde el DNA se volverá a re-
naturalizarse. (Calderas, 2016)
7. Para introducir el DNA obtenido (TRANSFECCION) en las células CHO,
se realizara por electroporación para administrar un pulso único de 900
μF a 300 V y resistencia al infinito en una cubeta de 4 mm, esto se realiza
durante el periodo de crecimiento celular, es necesario previamente
monitorear la muerte celular, expansión de clones y expresión de genes.
Se observa que luego de 24 horas las células ya se han dividido en 2.
(Daniel Ley, 2015)

8. Los cultivos de clones individuales se seleccionan asistida por robot en un

sistema de violonchelo dependiendo de su capacidad para replicarse,
donde van a ser trasladados a cultivos en matraces de sacudido
policlonal. (Daniel Ley, 2015)
PROTOCOLO DE PURIFICACIÓN DE rhEPO

Para lograr una mejor corrida de isoelectroenfoque las muestras tienen que tener
una concentración suficiente y con un contenido bajo de sales, por motivo de
que, si hay fuerza iónica, altera el perfil de corrida. El proceso de purificación a
elegir tiene que recuperar todas las isoformas presentes desde su inicio en el
cultivo.
Purificación y concentración de volúmenes pequeños
Según la fuente de consulta, se utilizó para ultracentrifugación los filtros
Ultrafree-MC (Amicon-Millipore, EE.UU.), estos se utilizan en volúmenes
pequeños para la concentración y purificación de soluciones acuosas, cuyo
material a emplear es celulosa regenerada de baja unión a proteínas, y su límite
nominal es de 10 kDA. El proceso de purificación y concentración de las
muestras rhEPO está dado en 4 pasos según el autor:
1. Acondicionamiento previo al uso del filtro
Se realiza un lavado con agua ultrapura con un tiempo de 8 min a 2.500 g, para
excluir el agente humectante que puede estar presente en la membrana.
2. Concentración por ultrafiltración
Este se lo realiza con un volumen máximo permitido de 450 µl del sobrenadante
y se centrifuga durante 30 min a 2.500 g a 4 °C. Una vez terminado, se procede
a retirar el permeado y se homogeniza cuidadosamente con micropipeta el
volumen retenido, este se realiza con un fin, el cual es que las proteínas no se
depositen sobre el filtro y se tape. El proceso descrito se lo realizo las veces
necesarias hasta concentrar el volumen inicial de 1,5 ml de sobrenadante a 250
µl.
3. Diafiltración
Cuando el sobrenadante de cultivo ya es concentrado, se agrega suficiente agua
ultrapura hasta completar 450 µl y se le realiza centrifuga por 30 min a 2.500g y
4 °C; culminado el tiempo, esta vez se descarta el permeado, se homogeniza el
volumen retenido y luego se adiciona agua a la muestra, este proceso se lo
realiza las veces que sea necesario hasta disminuir las sales en 1/30 del valor
inicial.
4. Concentración final
Cuando ya es aceptable la concentración de sales y pequeñas moléculas, se
centrifuga a 2.500 g y 4 °C el tiempo suficiente para obtener un volumen final
entre 200 µl y 450 µl. La muestra se homogeneizó y se conservó a -20ºC, hasta
su análisis por ELISA e IEF. (Didier, 2008)
Bibliografía
ALDRICH, S. (s.f.). https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/restriction-
enzyme-digest.html.

Asensio, P. (2016). INGENIERÍA GENÉTICA Y SALUD I. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. Obtenido de Gobierno de

Aragón - Educa: http://iesbinef.educa.aragon.es/departam/webinsti/bach/bio/enzim/gena.htm

Butler, M. (2005). Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the. Obtenido de Applied
Microbiology and Biotechnology, 68, 283–291.

Calderas, J. (2016). Aislamiento de DNA plásmidico por lisis alcalina. Universidad de Guanajuato.

Daniel Ley, A. K. (2015). Multi‐omic profiling of EPO‐producing Chinese hamster ovary cell panel reveals
metabolic adaptation to heterologous protein production. NCBI.

Didier, C. (2008). Optimización de la producción de Eritropoyetina Humana Recombinante (rhEPO)

mediante el cultivo de células animales. 65-66. Obtenido de
http://bibliotecavirtual.unl.edu.ar:8080/tesis/bitstream/handle/11185/173/tesis1.pdf?sequenc
e=1&isAllowed=y

Irani, Beccaria, & J.Wagner. (2013). Expression of recombinant cytoplasmic yeast. Obtenido de pyruvate
carboxylase for the improvement of the production of human erythropoietin by.

Sánchez-Lamar, Á. (2011). UTILIZACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR CHO. Rev Cubana Invest Biomed
1999;18(1):19-21.

Calificación de los integrantes: