Detección de adulteración de carne de cerdo en carne procesada mediante el procedimiento PCR-

QIAxcel específico de la especie basado en los genes D-loop y cytb

Resumen La detección de la degradación de los kilómetros en productos cárnicos "halal" es un

problema civil en los campos de la inspección de alimentos modernos según la implementación de
procedimientos muy estrictos para el etiquetado de alimentos halal. El presente estudio tiene
como objetivo detectar y cuantificar la adulteración del cerdo en embutidos crudos y cocidos. Esto
es mediante la aplicación de un procedimiento optimizado de PCR específico de la especie seguido
del sistema de electroforesis capilar QIAxcel. El experimento de fabricación se diseñó incorporando
porciones con carne de buey a niveles de sustitución de 0,01 a 10% junto a las salchichas de carne
de res y cerdo como controles negativo y positivo, respectivamente. Posteriormente, las salchichas
se dividieron en salchichas crudas y cocidas y luego se sometieron a extracción de ADN. Los
resultados indicaron que las amplificaciones por PCR de los genes del ciclo D mitocondrial y del
citocromo b (cytb) mediante cebadores específicos de porcino produjeron fragmentos de ADN
porkspecifico de 185 y 117 pb en salchichas, respectivamente. No se detectaron fragmentos de
ADN cuando se aplicó la PCR en el ADN de salchicha de carne de vacuno que confirma la
especificidad de los cebadores. Para el control interno, se amplificó el gen a141-
bpDNAfragmentofeukaryotic18Sribosomal RNA (rRNA) de las plantillas de ADN de cerdo y buey.
Aunque la PCR seguida de técnicas QIAxcel o agaros fue eficiente para la diferenciación de
fragmentos de ADN incluso tan bajos como 0.01% (carne de cerdo / carne: p / p). Para el dominio,
la adecuación y el rendimiento, el procedimiento de PCR-QIA es altamente sensible, ahorra
tiempo, está documentado electrónicamente, no contiene reactivos mutagénicos, presenta pocos
errores manuales, es preciso para medir la longitud de los fragmentos de PCR y es proveedor de
datos cuantitativos. En conclusión, se puede sugerir que la PCRQAI optimizada se considera un
método rápido y sensible para la detección y cuantificación rutinaria de carne de cerdo en carne
cruda o procesada.

Palabras clave PCR. Adulteración .Halalprocessedmeat .cytb gene .D-loopgene .QIAxcelprocedure

Introducción

La autenticación de especies, la seguridad de los alimentos y el control de los alimentos son una
preocupación creciente en el mercado mundial actual. Como la carne picada se agrega en la
mayoría de las carnes procesadas (Tanabeetal.2007a; Tanabeetal.2007b), la verificación del
etiquetado de los alimentos debe garantizar la inocuidad de los alimentos (es decir, la aparición
inesperada de alergias), ganar la confianza de los consumidores y promover el comercio justo en
todo el mundo. importante por razones sociales, forenses y de salud pública (Karabasanavar et al.
2014). Dado que casi un tercio de la población humana no come carne de cerdo, incluidos
musulmanes y judíos, las preocupaciones religiosas se están convirtiendo en hechos.
Auténticamente, esta población religiosa conocía la comida sin cerdo como comida "halal". La
creencia religiosa es también otro hecho importante que plantea problemas de preocupación.
Varias religiones suponen algunas restricciones alimentarias. Por ejemplo, la carne de cerdo,
además de la carne no sacrificada ritualmente, está prohibida en el Islam. La carne halal de mayor
valor, como la carne de cordero, es adulterada fácilmente porpordu, debido a su similitud en el
color y la textura. Por lo tanto, no solo afecta a la santidad de los alimentos sino también un fraude
contra el Derechos de los clientes, religiones y creencias (Bonne y Verbeke 2008). El cerdo es una
fuente potencial de adulteración de carnes de mayor valor, como el asado y el cordero, debido a su
similitud en el color y la textura (Wissiack etal.2003). Además, las carnes recuperadas
mecánicamente son cada vez más utilizadas en la industria alimentaria y son propensas a diversas
formas de adulteración del cerdo (Skarpeid et al. 2001). La detección de carne de cerdo en carne y
productos cárnicos requiere técnicas analíticas y de autenticación simples, específicas, sensibles y
confiables (Ali et al. 2012; Che Man et al. 2012; Karabasanavar et al. 2014). En algunos países, el
ADN de cerdo se detecta en varios productos cárnicos halal suministrados a los supermercados a
pesar de estar etiquetados como alimentos certificados por halal (Calvo et al. 2002; Di Pinto et al.
2005; Karabasanavar et al. 2014; Montiel-Sosa et al. al. 2000; Tanabe et al. 2007a; Yusop et al.
2012). La ternera también se sustituye por carne de cerdo debido a su apariencia física (Toorop et
al. 1997). Por lo tanto, la identificación de la adulteración del cerdo en la carne procesada se ha
convertido en una necesidad. Los métodos convencionales de examen de rutina no siempre son
capaces de detectar especies de carne presentes en mezclas procesadas, cocidas y adulteradas. Por
lo tanto, diferentes métodos analíticos basados en características anatómicas, histológicas,
microscópicas, organolépticas, químicas, electroforéticas, cromatográficas e inmunológicas han
sido desarrolladas para diferentes aspectos. Sin embargo, las limitaciones de estas técnicas han
llevado a aplicar las técnicas moleculares basadas en el ADN para el propósito debido a su
sensibilidad, repetibilidad y Reproducibilidad en comparación con otros métodos basados en
proteínas. Además, el ADN es una molécula relativamente estable que permite el análisis de
productos alimenticios procesados y tratados térmicamente. Además, los ensayos basados en
proteínas no pueden diferenciar especies estrechamente relacionadas debido a la reactividad
cruzada (Karabasanavar et al. 2014). Varios ensayos basados en el ADN, a saber, PCR para especies
específicas (Karabasanavar et al. 2011; Kumar etal.2011), polimorfismo de longitud de fragmento
de fragmentación (RFLP) (Alietal. 2012; Girishetal.2005), ADN polimórfico amplificado
aleatoriamente (RAPD) huella digital (Calvoetal.2001), ADN hibridación (Chikuni et al. 1990),
polimorfismo de conformación de cadena única (PCR-SSCP) (Rehbein et al. 1997), PCR mitocondrial
D-loop basada (Che Man et al. 2012; Karabasanavar et al. 2014) y PCR Se ha empleado la
secuenciación de productos (Bartlett y Davidson 1992) para la detección de la falta de
autenticidad. La PCR específica de la especie ofrece una ventaja sobre otros métodos basados en el
ADN en términos de rapidez y especificidad teniendo en cuenta la necesidad de desarrollar una
técnica rápida y robusta para la autenticación del cerdo. Convencionalmente, la electroforesis en
gel se ha utilizado para separar los fragmentos de PCRDN. Sin embargo, este método es laborioso,
lento y peligroso debido al uso de bromuro de etidio o tintes similares que son mutagénicos y
peligrosos para el ser humano. Además, los datos de gel no se pueden usar directamente para la
documentación electrónica o el archivo de datos (Armand et al. 2004; Marois et al.2001). Como un
método alternativo para detectar la adulteración del cerdo en la carne procesada, el presente
estudio se aplicó el sistema de electroforesis capilar QIAxcel, un sistema controlado por
computadora que proporciona documentación electrónica que se usó de manera innovadora en
diferentes aspectos (Matsumoto et al. 2013; McMurray et al.2010; Melake et al. 2012; Mercimek-
Mahmutoglu et al. 2012; Zhang et al. . 2013). Usando el sistema QIAxcel, se analizaron al menos 24
muestras en aproximadamente 30 minutos. La detección mediante electroforesis en gel de
agarosa, que implica más pasos para el manejo y la documentación, requiere al menos tres veces
más. Se detectaron fragmentos de menos de 50 pb con el sistema QIAxcel, pero podrían no ser
visibles con geles de agarosa, lo que reduce considerablemente el valor práctico del gel de agarosa.
Además, el sistema de análisis QIAxcel es más preciso en la medición de la longitud de los
fragmentos de PCR. La identificación de las especies animales de carne como fuente en los
productos cárnicos es un tema importante en el campo de los alimentos modernos en el mercado
mundial (Di Pinto et al. 2005). Por lo tanto, el objetivo principal del presente trabajo es optimizar
un análisis de PCR específico de la especie seguido del sistema QIAxcel que apunta a los genes
mitocondriales de D-loop y cytb para la identificación de carne de cerdo en embutidos cocidos y
procesados de carne de productos. Módulo.Además, 18sribosomalRNA gen como un Se utilizó
control endógeno. Para la inspección de la adulteración y probar la eficiencia del procedimiento, se
diseñó un experimento de fabricación de salchichas que incorporan carne de cerdo a diferentes
niveles de sustitución. Se aplicaron el método convencional y el análisis QIAxcel, se compararon y
luego se optimizó el QIA-PCR.

materiales y métodos

Muestras de carne

Se adquirió una muestra de carne de cerdo cruda fresca (2 kg) en un matadero especial en Qalama,
Gobernación de Qaliuobia, mientras que la muestra de carne fresca (5 kg) y la grasa de cordero (3
kg) se compraron en el supermercado "El-abed", QaliuobiaGovernorate, Egipto. Además, todos los
ingredientes de las salchichas se obtuvieron de un supermercado local de especias "Khedr El-Atar"
en El Cairo, Egipto. Las muestras de carne y grasa de cordero se mantuvieron en estado congelado
a -18 ± 1 ° C hasta su uso para evitar la degradación enzimática del ADN en muestras de carne.

Elaboración de mezclas de carne de vacuno y carne de cerdo.

Las carnes de res y de cerdo se desengrasaron y se molieron manualmente por separado mediante
un molino de carne (SIEMENS, tipo CNCM11ST, Alemania). Posteriormente, la carne de cerdo se
tomó y se mezcló con carne de res para impregnarla en salchicha como 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5 y
10% de carne de cerdo en la carne de res por separado para evitar la contaminación. Carne pura
para control negativo (−C) y pura.

También se prepararon salchichas de cerdo para el control positivo (+ C) (Tabla 1). Las muestras de
carne envueltas y mezcladas se empacaron en bolsas de polietileno y luego se mantuvieron en
condiciones de congelación a -18 ± 1 ° C hasta el inicio de la fabricación de la salchicha.

Fabricación de embutidos

Las diferentes fórmulas de saqueo se prepararon de inmediato de acuerdo con la Tabla 1 como se
describió anteriormente (Moghazy y El-Shaarawy 2001; Moghazy et al. 2004). Cada mezcla de
carne preparada se mezcló con estiércol muy bien mezclado. La harina de soya se rehidrató con
agua destilada como 1: 2 (p / v), luego los otros ingredientes se agregaron gradualmente para
producir diferentes embutidos de carne de res adulterados incorporados por la carne de cerdo.
Finalmente, los copos de hielo se agregaron a la mezcla final y, a continuación, toda la mezcla se
archivó en salmón natural capilar intestino que se preparó en el laboratorio. Posteriormente, cada
lote de salchichas se dividió en dos grupos; uno de ellos se mantuvo fresco, y el segundo se cocinó
en una olla de vapor de vapor húmedo a 100 ° C durante 10 minutos y luego se enfrió. Ambos
grupos de salchichas se almacenaron en condiciones de congelación o se sometieron
inmediatamente a la extracción de ADN.
Extracción de ADN

La extracción total de ADN con 200 mg de cada carne y salchichas bien molidas se realizó con el kit
de tejido y sangre DNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania) según las instrucciones proporcionadas por
el fabricante. La concentración de ADN se estimó mediante análisis espectrofotométrico utilizando
el espectrofotómetro Thermo Scientific NanoDrop 1000 (ThermoScientific, EE. UU.) A una dilución
apropiada de 260 nm / 280 nm, y la integridad del ADN se visualizó mediante tinción con bromuro
de etidio de ADN en gel de agarosa al 1%. Las soluciones de ADN extraídas se almacenaron a 20 ° C
para otras aplicaciones.

Imprimaciones

Un gen de rRNA preservado a141-bp conservado por frentes preservados en el gen del rRNA 18S
de a141-bp conservado por frentes conservados (por ejemplo, por ejemplo, por ejemplo). 2012).
La especificidad de esos cebadores se verificó mediante alineaciones con las secuencias originales
de GenBank utilizando el nucleótido-nucleótido estándar BLAST (disponible en línea por el Centro
Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)). Las secuencias de nucleótidos de los cebadores
usados se dan en la Tabla 2. Los cebadores diseñados se ordenaron de Invitrogen ™, Alemania.

Amplificación por PCR y procedimientos QIAxcel.

Se amplificaron selectivamente fragmentos específicos (185, 117 y 141 pb) de genes de rRNA 18S
en bucle D, cytb y eucarióticos en 25 μl de mezclas de reacción compuestas de 1 x tampón de
reacción de PCR, MgCl2 2 mM, 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq, 400 μM de la mezcla de dNTP,
0.4 μM de cada cebador y 1 μg de ADN de cada muestra extraída. Las condiciones de amplificación
en un Mastercycler (Eppendorf) para D-loop son nuevas: paso inicial de desnaturalización a 93 ° C
durante 3 min, 35 ciclos de amplificación (30 s de desnaturalización a 93 ° C, 30 s de recocido a
58.8 ° C, 45 s de extensión) ° C), y seguido por extensión final a 72 ° C durante 5 min. Forcytb y
eucarióticos genes 18S rRNA, las condiciones de ciclado se precalentaron a 95 ° C durante 10 min,
35 ciclos de amplificación consistentes en (20sofdenaturationat95 ° C, 30sof annealingat61 ° C, y
20sofextensionat72 ° C), y 5minof extensión final a 72 ° C. Se llevó a cabo un control negativo de la
plantilla de la reacción de PCR (mezcla de reacción de PCR sin plantilla de ADN y reemplazado con
agua desionizada esterilizada doble) para asegurar la pureza de la mezcla de reacción de PCR de
ADN contaminante. Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en gel de agarosa
al 2%, luego se tiñeron con solución de bromuros de etidio y se visualizaron bajo luz ultravioleta
(espectrolina de intensidad ultravioleta más alta (modelo TVC-312A) Transiluminador de intensidad
variable 312 nm Ultraviolet, EE. UU.). Por otro lado, el análisis de ADN se realizó en el sistema
QIAxcel (Versión: 9001421, QIAGEN, Alemania) utilizando el kit de alta resolución de ADN QIAGEN
(QIAGEN, No. de Cat. 929002) como el método descrito en el manual de ADN QIAxcel® (OM400). El
marcador de alineación QX 15 bp / 1 kb se incluyó en el análisis. Por lo general, se agregaron 10 μl
de los productos de PCR y el instrumento aspiró 0.1 μl en cada tubo capilar aplicado con 0.1 μl de
marcador de alineación en cada uno de los 12 pocillos de muestra del sistema de electroforesis
capilar QIAxcel. Se inyectó un microlitro de DNAladder 50bp / 800bp en la vejiga en la primera vez
del uso de cartílago (1200 muestras), mientras que el marcador de alineación se inyecta con cada
muestra. Las muestras se mezclaron enérgicamente durante 1 minuto a 2500 rpm y se ejecutaron
inmediatamente en el sistema de electroforesis capilar QIAxcel. La separación se realizó en 30
minutos mediante la aplicación de un alto voltaje (6 kV) en el tamizado utilizando el polímero
suplementado y un tampón especializado en los canales microfluídicos a través de electrodos
independientes para cada pozo. Los resultados se mostraron como imagen de gel y
electroferograma según se obtuvieron del software del sistema avanzado QIAxcel. El análisis de
cuantificación se ha integrado utilizando el software QIAxcel.

Resultados

Aunque el análisis QIAxcel estima que los fragmentos de PCR son cualitativos y cuantitativos (Graf
et al. 2011), el método convencional de agarosa se comparó con el procedimiento QIAxcel. Sin
embargo, una vez que se detectó la adulteración del cerdo, no importa la cantidad de uno mismo
en los productos examinados, ya que se evita el cerdo según la autorización de la carne halal
(Bonne y Verbeke 2008; Che Man et al.2012). Pero el análisis de cuantificación puede esperar el
porcentaje de adulteración en los productos cárnicos procesados.

Detección de carne de cerdo en embutidos crudos y procesados.

Como objetivo principal en el presente estudio, se refiere a la detección de productos de carne

procesados y adulterados según el procedimiento específico de RCP. Para lograr esto, se ha
realizado un experimento de fabricación de sausag de laboratorio. La salchicha fabricada se
impregnó con carne de cerdo en un nivel de sustitución, con un nivel de 0,01 a 10% de salchichas
de cerdo al lado de carne de res pura y salchichas de carne de cerdo como control negativo y
positivo, respectivamente. Posteriormente, las salchichas se subdividieron de manera similar en
grupos diferentes; una vez que se sirvieron, en segundo lugar se lavaron y se enrollaron.
Comúnmente, las salchichas se distribuyen no solo como crudas en estado frío o congelado, sino
también como vapor cocidas o a la parrilla. La cocción se ha realizado para probar la estabilidad de
la placa de ADN y para verificar si la carne de cerdo afecta la detección de productos procesados. El
ADN se aisló de cada muestra de salchicha individual en los grupos crudos y cocidos, se cuantificó y
la pureza se estimó luego se sometió a amplificación por PCR. Los conjuntos de cebadores
diseñados, genes D-loop, cytb y rARN eucarióticos 18S (Tabla 2) se analizaron con ADN extraído.
Posteriormente, el ADN diana se analizó utilizando el método convencional de agarosa. La imagen
de gel de los productos de la PCR, obtenida de las salchichas crudas de carne de cerdo, se mostró
en la Fig. 1. También fue necesario probar el rendimiento de la prueba de la PCR en salchichas
crudas y cocidas para distinguir la contaminación de la carne de cerdo. Los resultados del
tratamiento de cocción y los aditivos de carne comerciales, como las especias, el almidón, las
grasas y los agentes de curado de fuentes extrañas no interfieren en las amplificaciones de la PCR
(datos no mostrados). En este caso, no se han encontrado diferencias obvias entre las muestras de
salchichas crudas y cocidas que demostraron resultados similares, y no se ha encontrado ningún
efecto de las condiciones de cocción en el ADN (rawsausagegelimageswereexemplaryshownin
Fig.1) .Nuestros productos amplificados con∼185, 117, y141bp Están confirmando la estabilidad
sensible de plantillas de ADN de tamaño más pequeño. Del mismo modo, nuestra detección de
PCR convencional no se vio afectada puede ser para confirmar que los tratamientos térmicos
cortos no están influyendo en el ADN de la placa, sino que excluyen las detecciones exitosas (Fig.
1a-c). Los resultados obtenidos reflejaron la sensibilidad, especificidad, estabilidad y confiabilidad
del PCR en el análisis de carne de cerdo en productos procesados. Posteriormente, se obtuvo un
producto PCR claro que se dirigía al gen D-loop a partir de un embutido adulterado con diferentes
niveles de pork, produciendo un fragmento de 5185 pb (Fig. 1a, carriles 3, 4, 5, 6 y 7), mientras que
el análisis de tipos similares de productos de control negativo no arrojó Cualquier producto de PCR
(carril 2). De manera similar, la amplificación por PCR resultó en un fragmento de ∼117 pb cuando
el gen porcino se seleccionó en muestras de salchichas en bruto adulteradas (Fig. 1b, carriles 3, 4,
5, 6 y 7), mientras que no se puede detectar nada en los controles de muestras segregadas (carril
2). El ensayo fue lo suficientemente sensible como para detectar un nivel tan bajo como el 0,01%
de salchichas contaminadas con carne de cerdo en salchichas crudas y cocidas.

Detección de carne de cerdo en embutidos crudos y procesados aplicando el procedimiento PCR-

QIAxcel.

Recientemente, la PCR se ha convertido en una técnica experimental esencial y realizada

diariamente en los laboratorios de análisis de alimentos, bioanalíticos, clínicos y de investigación,
pero todavía no se ha aceptado como método analítico definitivo de métodos analíticos (Yangetal,
2005). En el estudio recurrente, el procedimiento de PCR-QIA se optimizó para detectar carne de
cerdo en productos cárnicos procesados basados en los genes de ARNr, D, ctb y 18SrRNA, datos
que se ilustraron en Figs.2,3 y 4. La amplificación dirigida al gen D-loop exuda un fragmento de 185
pb en todas las muestras de salchicha analizadas analizadas utilizando el sistema QIAxcel (Fig. 2).
No se han encontrado diferencias entre las muestras de salchichas crudas y cocidas. Curiosamente,
la PCR aplicada fue eficiente para detectar tan solo un 0,01% de carne de cerdo en salchichas
crudas y cocinadas de carne de cerdo. Sin embargo, no se ha detectado ningún fragmento de PCR
en el control negativo, según lo confirmado por la especificidad del cebador usado para atacar solo
el gen mitocondrial D-loop de la carne de cerdo como se mencionó anteriormente. El sistema
computarizado QIAxcel también proporciona una señal de banda de fragmento para cualquier
banda detectable que muestra la respuesta de las unidades fluorescentes relativas a la intensidad
de la banda como se muestra en la Fig. 2a, b. Por otro lado, la amplificación dirigida al gen cytb
exuda un fragmento de 117 pb en todas las muestras de salchichas analizadas que fueron
analizadas por el sistema QIAxcel como se muestra en la Fig. 3. Es interesante que la PCR aplicada
fue eficiente para detectar tan bajo como 0.01% Carne de cerdo en salchichas crudas y cocidas.
Además de eso, ningún fragmento de PCR se ha encontrado en el control del control que no
contiene carne de cerdo. Una señal aparente en un conjunto de dos es una intensidad de banda
que se muestra en las unidades fluorescentes y de cocción proporcionadas por QIA en el sistema
de la figura 3a, b. Como control positivo, se amplificó un gen rRNA18S de 141 pb de todas las
especies, lo que demuestra la presencia de moldes de ADN de buena calidad en todas las
muestras. Obviamente, el análisis de alineación de los cebadores endógenos demostró un 100% de
coincidencia con el gen ARN de 1818 de la especie animal. Como se esperaba, la cantidad de ADN
eucariótico no cambió con la variación deliberada de la adulteración de la carne de cerdo y la
amplificación homogénea del control endógeno se registró en las muestras. Este resultado podría
reflejar el nivel de potencial de hibridación del cebador que muestra significativamente la
eficiencia en la amplificación de la PCR. Nuestros resultados indicaron que la PCR optimizada
seguida del análisis QIAxcel fue rápida, eficiente y práctica, y proporciona documentación
automática y datos de cuantificación en comparación con el análisis de los productos de la PCR
mediante gel de agarosa convencional. Los datos cuantitativos (ng μl − 1) de todos los productos
de PCR, integrados en el software QIAxcel, se muestran en la Tabla 3.

Los productos de PCR obtenidos de D-loop y cytb desde el nivel de adulteración de cerdo de 0.01 a
10% tanto en salchichas crudas como procesadas se pueden detectar en un electrocardiograma
(Fig. 2a, banda 3a, b), y en la cuantificación de datos de la caja de valores de la caja de seguridad.
Aumento de nivel de sustitución de nivel. La cantidad de ADN detectada en función del ADN
basado en el gen del bucle D fue mayor que el ADN del fragmento de cerdo detectado en base al
gen cytb (Tabla 3). La probabilidad de detectar la adulteración del cerdo, tan baja como del 0,1 al
10% en la salchicha de res, alcanzó el 83%, ya que se mostró una pequeña variación en los
productos de la PCR. Por lo tanto, se detectó de manera robusta entre el 0,1 y el 10% de la
adulteración de la carne de cerdo en un fondo de salchicha de res, ya que se encontró poca
variación en la cantidad de productos de la PCR. Una gráfica de los productos de la PCR contra la
salchicha de res adulterada con carne de cerdo (%) mostró un ajuste exponencial para los
productos de la PCR D-loop (185 pb) y cytb (117 pb) con R2 = 0,97, Fig. 5. Recocido exitoso de
cebadores endógenos 18S El ARNr con la plantilla eucariótica exuda amplificación homogénea en
todas las muestras. El ADN promedió 1.03 ng μl − 1 en todos los niveles de adulteración de carne
de cerdo de salchichas crudas y procesadas. Sin embargo, una gráfica de liner de productos de PCR
del gen 18S rRNA eucarióticos contra las salchichas de carne de vacuno adulteradas con carne de
cerdo (%) respaldaba enérgicamente la expectativa teórica (Fig. 5).

Discusión

La rápida urbanización e industrialización han llevado a promover productos alimenticios listos

para el consumo, incluida la carne y sus productos. Sin embargo, muchos autores demostraron que
los ensayos de PCR son suficientes para rastrear la carne de cerdo en productos cárnicos mixtos y
comerciales en diversas condiciones de procesamiento utilizando genes específicos de la especie
(Ali et al. 2012; Che Man et al.2012; Karabasanavar et al. 2014; Kesmen et al. al.2007; Mane et al.
2013;; Tanabe et al. 2007a; Tanabe et al. 2007b; Yusop et al. 2012). Los resultados obtenidos
indicaron claramente que el tratamiento de cocción de salchichas no interfiere en la amplificación
de la PCR de los genes de rata de cerdos D-loop, específicos de cytb o eukoryotic18S. Como se
mencionó anteriormente, el tamaño del fragmento de los genes actuales es de 185, 117 y 141 pb,
respectivamente, que parecen ser pequeñas en plantillas de tamaño. Nuestros resultados
estuvieron de acuerdo con Hird et al. (2006), quienes observaron un poco o ningún efecto de
autoclavado u otros métodos de cocción en las plantillas de 81 y 116 pb del gen cytb de pavo. Por
el contrario, Ali et al. (2011) mostraron que un fragmento de 411 pb del gen de ARNr 12S rRNA no
se amplificó cuando el cerdo se autoclavó extensamente durante 2,5 h. Estos estudios
demostraron claramente que los pequeños modelos se combinan para que se establezcan las
largas hormonas. Sin embargo, los mismos autores observaron un tremendo salto de los valores de
punto de cruce (TC) de menos de 20 a más de 30 en la carne de pavo enlatada y enlatada al
cambiar el tamaño de la plantilla de 351 a 565 pb. Como un valor de CT más alto indica una
eficiencia de PCR más baja (Rojas et al. 2010; Yusop et al. 2012), sus estudios reflejan claramente la
tasa más alta de degradación de la plantilla más larga que las más cortas al procesar los
tratamientos. Curiosamente, la PCR optimizada fue capaz de detectar la carne de cerdo en
productos cárnicos procesados como se muestra en el estudio actual. Realmente, tan bajo como
0.01% de cerdo en carne de res.

se detectó mediante PCR optimizada utilizando los geneprímeros D-loop y cytb seguidos por la
convención y el procedimiento de tratamiento. Nuestros resultados están de acuerdo con Ali et al.
(2012) quienes detectaron una baja contaminación porcina a niveles de 0.1 y 0.01% al atacar el gen
porcino producen productos de PCR (109 pb) y encontraron un nivel igual de amplificación del
control endógeno (141 pb). Por otra parte, Che Man et al. (2012) confirmaron que el cebador
específico porcino diseñado en base a una secuencia específica porcina del gen mitocondrial D-
loop (174 pb) se usó para detectar carne de cerdo en productos cárnicos procesados. El ensayo fue
capaz de detectar un ADN porcino, adicto al ganado, ovino, caprino, gallinero y venado porcino tan
bajo como 0,1% (v / v). Se ha establecido la reacción en cadena de la polimerasa dúplex para la
detección de carne de cerdo en salchichas frescas de carne de caballo de fuentes minoristas
italianas (Di Pinto et al. 2005). Se diseñaron cebadores específicos y sondas TaqMan basadas en los
genes mitocondriales ND2, ND5 y ATP 6-8 para burro, cerdo y caballo, respectivamente. Se
optimizó un ensayo de RT-PCR conveniente, sensible y específico para la identificación de especies
y su cuantificación en productos de carne de res y cocida (Kesmenetal. 2009). El gen mitocondrial
D-loop se usó para detectar la adulteración del cerdo (hasta 0.1%) en muestras de carne cruda y
cocida junto con una sensibilidad aceptable de 10 pg (Che Manetal.2012; Karabasanavaretal.2014;
Maneetal.2013). Con respecto a la separación y visualización del ADN utilizando un procedimiento
de agarosa convencional, varios factores adicionales podrían afectar la movilidad de los fragmentos
de ADN en geles de agarosa como se mencionó anteriormente (Olive et al. 1992). Entre estos
factores se encuentran (1) la concentración de gel, (2) el voltaje utilizado, (3) el tampón de
electroforesis y (4) los efectos del bromuro de etidio. Esos factores mencionados afectan los
resultados de la PCR, que pueden causar resultados variados que demostraron los diferentes
laboratorios. Por lo tanto, se necesita un procedimiento sostenible para obtener resultados de PCR
con factores ignorables. El sistema de electroforescapilar de QIAxcel podría ser la instalación
perfecta para analizar los productos de PCR de una manera sistemática que proporciona
documentación automática, resultados rápidos, sensibles y reproducibles, así como datos de
cuantificación. Además, la aplicación del procedimiento PCR-QAI podría proporcionar una opción
para cuantificar el ADN detectable según se optimizó en el presente estudio. Fue eficiente rastrear
tan bajo como 0.01% de cerdo en un rango detectable de ambos genes específicos de especies
aplicados. Este estudio confirmó que la detección de la aduana comenzó a partir de un 0,1% de
carne de cerdo era muy probable. Sin embargo, la detección de un 0,01% de cerdo fue solo un 83%
probable. En los productos de la PCR se comparan las partes de los objetos de los animales de
compañía. La instalación de cuantificación presentada en el estudio actual podría ser útil para
esperar los niveles de adulteración del cerdo. De manera similar, Alietal. (2012) usó PCR ensayó
para evaluar productos cárnicos mixtos y comerciales utilizando cebadores específicos de especies
para el control endógeno y genes cytb, seguido de un simple análisis de polimorfismo de longitud
de fragmentos de restricción, RFLP. La sustitución de la electroforesis en gel por un CE
automatizado y sensible basado en chip fue lo suficientemente práctica como para ser sensible
para detectar 0,0001 ng de ADN porcino y un 0,01% de mezcla de porcina, carne de res y flúor.
Además, Grafetal. (2011) diferenciaron entre 14 especies exóticas diferentes y compararon los
resultados del análisis del sistema QIAxcel y de la electroforesis en gel de agarosa. Basado en otros
resultados (2011), el ensayo se basa en una buena capacidad de aplicación por parte de los
laboratorios de control de calidad y, al mismo tiempo, no es necesario utilizar el método químico
de inyección de riesgos. pasos, ahorrando tiempo para trabajos de laboratorio más exigentes y
reduciendo los errores manuales, como lo mencionó Xiao et al. (2012). Más aún, el procedimiento
de PCR-QAI proporciona una cali- dad y una combinación de datos que pueden ser aplicables para
el archivo y manejo. Finalmente, los resultados concluyentes de la combinación de la PCR con el
sistema de electroforesis capilar QIAxcel denominado "PCR-QAI" se optimizaron para usarlos en
lugar de usar la PCR, seguido de la electroforesis en gel de agarosa convencional, análisis de
detección y clasificación en productos de carne halal procesados.

En conclusión, un ensayo PCR-QAI confiable, preciso, sensible y fácil de realizar fue optimizado con
éxito para el análisis de rutina de la adulteración de cerdo en carne procesada. El ensayo utilizó
cebadores específicos de la especie para los genes de rRNA 18S eucariota y de D-loop, cytb. El
rendimiento de PCRQAI se probó mediante un modelo de experimento de fabricación que
simulaba productos cárnicos, por ejemplo, salchichas con carne de cerdo cruda y cocida
adulterada. Curiosamente, el protocolo de PCR optimizado fue suficiente y lo suficientemente
sensible como para detectar un 0,01% de carne de cerdo en la carne. Además, consumió menos
tiempo, proporcionó documentación electrónica, eliminó la exposición a reactivos mutagénicos,
redujo los errores manuales, precisó la medición de la longitud de los fragmentos de PCR y
proporcionó datos de cuantificación. Por lo tanto, se puede sugerir que la PCRQAI optimizada se
considera un método rápido y sensible para la detección y cuantificación rutinaria de la carne de
cerdo en productos cárnicos crudos o procesados. Se recomienda encarecidamente la aplicación
de esta técnica por parte de laboratorios oficiales y de control de calidad para la autenticación
halal por razones religiosas.