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Exposición de biotecnología vegetal
 Cervantes Huamaní, Trilce Magdiel
 Chavez Quispe, Estasy
 García Huillca, Claudia
 Dosantos Pacheco, Milagros del Carmen
MICROPROPAGACION IN VITRO
Es una técnica que nos permite la obtención de millones de plantas a
partir de pequeñas secciones de tejido vegetal, llamada explantes esto
en un tiempo y espacio reducido.
UTILIDAD:
Propagación en masa: por cultivo in vitro se caracteriza por las
potencialmente altas tazas de multiplicación que puede conseguirse en
un tiempo relativamente corto , por ejemplo a partir de una sola plantita
en cultivo, multiplicándola mensualmente con una taza de multiplicación
de 10, se puede estimar una producción teórica de 1 millo de plantas en
un año.
Control de organismos patógenos: Si el material utilizado como
explanto está sano (por ejemplo procedente de cultivo in vitro con el
objetivo de saneamiento), y dado que las condiciones de cultivo son
asépticas, y los riesgos de infección por vectores naturales nula, es
posible conseguir gran cantidad de plantas con mayor garantía
sanitarias que si se hubiera cultivado en condiciones de campo donde es
más probable la presencia de focos de infección en el suelo.
FORMAS DE PROPAGACION MASIVA MEDIANTE EL CULTIVO DE
TEJIDOS VEGETALES IN VITRO
La propagación vegetal bajo condiciones in vitro, puede ser alcanzada a
través de las siguientes dos vías:
Proliferación de brotes por ramificación axilar
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El cultivo de tejidos vegetales in vitro ha facilitado la propagación de
numerosas plantas a través de la estimulación del desarrollo de yemas
preexistentes en los tallo tanto de entrenudos largos como de
entrenudos cortos.
Al momento de micropropagar una especie mediante la proliferación se
debe considerar el siguiente procedimiento:
 Se hace un cultivo de segmentos nodales
 Aísla la yema junto con una porción de tallo para obtener un
vástago
 Cada una de las yemas es aislado sobre un medio nutritivo,
induciendo así su desarrollo in vitro.
El aislamiento de yemas apicales y del vástago es una técnica que
en principio ni necesita la adición de citoquininas ni
fitorreguladores
 Cuando se obtiene un número adecuado de vástagos, estos son
enraizados
 Finalmente son transferidos al suelo.
El aislamiento de yemas apicales y del vástago es una técnica que en
principio ni necesita la adición de citoquininas ni fitorreguladores
Cuando el segmento nodal es muy grande, existe la probabilidad de
utilizar el método de yemas axilares que consiste en el aislamiento de
yemas localizadas en el segmento nodal y su posterior cultivo in vitro
enriquecidos con auxinas, a fin de obtener vástagos como fuentes de
micropropagacion.
En el caso de plantas que se propagan convencionalmente de forma
asexual no es necesaria la adición de fitorreguladores en los medios de
cultivo. Pues las plantas que se propagan asexualmente en condiciones
naturales cuando se coloca a condiciones in vitro no requieren de
fitorreguladores.
MORFOGENESIS DE NOVO
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Se refiere a la inducción de la expresión genética de procesos
organogénicos o embriogénicos somáticos en tejidos diferenciados.
Gracias a la totipotencia celular bajo condiciones in vitro un tejido puede
desdiferenciarse u de acuerdo con los fitorreguladores adicionados el
tejido se vuelve a diferenciar formando nuevos órganos y embriones
somáticos.
La adquisición de la competencia para diferenciar de un vástago o de un
embrión somático parece estar restringido a células selectivas que
debido a su localización espacial y tiempo de expresión, puede iniciar
una vía específica de desarrollo.
La multiplicación puede alcanzarse por organogénesis o embriogénesis
somática, empleando otros explantes como hoja, tallo o raíz.
MÉTODOS PARA ELIMINACIÓN DE PATÓGENOS
1. La naturaleza de patógenos:
Los patógenos vegetales incluyen nematodos, hongos, bacterias,
rickettsias, micoplasmas, virus y viroides. Ellos pueden ser trasmitidos
de plantas enfermas a plantas, sanas
El tamaño relativo de estos patógenos varía mucho. Entre los pat6genos
vegetales los nematodos son los más grandes y pueden ser observados
fácilmente con un microscopio estereoscópico. Los virus y viroides son
los más pequeños y se requiere de un microscopio electrónico para su
observación
Las condiciones ambientales, especialmente !a humedad y la
temperatura, juegan un papel importante en el desarrollo de una
enfermedad
los diferentes patógenos dentro de la planta enferma varia también
mucho. Pseudomonas solanacearum, el virus del enrollamiento de la
hoja de la papa (PLRV) y los micoplasmas están restringidos al tejido
vascular de una planta. Erwinia carotovora y el virus X de la papa
(PVX), invaden tanto el tejido vascular como el resto de los tejidos de la
planta. No todas las células en una planta enferma se encuentran
infectadas con patógenos. Los tejidos meristematicos de la raíz y brotes
terminales de una planta infectada están, algunas veces, libres de virus.
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Se desconoce la razón exacta por lo que esto sucede; sin embargo, se
cree que uno, o todos, de los siguientes factores son responsables de eso:
 Alta actividad metabólica: los virus se multiplican acompañando
el curso del metabolismo del hospedante.
 Carencia de tejido muscular: los virus se diseminan rápidamente
a través del sistema vascular
 Alta concentración de auxinas: los tejidos meristematicos de las
plantas tienen una concentración más alta de auxinas que los
tejidos de otras partes de las mismas
2. Termoterapia:
En la termoterapia se suele utilizar agua caliente ( 35 a 54 °C) durante
minutos u horas, según los casos. Para los restantes el calor se aplica
mediante aire ( 35 a 42 °C). La termoterapia puede utilizarse combinada
con el cultivo de meristemas, siendo a veces la única posibilidad de
regenerar plantas libres de virus.
3. Quimioterapia
En la quimioterapia desde hace algunos años está siendo utilizada con
éxito el Ribavirín (1-b-dribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamida).
Este producto, también denominado Virasole, no es fácil de conseguir y
su precio es elevado.
4. Tratamiento con frio
En algunos pocos casos citados el tratamiento con frío parece tener un
efecto similar al de la termoterapia para eliminar virus de plantas.
5. Esterilización de la superficie
La mayoría de los contaminantes de superficie, tales como bacterias y
hongos, pueden ser eliminados por esterilización de la superficie del
material vegetal con un agente esterilizador apropiado. Los agentes
esterilizadores de la superficie se aplican normalmente por 10-15
minutos. Bajo condiciones asépticas, la soluci6n esterilizadora es luego
eliminada y el material vegetal lavado 3 o 4 veces durante 5 minutos
cada vez por agitación en agua destilada estéril. El lavado es muy
importante para eliminar el exceso del agente esterilizador el cual puede
inhibir el crecimiento de la planta.
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 Etanol ETAPAS DE LA MICROPROPAGACION

 Hipoclorito de sodio o de calcio FASE I

 Bicloruro de mercurio.(NO RECOMENDABLE) 1. FUENTE DE EXPLANTES

6. Cultivo de meristemas • Los mejores explantes provienen de plantas en óptimas

El cultivo de meristemas apicales, extensivamente utilizado en las condiciones fisiológicas y en condiciones fotosanitarias
últimas décadas, se aplica principalmente para producir plantas libres de
patógenos, principalmente virus. También es importante para el • Algunos explantes deben provenir de brotes nuevos –> yemas
almacenamiento de germoplasmas a través de las técnicas de crio
2. SELECCIÓN DEL EXPLANTE
preservación.
• Sin duda el mejor explante para iniciar con la micropropagacion
7. Antibióticos
es el ápice caulinar, tanto de yemas caulinares como laterales.
La mayoría de los especialistas en cultivo de tejidos no confían en los
antibi6ticos para eliminar los contaminantes superficiales de las  Herbáceas: yemas apicales
disecciones. Estos productos son caros y ninguno es efectivo contra
todos los tipos posibles de organismos contaminantes. Los antibióticos  Leñosas: yemas laterales
son solo utilizados cuando los microorganismos son difíciles de eliminar
por otros medios. 3. DESINFESTACION

Los siguientes antibióticos o combinaciones de los mismos han sido  Lavar con agua destilada.
exitosamente aplicados:
 Cefotaxima  Lavar con etanol al 70% x 30 min
 Gentamicina  Hipoclorito de sodio x 3 a 5 min.
 Rifampicina
 Nistatina + Carbenecilina 4. COMPOSICION DEL MEDIO DE CULTIVO
 Gentanicina + Amfotericina B
 Vancomicina HC1 + Micostatin
 Estreptomicina + Carbenecilina

Y se encontró en algunos cultivos con fitotoxicidad causado por:

 Penicilina
 Estreptomicina
 Bactericina
 Esparsomicina
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5. CONDICIONES DE INCUBACION
 temperatura: 26°C
 irradiación: 1-5 –W.m-2
 Fotoperiodo: 8 a 16 horas
FASE II: MULTIPLICACIÓN DE BROTES
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron las fases
anteriores originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con
varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará
luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente
estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante
divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes
adecuados. Estas operaciones se realizan en la bolsa de flujo laminar o
en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de
asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o
división de las plantas. El número de plantas que se obtiene dependerá
de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número
de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite
alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los
factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.
FASE III: ENRAIZAMIENTO
Para enraizar los explantos se utilizan principalmente plantines
individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos
durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de
reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de
las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta
etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde
desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y
enraizamiento transcurren en forma simultánea.
FASE IV: TRANSFERENCIA DE LA PLANTA IN VITRO AL MEDIO
AMBIENTE NATURAL
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Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios
ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso
depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios
de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en
condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantos o
plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un
invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en
ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente
tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y
pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales
frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado
lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en
ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula
con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la
pérdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Los plantines
enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del
invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e
incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se
plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico,
para mantener la humedad relativa elevada. La elección de un sustrato
con buenas características físicas, es clave para el éxito de esta etapa.
Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de
arena turba, cáscara de arroz quemado , para permitir un desarrollo y
crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy
variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando. Luego
de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar dañarlas, los
plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de
sustratos seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los días se debe
controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es necesario, se
aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un
ambiente húmedo a nivel del sustrato. A los 15 días del trasplante, se
puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor
calor( temprano en la mañana o en la última hora de la tarde). Al
comienzo las plantas se dejan media hora por día destapadas. A la
semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del
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trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de
nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las
condiciones del cultivo in vitro , generan cambios en algunos aspectos
anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la
aclimatación, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el
estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia.
FACTORES QUE AFECTAN A LA MICROPROPAGACIÓN
Genotipo de la planta:
La selección del genotipo correcto de las especies vegetales (mediante
cribado) es necesaria para mejorar la micro propagación. En general, las
plantas con una vigorosa capacidad de germinación y ramificación son
más adecuadas para la micropropagación.
Estado fisiológico de los explantes:
Los explantes (materiales vegetales) de las partes de plantas más
recientemente producidas son más eficaces que los de las regiones más
antiguas. Un buen conocimiento del proceso de propagación natural de
las plantas donantes, con especial referencia a la etapa de crecimiento y
la influencia estacional, será útil en la selección de los explantes.
Medios culturales:
Los medios de cultivo de tejidos vegetales convencionales son adecuados
para la micropropagación durante la etapa I y la etapa II. Sin embargo,
para la etapa III, se requieren ciertas modificaciones. Se requiere la
adición de reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas) y
alteraciones en la composición mineral. Esto depende en gran medida
del tipo de cultivo (meristemos, yemas, etc.).
Ambiente del cultivo:
● Luz:
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El pigmento fotosintético en tejidos cultivados absorbe la luz y,
por lo tanto, influye en la micropropagación. También se sabe
que la calidad de la luz influye en el crecimiento in vitro de
brotes, por ejemplo, formación de brotes inducidos por la luz
azul en brotes de tabaco. Las variaciones en la iluminación
diurna también influyen en la micropropagación. En general, una
iluminación de 16 horas de día y 8 horas de noche es
satisfactoria para la proliferación de brotes.
● Temperatura:
La mayor parte del cultivo para la micropropagación requiere
una temperatura óptima alrededor de los 25 ° C. Sin embargo,
hay algunas excepciones, p. Begonia X Cheimantha tejido híbrido
crece a una temperatura baja (alrededor de 18 ° C).
● Composición de la fase gaseosa:
La constitución de la fase gaseosa en los recipientes de cultivo
también influye en la micropropagación. El crecimiento no
organizado de las células es generalmente promovido por
etileno, O2, CO2 etanol y acetaldehído.
Factores que afectan al enraizamiento in vitro:
Se da una descripción general de los factores que afectan a la
micropropagación, particularmente en relación con la multiplicación de
los brotes. Para un enraizamiento in vitro eficaz durante la
micropropagación, es ventajosa la baja concentración de sales
(reducción de medio a cuarto respecto al original). La inducción de
raíces también es promovida por la presencia de auxina adecuada (NAA
o IBA).
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Organogénesis: Embriogénesis somática