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Osatinsky, Raquel
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¿Que es la electroforesis capilar?
SUMMARY
INTRODUCCION
Figura 1a. Tubo en U de Tiselius
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación (J. Gras Proteinas Plasmáticas pag. 31 Ed. JMS 1983)
basada en la diferente velocidad de migración de las distin-
tas especies cargadas bajo la acción de un campo eléctrico.
La separación se lleva a cabo en un capilar de sílice fundida
de diámetro muy pequeño ( 10-200 μm). El uso de estos
capilares tiene múltiples ventajas: a) los capilares son an-
ticonvectivos en sí mismos, por lo tanto, no es necesaria la
utilización de un gel soporte como medio; b) el calor genera-
do al pasar la corriente eléctrica (efecto Joule), que daría lu-
gar a problemas de gradientes de temperatura no uniformes
( cambios locales de viscosidad ), es fuertemente reducido,
ya que la disipación de calor es muy efectiva; c) pueden
aplicarse altos voltajes consiguiéndose una reducción del
tiempo de análisis y altas eficiencias. (1-2-3)
Se la considera una técnica intermedia entre la clásica elec-
troforesis de zona (ZE) y la cromatografía (HPLC) líquida.(4-
5) Utiliza el principio de la electroforesis capilar en solución
libre. J. Gras en el Capítulo 1 de su libro Proteínas Plasmáti-
cas (1983) dice: “Electroforesis libre.- Los grandes avances
obtenidos en el estudio de las proteínas plasmáticas fueron
conseguidos gracias a la electroforesis libre. Los elementos
técnicos más fundamentales para la misma están constituí-
dos por la célula con electrodos y los dispositivos ópticos que
permiten visualizar el fenómeno. Célula y electrodos: Desde
las primeras determinaciones de movilidad electroforética
llevados a cabo por Nernst y por Hardy, el tubo en U utilizado
fue perfeccionado incesantemente por numerosos investi-
gadores, entre ellos por Tiselius, quien llego en 1937 a idear
un tipo que ha sido desde entonces la base del utilizado en
todos los aparatos de electroforesis analítica libre y median-
te el cual el método adquiere todo su desarrollo actual”.
Arne Tiselius, Bioquímico sueco, fue Premio Nobel de Quími-
ca 1948. aisló e identificó por electroforesis proteínas de la Figura 1b. Tubo de Tiselius acoplado
sangre y de la leche, además obtuvo por absorción la sepa- a portaelectrodos y baño termo regulador.
ración de diversos aminoácidos. (6) (J.Gras Proteínas Plasmáticas- pag- 32. Ed. JMS 1983)
La separación por CE es muy rápida, se realiza en menos de
5 minutos, con una reproducibilidad que muestran un coefi-
ciente de variación (CVs) < 2%, muchos investigadores con-
sideran que su sensibilidad es 10 veces mayor que la de la
cromatografía líquida de alta performance.(7-8-9)
Desde 1937, luego de la primera publicación de Tiselius, se
multiplicaron las investigaciones sobre el tema, mejoran-
do el equipo , los capilares empleados, aplicando metodos
como el isoelectroenfoque sobre éste sistema y en los últi-
mos tiempos su aplicación en bioquímica clínica.
Se conocen varios sistemas de separación por ésta tecno-
logía. La electroforesis capilar de zona(CZE); el isoelectro-
enfoque capilar (CIEF); la isotacoforesis capilar ( CITF) y la
cromatografía micelar electrocinética (MECC). Desde 1990
el avance en ésta campo fue vertiginoso, ya que podemos in-
cluir diagnósticos estudiando DNA, dficiencias enzimáticas, de protéinas séricas, urinarias , variantes de hemoglobina,
estudios de drogas de abuso en orina , estudios de esteroides crioglobulinas, líquido céfalo raquídeo, proteinas reactantes
y en cuando a el labortorio clínicoa, métodos para separasión de la fase aguda y muchas variantes más. (10-11-12)
¿Que es la electroforesis capilar?
La electroforesis capilar es la modalidad más utilizada por Requiere una fuente de alto voltaje ( +/- 8000 voltios). Uno
su simplicidad operacional y versatilidad. Requiere peque- o más capilares cuyos extremos se encuentren sumergidos,
ños volúmenes de muestra por lo que ha despertado un junto con dos electrodos, en dos viales que contienen una
gran interés en diferentes campos, tal como lo demuestra solución buffer, un detector y un sistema de adquisición de
el incremento de publicaciones realizadas en el área de la datos. Los capilares son generalmente de sílice fundida, con
bioquímica y biotecnología, industria farmaceútica, análisis diametros internos de +/- 50 nm, cubiertos con poliamida
clínicos y medio ambiente. (13) para darle flexibilidad y disminuir su fragilidad. El pequeño
El capilar y los viales se llenan con una solución buffer. La diámetro facilita la disipación del calor generado por la re-
muestra está formada por un conjunto de aniones y catio- sistencia eléctrica del electrolito dentro del capilar. La sílice
nes que se introduce dentro del sistema ocupando una úni- fundida es mejor conductor de calor que cualquiera de los
ca zona. Al someterlo a la influencia de un campo eléctrico, otros materiales usados para fabricar capilares de diámetro
migran hacia el electrodo correspondiente, estableciéndose pequeño ( teflón, pyrex).
un movimiento de iones que forman parte del sistema. Durante las separaciones, los extremos del capilar están
Permite la separación de moléculas cargadas en función de colocados en dos recipientes que contienen un buffer, el
su movilidad electroforética, en un buffer a un pH determina- mismo con el que se ha llenado la columna. Junto con otras
do, según el punto isoeléctrico (pI) de la molécula y de un flu- condiciones, la composición del buffer define el método de
jo electrosmótico (EOF) más o menos importante. El EOF es el análisis. Ambos recipientes contienen el mismo buffer y su
flujo del líquido en el interior del capilar originado por la carga nivel debe ser el mismo en los dos para evitar cualquier tipo
eléctrica negativa existente en la pared interna del capilar. En de flujo debido a un desequilibrio hidrostático. Al introducir
el caso de los capilares de sílice fundida ésta superficie de el electrolito en el capilar, pueden formarse burbujas de aire,
carga es generado por la ionización de los grupos silanol. que provocan fluctuaciones en la línea de base e interrumpir
La carga de la superficie interna del capilar atrae hacia si la corriente eléctrica. Debe evitarse este problema.(16)
iones positivos que forman una capa adyacente fija por Existen distintos modelos de aparatos con sistemas muy si-
adsorción ( capa de Stern ), y una capa difusa y móvil, tam- milares, variando en la cantidad de capilares que funcionan
bién positiva ( capa de Gouy – Chapman ). Los iones de la en forma simultánea. Es un método totalmente automatiza-
capa difusa experimentan una fuerza paralela a la superficie do. Se conocen dos equipos en el mercado*. que emplean
y migran hacia el cátodo al aplicarse una diferencia de po- el principio de electroforesis capilar en solución libre, uno
tencial entre los extremos del capilar. Éstos iones, al estar tiene ocho capilares que funcionan en paralelo, permitien-
sulfatados, generan un movimiento global del flúido hacia do realizar ocho determinaciones simultáneas y 90 en una
el cátodo. Éste movimiento del flúido constituye la fuerza hora y otros trabajan con seis capilares en forma simultá-
electrosmótica (EOF). (14-15) nea.(17)
Figura 2. Diagrama que muestra la dirección del flujo Figura 3. Esquema de un aparato de electroforesis
electrosmótico (EOF). (Jenkins MA.-Clin Apli. of CE- capilar. (Jenkins M A. Clin Aplic of CE.- pag 2.- Human
pag.3-Human Press Inc.1999) Press Inc. 1999)
High
Voltage
Detector
Capilary
Buffer
Recorder
los casos, para introducir la muestra dentro del capilar, se de 200 nm de acuerdo al equipo con el que se trabaja. Éste
cambia el vial de entrada por un vial con muestra y se aplica sistema a pesar de la estabilidad y facilidad de operación,
la inyección de la misma durante 10-30 segundos. Introdu- presenta algunos incovenientes ya que opera a una única
ciendose en el capilar un volumen de muestra del orden de longidtud de onda. La introducción del detector de diodos
los nanolitros. en fila ha resuelto este problema permitiendo adquirir al
En la inyección hidrodinámica , la introducción de la mues- mismo tiempo el espectro de cada uno de los analitos en un
tra en el capilar se efectúa mediante una diferencia de pre- mismo análisis. Una alternativa a la detección UV-Visible es
sión entre los dos extremos de la columna ( es el método la detección de fluorescencia, que es ampliamente utilizada
convencional de inyección). en bioquímica clínica. Otro tipo de detección utilizada por la
Existen diferentes formas de producir una presión superior CE es la electroquímica, los más utilizados han sido los con-
al extremo del capilar en contacto con la disolución de la ductimétricos y los amperométricos.
muestra: por flujo gravitatorio de la disolución electrolítica
mediante la elevación del vial con la muestra y la aplicación
de presión sobre la misma, luego por succión de la mues- PRINCIPIOS DE SEPARACIÓN
tra aplicando vacío al vial de salida. Éste tipo de inyección
no depende de la movilidad electroforética , ni de la com- Flujo electrosmótico (EOF).- En la CE, se desplazan por el ca-
posición de la muestra. El volumen de muestra inyectada pilar bajo la influencia de la corriente eléctrica, las moléculas
se define por las dimensiones del capilar, la viscosidad del de soluto y la solución buffer. Éste es un fenómeno cono-
electrolito, la presión aplicada y el tiempo. Se debe contro- cido como flujo electrosmótico. El polo positivo o ánodo se
lar con presición la temperatura capilar porque puede verse encuentra en el extremo del capilar donde se realiza la inyec-
afectada la viscosidad y variar la cantidad de muestra que ción de la muestra. El EOF va del polo positivo al negativo, de
se inyecta. En gran parte de los instrumentos de CE la di- manera que el buffer se mueve del vial que lo contiene ( el de
ferencia de presión se utiliza, además de para introducir la entrada) hacia el detector, en el vial de salida. La pared del
muestra, para renovar el buffer del capilar, ya que normal- capilar está constituida por un entramado de grupos silanol
mente debe cambiarse luego de un número determinado de , por lo tanto al trabajar con bufferes básicos se encuentra
análisis para conseguir repetibilidad en el tiempo de migra- cargada negativamente con grupos sialonatos, y hace que
ción en las muestras a determinar. las otras cargas positivas libres se situen cerca de las cargas
La inyección electrocinética se basa en que el voltaje puede negativas de la pared formando una doble capa. Al aplicar
causar movimientos electroforéticos y electrosmóticos. Se una diferencia de potencial las cargas libres (positivas y ne-
introduce un extremo del capilar en el vial que contiene la gativas) se moveran hacia los polos contrarios. Las cargas
muestra y el otro extremo en el vial que contiene el buffer, negativas de la pared no pueden moverse dando como resul-
se aplica un voltaje elevado durante un breve período de tado un flujo de cargas positivas hacia el polo negativo.
tiempo. Los compuestos se introducen en el caplilar por la
acción conjunta de la migración y del efecto de la movilidad
electrosmótica. Si el voltaje se aplica durante un un período FLUJO ELECTROFORÉTICO
de tiempo corto, la muestra se introducirá por el movimiento
electroforético. Bajo la acción de un campo electrico, los solutos ionicos se
Diversos investigadores demostraron que por una serie de desplazan a través del capilar : a) por el flujo electrosmotico
fenómenos que produce la inyección electrocinética es me- que arrastra todo el seno de la disolución y b) la carga pro-
nos reproducible que la inyección hidrodinámica. Los límites pia de un soluto hace que éste muestre una movilidad por si
de detección de los compuestos estudiados mediante la in- mismo, a lo que se denomina flujo electroforético. La movili-
yección electrocinética son aproximadamente cinco veces dad electroforética de un soluto es función de su carga, del
más bajos que los conseguidos con la hidrodinámica. radio de la molécula y de la viscosidad del medio. Cuando se
introduce una muestra en el capilar y se aplica una diferen-
cia de potencial, cada uno de sus componentes tendrá una
SISTEMA DE DETECCIÓN movilidad que dependerá de las velocidades electrosmóti-
cas y electroforéticas. (18-19)
La detección se realiza directamente sobre el capilar, es Una vez inyectada la muestra por aspiración en el o los capila-
decir que el mismo capilar actúa como celda de detección. res, se procede a la separación de la misma, aplicando una di-
El tipo de detector escogido dependerá de los analitos a de- ferencia de potencial de varios miles de voltios (≈ 8000), en los
terminar y, siempre que se pueda, se escogerá aquel que extremos de cada capilar. La detección directa de las proteínas
proporcione una sensibilidad elevada para todos los com- se lleva a cabo a 200 nm en el extremo catódico del capilar.
puestos. Las proteínas separadas ( en capilares de sílice fundido)
El detector ultravioleta – visible es uno de los más emplea- son detectadas directamente en una burbuja existente en
dos en la CE. La longitud de onda escogida es de 214 nm, o el capilar por espectrofotometría de absorbancia. Emplean-
¿Que es la electroforesis capilar?
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