Micropropagación

Una alternativa a la macropropagación (propagaciones masivas) es aplicar la técnica de

micropropagación que consiste en tomar células o tejidos de la planta, preferiblemente
de origen meristemático, que se encuentran en las yemas.
Lo que se hace en el laboratorio es programar esas células para que formen tallos.
Luego, se multiplican esos tallos y se aplica un programa de enraizado, es decir, se
cambian las condiciones hormonales para que forme raíz. Una vez que la planta está
completa y que puede absorber nutrientes por raíz, se lleva a un invernadero (MEDINA,
2005).
La micropropagación se relaciona con la multiplicación de un genotipo específico sin
que se presente segregación de caracteres genéticos. A menudo incluso se le relaciona
con la propagación de determinadas plantas a un precio competitivo, como técnica de
intensificación de la producción de material vegetal (SEEMANN, 1993).
Según HARTMANN et al. (2002), debido a que la técnica de cultivo de tejidos in vitro
se desarrolla dentro de un frasco de vidrio o plástico transparente, bajo condiciones de
control ambiental y utilizando un medio formulado para el buen desarrollo de los
explantes, es que se denomina in vitro.
Según SEEMANN (1993), el cultivo de tejidos in vitro tiene una amplia gama de
aplicaciones, de acuerdo al objetivo que se desee lograr, e implica, en forma más
amplia, la utilización de células, tejidos u órganos, genéticamente denominados
explantes, de las más diversas procedencias dentro de la planta. Las técnicas de cultivos
asépticos han contribuido no sólo a un mejor entendimiento de los eventos de la
diferenciación celular, sino a un mejor aprovechamiento de tales eventos en la
explotación más eficiente de las plantas. Estos son la obtención de plantas libres de
virus y otros patógenos, mejoramiento genético, introducción de especies y variedades,
conservación de germoplasma y propagación masiva de especies (SEEMANN, 1993).
Por lo tanto, la micropropagación permite la reproducción de miles de plantas por metro
cuadrado y tiene la ventaja de que si el ejemplar parental es sano, todas las plantas que
se originen a partir de él, son sanas. Además, permite obtener descendencia
genéticamente similar. Esto asegura la homogeneidad de la producción (MEDINA,
2005).
En la actualidad la micropropagación se está aplicando con gran éxito en una gran gama
de cultivos hortícolas, ornamentales, frutales y forestales, sin dejar de lado la aplicación
de estas técnicas en cultivos extensivos de los que se ha seleccionado genotipos
superiores de los cuales es necesario contar con gran número de plantas idénticas
(SEEMANN, 1993).
1.1 Ventajas y desventajas de la micropropagación
De acuerdo con GEORGE y SHERRINGTON (1984) y SEEMANN (1993), la
micropropagación es una técnica que ha mostrado importantes ventajas en comparación
con los métodos convencionales de propagación en algunas especies. Estas ventajas se
pueden resumir como sigue:
• Incremento acelerado del número de plantas derivadas por genotipo.
• Reducción del tiempo de multiplicación.
• Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie reducida, a
bajos costos y en tiempos económicamente rentables.
• Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga.
• Facilidad para transportar el material in vitro de un país a otro con menos restricciones
aduaneras.
• Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual sólo existan pocos
individuos.
Sin embargo, según HARTMANN et al. (2002), la micropropagación a escala comercial
posee características particulares que podrían crear problemas y por ende limitan su uso.
Estas desventajas se pueden resumir como sigue:
• Requerimiento de costoso y sofisticado material de trabajo, entrenamiento del personal
y especialización técnica.
• Alto costo inicial de las labores.
• La contaminación puede causar altas pérdidas en corto tiempo.
• Se requiere un volumen alto, más o menos continuo en el sistema de distribución de
materiales e insumos.
1.2 Fases de la micropropagación
El cultivo in vitro presenta cuatro etapas bien marcadas, estas son: Establecimiento del
material en un medio aséptico, multiplicación del material vegetal, enraizamiento y
ambientación de las plantas a las condiciones ambientales normales (GEORGE y
SHERRINGTON, 1984; SEEMANN, 1993).
Según HARTMANN et al. (2002), para el establecimiento del material vegetal en un
medio aséptico, se debe tener en cuenta tres distintos factores, estos son: esterilización,
explantes y medios de cultivo.
1.2.1 Esterilización.
Una porción de la planta ordinaria recién aislada está asociada a hongos, bacterias o
ambos. En consecuencia, el requisito inicial en las preparaciones de micropropagación
es eliminar esos microorganismos. Las condiciones en el medio de cultivo son tan
favorables para los microorganismos, que la porción separada de la planta puede ser
destruida con rapidez por cualquier organismo contaminador (HARTMANN et al.,
2002).
El material vegetal extraído de la planta madre debe ser lavado en agua corriente para
eliminar restos de polvo y contaminantes más gruesos. A continuación, es conveniente
usar agua destilada con unas gotas de un detergente o un producto tenso activo para
romper la tensión superficial y permitir una mejor penetración de los productos
esterilizantes. Las demás etapas de la esterilización se llevan a cabo bajo ambiente
estéril en una cámara de flujo laminar. Se utiliza una solución de etanol al 70%, en la
cual permanece el tejido por un tiempo corto, 5-30 segundos para tejidos herbáceos. A
continuación, se utiliza el esterilizante propiamente tal, cuya concentración y tiempo de
tratamiento varían según el producto a usar y el explante a esterilizar. Algunos
productos comúnmente usados son hipoclorito de calcio, hipoclorito de sodio, peróxido
de hidrógeno, agua de bromo, nitrato de plata, cloruro de mercurio y antibióticos.
Finalmente, es necesario remover los esterilizantes de la superficie del tejido, para lo
cual se procede a lavarlo 2 a 3 veces consecutivas con agua destilada estéril
(SEEMANN, 1993).
PATI et al. (2005), utiliza, para la esterilización inicial de los explantes de rosa, etanol
70% por 20 a 30 segundos, seguido de una solución de 0,1% de HgCl2 por 5 a 7
minutos y un lavado con agua destilada. Luego se usa una solución de hipoclorito de
sodio al 5,25% de ingrediente activo y Triton X 0,1% por 5 a 10 minutos, seguido de un
lavado con agua destilada. Además, se puede preparar una solución para una
desinfección interna a base de diferentes antibióticos (tetraciclina, amoxicilina,
gentamicina o ampicilina) a distinta concentración y duración.
1.2.2 Explantes.
El éxito en el cultivo in vitro está en parte influenciado por factores inherentes al
explante, incluido el tamaño, la edad fisiológica, la fuente del órgano o tejido y el
genotipo (CONGER, 1981).
Tanto el estado fisiológico como sanitario de la planta que da el explante (planta
donante) influyen significativamente en su capacidad morfogénica. Se ha encontrado,
por ejemplo, que los requerimientos nutricionales y hormonales difieren cuando los
tejidos provienen de plantas en diferentes edades fisiológicas (ROCA y MROGINSKI,
1991). Asimismo, se ha observado que la edad fisiológica del explante tiene gran
influencia en la morfogénesis. Se sabe que mientras más joven y menos diferenciado
esté el tejido que se va a sembrar, mejor será la respuesta in vitro (ROCA y
MROGINSKI, 1991).
La posición relativa de las yemas es otro factor importante, ya que se ha observado que
las yemas axilares de las rosas obtenidas de la parte media del tallo, se desarrollan más
rápidamente que aquellas obtenidas de la base (ROCA y MROGINSKI, 1991).
MEDEROS y ENRIQUEZ (1987), indican que el material extraído de maderas blandas,
desde la parte media hacia arriba de la planta, presentan mayor respuesta en los cultivos
in vitro que el material proveniente de maderas duras (material lignificado de la base).
El tamaño del explante es otro aspecto que se debe tener en cuenta para el
establecimiento de un cultivo. Frecuentemente existe un tamaño óptimo para los
explantes usados para iniciar un cultivo de tejidos. Explantes muy pequeños, ya sea
bordes o meristemas, fragmentos enteros de tejidos de plantas o piezas de callos, no
sobreviven bien en cultivos, y por el contrario, el uso de explantes grandes puede traer
consigo la dificultad de realizar una desinfección efectiva (GEORGE y
SHERRINGTON, 1984).
Los factores físicos también juegan un rol determinante en el establecimiento de los
explantes.
La luz y la temperatura han sido factores ampliamente estudiados (ROCA y
MROGINSKI, 1991).
La incubación de los explantes se hace en una sala ad hoc que debe ser de acceso
restringido. El área de incubación debe proporcionar condiciones adecuadas en cuanto a
temperatura, luz y humedad relativa (SEEMANN, 1993).
La intensidad lumínica por lo general fluctúa desde 1000 a 5000 Lux y va a depender de
la cantidad y calidad de tubos fluorescentes instalados en la repisa (SEEMANN, 1993).
Según HORN (1992), la intensidad de la luz juega un rol muy importante en el
crecimiento satisfactorio de los explantes, además nos indica que, la intensidad debe
fluctuar entre 1000 y 3000 Lux para el éxito en los cultivos de rosas. KHOSH-KHUI y
SINK (1982), indican que si se aumenta la intensidad lumínica por sobre los 3000 Lux
hace que disminuya el porcentaje de enraizamiento de los explantes de rosa.
En cuanto a la temperatura MARGARA (1988), señala que la micropropagación se
puede llevar a cabo entre rangos de 22 a 25°C durante el período de luz, y de 15 a 18°C
en el período de oscuridad. LEYHE y HORN (1994), indican que la temperatura ideal
para la micropropagación de diferentes cultivares de rosas es 21°C. Sin embargo,
existen muchos estudios que indican que la temperatura óptima es alrededor de 25°C,
para los explantes de rosas (HORN, 1992; CARELLI y ECHEVERRIGARAY, 2002),
aunque RAHMAN et al. (1992), obtuvo excelentes resultados con temperaturas
cercanas a los 28°C.
El fotoperíodo es otro aspecto importante, este debe ser regulado con exactitud,
evitando influencias del fotoperíodo natural, por lo que la sala de incubación no debe
poseer ventanas. Usualmente el fotoperíodo se regula a 12-16 horas (SEEMANN,
1993). DAVIES (1980), indica que la respuesta de los microcultivos de rosa es superior
con 16 horas luz que con 8 horas luz, además, esta luz debe ser fluorescente o blanca.
Según HARTMANN et al. (2002), la humedad relativa dentro del cuarto de incubación
debería fluctuar entre 70-80%. Valores más bajos, a menudo producen una desecación
del medio de cultivo.
En cuanto a la concentración de CO2, WOLTERING (1990), indica que es un factor
importante en la micropropagación, ya que, si se aumenta la concentración a 5% y se
baja la intensidad luminosa, se presenta un efecto positivo en el crecimiento de las
plantas.
De acuerdo a GEORGE y SHERRINGTON (1984), la producción de plantas desde
brotes ha probado ser el método más aplicado y más seguro para propagación in vitro.
Este tipo de propagación in vitro presenta dos metodologías usadas, el cultivo de yemas
apicales y axilares, y el cultivo de nudos individuales. El cultivo de yemas apicales y
axilares corresponde al método comúnmente usado para micropropagación comercial in
vitro. El explante usado para comenzar los cultivos de este tipo son yemas apicales o
laterales las cuales pueden medir más de 20 mm. de largo (GEORGE y
SHERRINGTON, 1984). El cultivo de nudos individuales es otra de las técnicas in vitro
que puede ser usada para propagar plantas desde yemas axilares. Este modelo se utiliza
en plantas con brotes que poseen una alta dominancia apical. Brotes largos son cortados
con un nudo individual para posteriormente ser sembrados en forma vertical en el
medio. Las yemas axilares de cada nudo elongan y crecen en longitud. Este modelo se
repite por nuevos cortes en el segmento y su posterior subcultivo (HARTMANN et al.,
2002). LI et al. (2002), indica que el mejor material para la micropropagación de rosa es
el proveniente de los meristemas axilares de la planta. Además, se encontró que el uso
de ácido abscísico en una concentración de 3.8 a 7.6 µmol/L, es el que mejor promueve
la proliferación e inducción de embriogénesis somática. PATI et al. (2005), indica que
para la propagación in vitro de rosa se pueden usar diferentes explantes, tanto
meristemas axilares y apicales, brotes laterales y ápices.
1.2.3 Medios de cultivo
El éxito del cultivo in vitro es altamente influenciado por la naturaleza del medio de
cultivo usado. Para un crecimiento sano y vigoroso, las plántulas necesitan tomar del
medio iones inorgánicos (macro y micronutrientes), carbohidratos (usualmente
sacarosa), vitaminas, aminoácidos y fitohormonas (GEORGE Y SHERRINGTON,
1984).
1.2.3.1 Macro y micronutrientes
Los macroelementos indispensables en un medio de cultivo son nitrógeno, fósforo,
potasio, azufre, calcio y magnesio, los cuales intervienen en la conservación de los
equilibrios iónicos de las plantas (MARGARA, 1988).
Los microelementos son esenciales en los mecanismos enzimáticos como activadores o
constituyentes de las coenzimas. Los principales son: hierro, cobre, zinc, manganeso,
molibdeno, boro y cloro (ROCA y MROGINSKI, 1991).
MARTIN et al. (1981), indica que, aumentando las concentraciones de Ca, Mg, Fe y
Mn en el medio, se puede observar una positiva respuesta en la calidad de los explantes.
1.2.3.2 Vitaminas y aminoácidos.
Estas sustancias son efectivas en pequeñas cantidades y actúan como factores de la
división celular o del crecimiento (MARGARA, 1988). Los medios de cultivo
generalmente contienen variadas vitaminas, tales como el ácido nicotínico, piridoxina,
inositol, ácido pantoténico, biotina, pero la única, según SEEMANN (1993), que ha
probado ser un componente esencial de varios medios de cultivo es la tiamina (Vit.B1).
Además de vitaminas, se incorporan aminoácidos a los medios de cultivo, siendo la
glicina la que más se utiliza (ROCA y MROGINSKI, 1991).
1.2.3.3 Reguladores de crecimiento.
Generalmente es necesario agregar una o más sustancias reguladoras, frecuentemente
auxinas y/o citoquininas, pero a veces también giberelinas, acido abscísico o etileno,
para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro de tejidos y órganos (MARGARA, 1988).
El requerimiento de estas sustancias, sin embargo, varía considerablemente con el tejido
a usar para micropagar y depende fundamentalmente del nivel endógeno de
fitohormonas naturales (SEEMANN, 1993).
Según MURASHIGE y SKOOG (1962), la iniciación de raíces y brotes en las plantas,
se encuentra regulada básicamente por la interacción entre auxinas y citoquininas.
Aunque ambas hormonas son necesarias para el crecimiento de tejidos in vitro, el tipo
de organogénesis que se presenta se encuentra relacionada o determinada por la
concentración relativa de estas dos sustancias en el medio de cultivo. Así una relación
auxina-citoquinina menor a uno favorece la brotación, mientras que si es mayor a uno se
induce el enraizamiento de los explantes (MURASHIGE y SKOOG, 1962).
1.2.3.3.1 Auxinas. Son un grupo de fitohormonas que tienen la capacidad de producir
un agrandamiento y alargamiento celular, y al mismo tiempo, promueven la división
celular en el cultivo de tejidos. Además, promueven la dominancia apical o inhibición
del desarrollo de las yemas laterales por la yema apical (ROCA y MROGINSKI, 1991).
Las auxinas más utilizadas son el ácido indolacético (AIA), ácido naftalenacético
(ANA), ácido indolbutírico (AIB), 2,4-D y 2,4,5-T. De estas auxinas la que presenta
mayor actividad en la formación de órganos es la AIA, pero es la más inestable frente a
factores del medio como luz y temperatura (MURASHIGE y SKOOG, 1962). El ácido
indolacético (AIA) además de presentar la ventaja de ser natural, es el único que posee
el menor efecto inhibitorio en la formación del tallo. Por otro lado, el ácido
naftalenacético (ANA) es una auxina fuerte, muy estable y se utiliza especialmente para
promover la rizogénesis (MARGARA, 1988).
VIJAYA et al. (1991), en un estudio hecho en rosas, concluyó que la auxina, en
combinación con la citoquinina BAP, que presenta mejores porcentajes de
establecimiento y enraizamiento es el ácido naftalenacético (ANA) en concentraciones
de 0.0 a 0.5 mg/L, en comparación con AIA y AIB.
1.2.3.3.2 Citoquininas. Dentro de las citoquininas más utilizadas se encuentran la
bencilaminopurina (BAP), dimetilalilaminopurina (2iP), kinetina (KIN) y zeatina (ZEA)
en concentraciones comprendidas entre 0,01- 3 mg/L, según el tipo de desarrollo que se
desee inducir (MURASHIGE y SKOOG, 1962). Las funciones destacables de las
citoquininas son la estimulación de la división celular, la inhibición de desarrollo de
raíces laterales, el rompimiento de la latencia de yemas auxiliares, retrasan la
senescencia o envejecimiento de los órganos vegetales y promueven la organogénesis
en los callos celulares (ROCA y MROGINSKI, 1991).
Para estimular una proliferación de tejidos en los cultivos se utiliza frecuentemente una
baja concentración de citoquininas, por el contrario, si se utiliza una elevada
concentración, se favorece a la proliferación in vitro de meristemas axilares en cultivo
de ápices y para reprimir la obtención de macollos de yemas (MARGARA, 1988). Si se
utiliza una concentración moderada de citoquinina, esta favorece a la formación de
nuevas yemas sobre callos (MARGARA, 1988). Según HASEGAWA (1980), la
incorporación de BAP al medio, en una concentración entre 0,1 y 10 mg/L, es esencial
para el inicio del enraizamiento.
1.2.3.3.3 Giberelinas. Existen varios tipos de giberelinas, siendo las más comunes las
GA1, GA3 GA4 GA7 y GA9. En la planta cumplen variadas funciones, como por
ejemplo biorregulador esencial en la organización de tejidos, reprimiendo los procesos
de formación de callos y la iniciación de órganos en algunos casos (MURASHIGE y
SKOOG, 1962). Otras funciones destacables de las giberelinas según MARGARA
(1988), son el incremento en el crecimiento de tallos, la inducción de la brotación de
yemas, interrumpen el periodo de latencia de las semillas y promueven el desarrollo de
los frutos.
1.2.3.4 Carbohidratos
Muy pocos cultivos in vitro son autótrofos, y por lo tanto es necesario agregar al medio
una fuente de carbono. La sacarosa (2-5%) es el azúcar más utilizado ya que es el más
fácil metabolizable por las plantas y se puede reemplazar por glucosa y en menor
medida por fructosa (ROCA y MROGINSKI, 1991; SEEMANN, 1993).
DAVIES (1980), experimentó con porcentajes de sacarosa en el medio entre 2 y 8%, y
concluyó que las mejores respuestas de los explantes, en cuanto a enraizamiento, fueron
con concentraciones entre 4 y 5% en siete variedades de rosas. PATI et al. (2005),
indica que la concentración del 3% de sacarosa en el medio de cultivo, aumenta el largo
y número de raíces de las plantas de rosa.
1.2.3.5 Agentes gelificantes
La mayoría de los medios utilizados incluyen un gelificante que impida que el explante
se sumerja en el medio. Generalmente se utiliza agar-agar en concentraciones de 6-8 g/L
o Gelrite en concentraciones de 1,5-3 g/L (SEEMANN, 1993). En general, las
sustancias nutritivas empleadas en los medios de cultivo, son gelificadas con agar, el
cual forma un complejo coloidal con débil poder de retención iónica (MARGARA,
1988). Según IBRAHIM (1994), el agar-agar es el agente gelificante más utilizado en
los cultivos in vitro, ya que presenta numerosas características deseables, las cuales son,
claridad, estabilidad y ser un agente inerte.
1.2.3.6 pH del medio de cultivo
SEEMANN (1993), indica que el pH se debe regular antes de adicionar el gelificante, y
debe estar entre los valores 5 y 6,5, debido a que los valores menores o mayores pueden
detener el crecimiento del explante. Una vez ajustado el pH del medio, este sufrirá una
ligera acidificación durante el proceso de esterilización en autoclave, además, el medio
durante el transcurso de los días sufrirá una acidificación progresiva como resultado de
la absorción de algunos componentes del medio, así como de la excreción de exudados
por parte del explante, pudiendo producir así la licuación del medio de cultivo
(GEORGE y SHERRINGTON, 1984).
1.2.4 Problemas en micropropagación
Tanto el establecimiento de cultivos in vitro, como su posterior propagación clonal,
están afectados en la práctica por problemas que reducen drásticamente las
posibilidades de éxito. Algunos de éstos son: pardeamiento de explantes y medio, y
vitrificación (SEEMANN, 1993).
1.2.4.1 Pardeamiento. Tanto los explantes como el medio de cultivo de algunas
especies, sobre todo leñosas, una vez puestas en cultivo in vitro, tienen la tendencia a
manifestar un pardeamiento que, en forma extrema, lleve a la muerte de los explantes.
Este pardeamiento se produce por acción de enzimas oxidasas y las tirosinasas, que se
liberan al herirse los tejidos. La inhibición del crecimiento de los explantes, por otro
lado, ocurre por la oxidación de los fenoles y la consecuente formación de compuestos
quinónicos, altamente activos. Algunas de las medidas para prevenir el pardeamiento
son:
• Lavado de explantes por 2 a 24 horas antes de la siembra.
• Absorción de fenoles con carbón activado (3-5 g/L) o polivinilpirrolidona (0,5- 2%
PVP) de alto peso molecular.
• Incorporación al medio de Glutatión reducido (200 mg/L), Feniltiourea (15-20 mg/L)
o L-cisteína (10-50 mg/L). Esto es para reducir el potencial redox del medio.
• Disectar el material vegetal en agua destilada estéril, en agua de coco o cultivando en
medio líquido estacionario por unos días. Con ello se logra reducir la disponibilidad de
oxígeno y por lo tanto, la oxidación de fenoles.
• Usar sustancias antioxidantes, como ácido cítrico (150 mg/L) o ácido ascórbico (100-
150 mg/L) (SEEMANN, 1993).
1.2.4.2 Vitrificación. Es un desorden fisiológico que se presenta en ciertas especies
herbáceas y algunas leñosas, caracterizado por el desarrollo de tejidos traslúcidos,
hiperhidratados y suculentos, producto de condiciones poco adecuadas del cultivo. El
fenómeno se manifiesta principalmente en las hojas, afecta a los procesos de fotosíntesis
e intercambio gaseoso. La responsabilidad de estos fenómenos puede atribuirse a un
exceso de humedad, especialmente en cultivos en medio líquido, un exceso de factores
nutricionales, altos niveles de reguladores de crecimiento y baja intensidad lumínica.
Los factores claves de la vitrificación parecen ser la humedad relativa y el potencial
hídrico dentro del frasco de cultivo. El problema puede ser disminuido en la práctica
mediante las siguientes medidas de manejo:
• Incrementando la concentración de agar y/o sacarosa en el medio de cultivo o
reemplazando parcial o totalmente el uso de Gelrite por agar.
• Regulando los niveles de citoquinina. Altas concentraciones de ésta a menudo
incrementan el problema.
• Aumentando la intensidad lumínica.
• Cambiando el medio de cultivo por otro de diferente composición o reduciendo la
concentración de éste.
• Usando medios de cultivo de dos fases, en los cuales se establece primero una fase
sólida, que posteriormente se cubre con medio líquido.
• Mejorando el intercambio gaseoso del frasco de cultivo por medio del uso de
diferentes sistemas de cubierta de éstos (SEEMANN, 1993).