UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA
Prof. Roberto Ramos

INFORME 3
Título: Tinción diferencial ácido-resistente
Integrantes:
Bacon Gutiérrez, Pilar 20150429
García Taipe, Mayra 20151442
Jerí Díaz, Alexandra 20151102
Maguiña Geldres, Daniela 20151106
N° DE MESA: 1

GRUPO DE PRÁCTICA: Jueves 11-1, E*

2019
 I. INTRODUCCIÓN
Los colorantes diferenciales se componen de más de una sustancia tintórea. En
algunas técnicas de coloración, los colorantes se aplican por separado, y juntos
en otras, formando parte de una solución. Una de las coloraciones diferenciales
más importantes que se emplean en la microbiología es la tinción acido -
resistente.

La mayoría de las bacterias se tiñen sin dificultad con los colorantes usuales, pero
existen algunas excepciones. Se dice que algunas bacterias están rodeadas de
una cubierta constituida por substancias céreas y grasas; el cual lo
denominaremos cuerpo vegetativo. En estos microbios los colorantes no penetran
con facilidad, más de una vez aplicando la tinción, recién retienen el color incluso
al lavarlos con alcohol. Por no decolorarse con este alcohol, reciben tales
microorganismos el nombre de ácido resistentes. La tinción acido resistente es
una tinción diferencial que mide en células teñidas la resistencia a la decoloración
mediante un ácido. La propiedad de ácido - resistente lo poseen ciertas
micobacterias y actinomicetos, esta correlacionada con su alto contenido lipídico.
Este proceso requiere un tratamiento de alta temperatura y la utilización de
colorantes fuertemente afines.

En la tinción acido – resistente se pueden observar endosporas, estas pueden

sobrevivir cambios ambientales que matarían normalmente a las bacterias. Estos
estreses incluyen temperatura alta, la alta irradiación UV, la desecación, el daño
químico y la destrucción enzimática. Las características extraordinarias de la
resistencia de endosporas los hacen de importancia particular porque no son
matadas fácilmente por muchos tratamientos antimicrobianos. Existen varias
técnicas para la tinción de endosporas, las que se usaron en la práctica fueron la
tinción de Dörner y la de Schaeffer y Fulton.
La tinción de Dörner, el colorante usado no tiñe a los microorganismos, se queda
alrededor de ellos demostrando que estos poseen una cubierta denominada
capsula la cual impide la penetración del tinte a la bacteria, la capsula parece un
halo que se ve gris en el fondo negro. En la Tinción de Schaeffer y Fulton,
manifiesta la capacidad de resistir a la decoloración gracias al alto contenido de
lípidos complejos y ceras que poseen algunos microorganismos en su
pared celular.
En la práctica se utiliza como muestra al Bacillus sp. es un bacilo con capacidad
de formación de esporas que le da una ventaja de supervivencia en el ambiente.

II. OBJETIVOS

 Aprender correctamente los procedimientos de las dos técnicas de tinción

ácido-resistente.
 Distinguir a través de dos técnicas de tinción diferencial la presencia de
endosporas bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas.
 III. MARCO TEÓRICO
Las endosporas son células en estado de latencia, con una bajísima tasa
metabólica y capaz de conservar su vitalidad durante larguísimos períodos. Son
muy resistentes a la acción de diversos agentes químicos (octanol, cloroformo) y
físicos (altas temperaturas, congelación, desecación, radiaciones) (Gest, 1987).

Propiedades

 Hipometabolia: Poseen la más baja tasa respiratoria de todos los seres

vivos. Por ello son capaces de sobrevivir en ausencia de nutrientes durante
largos períodos de tiempo.
 Dormancia (latencia): Esta propiedad se refiere al hecho de que la espora
tiene una gran inercia a los sustratos exógenos. Como veremos, la espora
sólo perderá la dormancia cuando se haya activado para la germinación.
 Resistencia al calor: Las esporas de ciertas especies resisten 120°C
durante 15 min, lo cual condiciona los parámetros para esterilizar
materiales. Esta elevada resistencia a las altas temperaturas es un
subproducto de los cambios evolutivos que condujeron a la deshidratación
como medio para lograr la hipometabolia y la latencia.

Tinción de esporas

La esporulación no es un mecanismo de multiplicación en bacterias, pues

usualmente por cada célula se produce solo una endospora. En algunos casos
excepcionales se puede producir más de una espora, por ejemplo, la
Metabacterium polyspora y Anaerobacterpolyendosporus. Por otra parte, los
Actinomycetales, un grupo especial de bacterias, forman numerosas exosporas
como forma de multiplicación (Solano, 2005).
Las endosporas son formas de resistencia, altamente deshidratadas y con una
serie de cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difíciles de teñir,
excepto si se calienta la preparación para permeabilizarlas; sin embargo, pueden
evidenciarse en preparaciones a frescos o diversas tinciones, pues las esporas
aparecen como estructuras refrigerantes no coloreadas.
Las endosporas son más resistentes a condiciones adversas, entre ellas calor,
radiaciones, desinfectantes y otras, que las células vegetativas y las exosporas.
Se producen en condiciones nutricionales que favorecen el proceso de
esporulación.
La endospora ocupa una posición característica dentro de la célula, puede ser
terminal, subterminal o central. La localización y el tamaño de la espora varía con
la especie bacteriana y generalmente estas características son de valor para su
identificación. Conforme el desarrollo de la espora se completa, la célula
vegetativa se desintegra y libera la espora (Madigan, 2003).
La envuelta de la endospora es más compleja e impermeable que la envuelta de
las células vegetativas en las que se forma. Sólo se puede teñir el contenido de la
espora alterando su envuelta. La impermeabilidad de las cubiertas dificulta que
las endosporas se decoloren una vez teñidas (Prescott, 2004).
Durante el lavado con agua, el verde de malaquita se elimina de las células
vegetativas, pero no de la endospora.
El colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las células vegetativas
(decoloradas por el agua).

TÉCNICA SCHAEFFER-FULTON
Colorante primario: verde de malaquita:
El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva
débil) y por tanto, se une débilmente a la bacteria. Penetra en las células
vegetativas. Cuando se calienta la preparación también penetra las endosporas.
Agente decolorante: Agua destilada Una vez que las esporas aceptan el colorante
verde de malaquita, no podrán ser decoloradas con agua. Las esporas
permanecen verdes. Por otro lado, el colorante no muestra una alta afinidad por
los componentes de las células vegetativas, el agua lo remueve y las células
quedarán incoloras.
Contracolorante: Safranina: Este colorante se utiliza como contraste para teñir las
células vegetativas incoloras, éstas absorben el colorante y aparecerán rojas. Las
esporas retendrán el color verde del colorante primario.

TÉCNICA DE DORNER
Esta es una técnica muy similar a la anterior y los principios teóricos son los
mismos. En este caso se utiliza carbol fucsina como colorante primario, agua
como decolorante y nigrosina como contracolorante. Las esporas se verán de
color rojo, el resto de la bacteria incolora, sobre un fondo negro.

IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO

4.1 MATERIALES:

-Cultivo de 48 horas (Bacillus sp)

-Soluciones colorantes (Fucsina, Nigrosina y verde malaquita)

-Asa de Kolle

-Baño de agua a 100°

-Láminas portaobjeto

-Tubos con agua estéril

-Alcohol ácido

-Aceite de cedro

-Microscopio

4.2 PROCEDIMIENTO:

Para la Técnica de Dörner:

-El primer paso es retirar del tubo de ensayo que contiene agar nutritivo el
Bacillus sp con ayuda del asa de Kolle.

-El segundo paso, la muestra de bacteria se coloca en un tubo de ensayo que

contiene agua destilada con el fin de generar una siembra de cultivo.

-Después se le agrega al tubo de ensayo la fucsina generando un color rojizo.

- Luego de ello se coloca a baño maria por un tiempo de 30 minutos con el

objetivo de que se pueda fijar el color.

-Con los 30 minutos transcurridos retiramos el tubo de ensayo y se transfiere

una gota en un portaobjetos y en el mismo portaobjeto ponemos una gota de
nigrosina y luego se mezcla hasta obtener una delgada película.

-Secamos el portaobjetos al ambiente y luego se le añade una gota de cedro.

-Al final observamos los resultados en el microscopio.

Para la Técnica de Schaeffer y Fulton:

-El primer paso en esta técnica es fijar la muestra de Bacillus sp en el

portaobjetos.

-El segundo paso es agregarle fucsina.

-El tercer paso es calentar al mechero por un tiempo de tres minutos.

-El cuarto paso es lavar con alcohol cetona (3 lavadas)

- Luego de ello enjuagamos con agua.

-Para el sexto paso añadimos verde malaquita un colorante básico por un tiempo
de 60 segundos.

-Luego volvemos a lavar con agua y secamos.

-Después de ello añadimos aceite de cedro con el fin de poder observar en el

microscopio los resultados.

V. OBSERVACIONES Y RESULTADOS

Experimento 1: Técnica de Schaeffer y Fulton

Imagen: Fuente propia

Se observa Bacillus sp. tratado con la técnica de Schaeffer y Fulton, a un aumento

de 1000X. En esta muestra se puede diferenciar la endospora de la parte
vegetativa, que se tiñen de color rojo y verde respectivamente.

Experimento 2: Técnica de Dorner

Imagen: Fuente propia

En esta muestra se observa Bacillus sp. tratado con la técnica de Dorner, a un
aumento de 1000X. En esta muestra se distingue, a diferencia de la otra muestra,
un campo oscuro, de donde resalta la coloración roja de la endospora del Bacillus
sp.; sin embargo la parte vegetativa queda incolora.

VI. DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en la práctica difieren un poco de lo que nos dice la

teoría, en el caso de la tinción Schaeffer y Fulton el resultado esperado es un
cuerpo vegetativo de color verde, por la aplicación del colorante de contraste
verde malaquita, y una endospora roja, por el colorante primario carbol fucsina
(Prescott, 2004). El resultado obtenido fue un cuerpo vegetativo levemente
coloreado de verde con la endospora roja, solo algunas bien coloreadas y a veces
sólo endosporas flotando. Este resultado se puede deber a el hecho de que
durante la fijación se haya expuesto durante mucho tiempo la muestra al calor
puesto que esto puede destruir los cuerpos vegetativos y sólo dejar algunas
endosporas intactas, también en la parte de agregar el alcohol ácido, si no se tuvo
cuidado en el paso anterior se puede destruir aún más los microorganismos,
entonces al aplicar el colorante de contraste no teñirá ningún cuerpo vegetativo y
sólo manchará el vidrio del portaobjetos, por lo que lo volverá más difuso.
En el caso de la tinción de Dorner, al ser una técnica más simple no debería haber
habido ningún inconveniente, ya que el resultado esperado es un fondo de color
oscuro y la endospora resaltada de rojo (Solano, 2005). El resultado obtenido fue
casi el esperado, la única excepción fue al añadir la nigrosina, cuando se le
observó en el microscopio a 1000x se veían grumos de nigrosina y eso dificultaba
la observación de la endospora.

VII. CONCLUSIÓN

La tinción de Dörner es una tinción diferencial ácido-resistente que permite la

observación de las endosporas dentro de una célula bacteriana en su fase de
esporulación, pudiendo apreciarse la endospora de una manera muy nítida y
resaltante debido a que la estructura vegetativa queda incolora.

La tinción de Schaeffer y Fulton es una tinción diferencial ácido-resistente que

permite observar las endosporas dentro de una célula bacteriana en fase de
esporulación, pero es necesario tener mucho cuidado al momento de aplicar calor
y alcohol-ácido a la muestra en la lámina portaobjeto, porque la estructura
vegetativa es susceptible a desorganizarse con la alta temperatura y expulsar las
endosporas.
VIII. CUESTIONARIO

IX. BIBLIOGRAFÍA
 Gest. H, J. Mandelstam. 1987. Longevidad de microorganismos en
ambientes naturales. Microbioly Science. 4: 69-71.

 Madigan; Martinko; Parker. Brock Biología de los microorganismos. Décima

Edición. Editorial Pearson - Prentice Hall. EEUU, 2003.

 Prescott, L.; Harley, J.; Klein, D. (2004) Microbiología. España. Editorial

McGraw Hill Interamericana de España, S.A.U. Quinta Edición

 Solano,C. 2005. Microbiología general (prácticas). Instituto de

Agrobiotecnología y Recursos Naturales. pp 32.