3.7.

- BIOSENSORES

L.M. Lechuga

. Biosensores optoelectrónicos y nanomecánicos

. Desarrollo de microsensores interferométricos integrados con tecnología de silicio para
aplicaciones biológicas
. Modelización teórica de estructuras ARROW para su empleo en biosensores ópticos
. Fabricación de microcubetas de flujo mediante micromecanizado en silicio
. Prototipo de biosensor de resonancia de plasmón superficial de doble canal para la medida
de interacciones biomoleculares específicas
. Biosensores nanomecánicos basados en micropalancas de silicio

58
BIOSENSORES OPTOELECTRÓNICOS Y NANOMECÁNICOS

L.M. Lechuga Gómez

Esta línea de investigación se centra en el desarrollo de dispositivos biosensores a escala

macro, micro y nanométrica. Dentro de este contexto general se pueden enumerar distintas
actividades que se llevan a cabo, como diseño y modelización teórica de las estructuras
biosensoras, tecnología de fabricación, montaje experimental de medida, electrónica de
control, sistema de adquisición y tratamiento de datos que conducirán finalmente, al
desarrollo de Prototipos completos. Asimismo se llevan a cabo actividades complementarias
como el diseño y fabricación de sistemas de flujo, macro y micromecanizados, desarrollo de
sistemas de modulación de señal óptica, integración de componentes, etc encaminadas a
conseguir Microsistemas completos, que permitan su utilización fuera del entorno del
laboratorio. Actualmente se trabaja en tres prototipos de biosensor: (i) un microsensor óptico
integrado basado en Interferómetros Mach-Zehnder con tecnología de Silicio (ii) un sensor de
Resonancia de Plasmón Superficial de Doble Canal (iii) un nanosensor basado en
micropalancas de Silicio

Las aplicaciones de estos dispositivos se dirigen fundamentalmente al campo medioambiental,

por ejemplo para el control de agentes biocidas y tensioactivos o para la determinación de
contaminantes de origen industrial con efectos de disrupción endocrina (como nonilfenol y
bisfenol-A). Recientemente se han comenzado dos nuevas líneas de aplicación, una orientada
a la determinación de productos ilegales empleados en la industria agroalimentaria (como
corticosteroides y antibióticos) y otra para la detección de alteraciones en genes al nivel de
una sola base.

Los temas objeto de estudio en esta línea de investigación son los siguientes:

- Modelización teórica de estructuras ARROW para su empleo en biosensores ópticos

- Desarrollo de microsensores interferométricos integrados con tecnología de Silicio para
aplicaciones biológicas
- Fabricación de microcubetas de flujo mediante micromecanizado en silicio
- Prototipo de Biosensor de Resonancia de Plasmón Superficial de Doble Canal para la
medida de interacciones biomoleculares específicas.
- Biosensor nanomecánico basado en micropalancas de Silicio

Algunos de estos temas se desarrollan en estrecha colaboración con el grupo de transductores

optoquímicos del IMB-CNM y el resto de forma independiente en el IMM-CNM, pero se
cuenta con la colaboración de diversos grupos nacionales y extranjeros:

• Drs Pilar Marco y F. Sánchez-Baeza del IIQAB (CSIC)

• Dr. Eduardo Blanco del Dpto. de Física de la Materia Condensada, Univ. de Cádiz.
• Dr. Sadot Alexandres del ICAI, Universidad Pontificia Comillas de Madrid.
• Prof. Julio San Román, del Instituto de Tecnología de Polímeros (CSIC)
• Dra. Soledad Penadés del Instituto de Investigaciones Químicas (CSIC)
• Dr. Abel González Oliva.IBET, Univ. Nouva de Lisboa (Portugal)
• Dr. Robert Chen, Environmental Coastal and Ocean Sciences Department, University of
Massachusetts Boston (USA)
• Prof. M.J. Miles, H.H. Wills Physics Laboratory, University of Bristol, UK.
• Dr. Antonio Alencar de Queiroz, Escuela Federal de Engenharia de Itajubá, Brasil.

59
DESARROLLO DE MICROSENSORES INTERFEROMÉTRICOS CON
TECNOLOGÍA DE SILICIO PARA APLICACIONES BIOLÓGICAS

F. Prieto, B. Sepúlveda, A. Llobera, A. Calle, C. Domínguez, L.M. Lechuga.

Los biosensores basados en dispositivos de óptica integrada están adquiriendo una gran
importancia hoy en día debido a su alta sensibilidad, estabilidad mecánica, posibilidad de
miniaturización e integración en microsistemas y fabricación a gran escala. Estos sensores se
basan en el principio de modulación del campo evanescente: en una guía de ondas la luz se
transmite en condiciones de reflexión interna total; no obstante, el campo electromagnético,
asociado a la guía de ondas, no queda estrictamente confinado al interior del núcleo de la
guía, sino que presenta un decaimiento exponencial en las zonas que envuelven al núcleo,
dando lugar al denominado campo evanescente. Cualquier interacción molecular (analito-
receptor) que se produzca dentro de este campo evanescente producirá cambios en las
características de la luz que se propaga por la guía de ondas. Estamos ante un dispositivo muy
potente, que permite la detección del analito de manera selectiva, directa (sin marcadores) y
rápida (de segundos a minutos). La capa de moléculas receptoras selectivas se inmoviliza en
la superficie del sensor, y dependiendo de la elección de dicha capa es posible detectar
analitos clínicos, contaminantes medioambientales, ADN, explosivos o armas biológicas,
entre los más importantes.

La configuración de medida elegida para detectar la variación que se produce en las

propiedades de la luz dentro de la zona del campo evanescente es una configuración
interferométrica Mach-Zehnder (ver Figura 1) dada su alta sensibilidad. Cuando tiene lugar
una reacción de reconocimiento molecular en la rama sensora del interferómetro se produce
un cambio de fase entre las dos ramas, que se detecta como un cambio en el patrón de
interferencia. La intensidad de este patrón dependerá, entre otras cosas, del incremento de
masa en la rama de medida y será función de la concentración del analito en el medio.
Obtenemos, así, un sensor directo y rápido para determinar cualquier sustancia de la que se
disponga su molécula complementaria
sensing arm
I = I0 (1 + cos ∆φ)
dielectric coating
donde ∆φ = 2π/λ .L.(Nsen-Nref)
∆φ:diferencia de fase entre ambas ramas
L: longitud de interacción
Nsen y Nref : índices de refracción efectivos
reference arm en las ramas sensora y de referencia
Fig. 1. Esquema del interferómetro Mach-Zehnder
integrado usado como transductor.
En aplicaciones como sensor, las guías
ópticas que forman el dispositivo MZI
deben verificar dos condiciones:
comportamiento monomodo y alta
sensibilidad superficial, por lo que en la
fabricación de los dispositivos se emplean
guías de onda tipo ARROW (Antiresonant
Reflecting Optical Waveguides) dada sus
ventajas tecnológicas frente a las
convencionales (guías de dimensiones de
micras en vez de nanometros).
Fig. 2. Estructura ARROW

60
Después de una etapa de modelización y diseño teórico, tanto de la estructura guía como de
los interferómetros, para alcanzar las especificaciones requeridas para su utilización como
biosensor, tal como se explica en páginas posteriores, se procede a la fabricación de los
dispositivos. La estructura de la guía ARROW fabricada puede verse en la Figura 2, donde se
especifican las dimensiones e índices de refracción de las diversas capas que la constituyen.
El dispositivo se procesa en Sala Blanca mediante tecnología microelectrónica estándar.
Posteriormente se procede al corte y pulido de cada chip (Figura 3), y por último, se coloca en
un banco óptico de medida adecuado para proceder a su caracterización óptica y (bio)química
(Fig. 4).

Fig. 3

chip with 14 MZI sensors

1 cm

Sensor MZI
Fig. 4
La caracterización óptica muestra que, en general, los dispositivos tienen pérdidas inferiores a
los 0.5 dB/cm, con una división y acoplamiento efectivo de la luz en los divisores en Y y con
un comportamiento monomodal. Para caracterizar su funcionamiento como sensor se emplean
disoluciones de diferentes índices de refracción (Fig. 5), que se hacen llegar al dispositivo
mediante un sistema de flujo

24-4-01
1.4 1785-8 IMM_6_3 (nitruro atacado)
R=80mm, L=15mm
Polarización TE
1.2
Y = 0.0629 (+ 0.02) + 481.374 (+ 21.03) ·X

1.0
Curva teórica
Si/ 1.46 / 2 /1.485/ 2 /1.46
- /1.972/0.365/ 3.18 /0.038/ 2 Curva teórica
0.8 Si/ 1.46 / 2 /1.485/ 2 /1.46
- /1.972/0.365/ 3.18 /0.032/ 2
∆Φ (2π)

Curva teórica
0.6 Si/ 1.46 / 2 /1.485/ 2 /1.46
- /1.972/0.365/ 3.18 /0.039/ 2
-5
0.4 ∆Φmin = 0.01 · 2π => ∆nmin = 2·10

Curva teórica
0.2 Si/ 1.46 / 2 /1.485/ 2 /1.46
- /1.972/0.365/ 3.18 /0.037/ 2

0.0

0.0 5.0x10
-4
1.0x10
-3
1.5x10
-3
2.0x10
-3

∆n

Fig.5. Respuesta del sensor MZI en función de la variación del índice de refracción en el área sensora. Las líneas
corresponden con la simulación teórica del cambio de fase. Se muestran los resultados para diferentes configuraciones de
MZI.

61
Como ejemplo de aplicación del interferómetro MZI como biosensor, en la Figura 6 se
muestra la respuesta del sensor en tiempo real a la adsorción física de la proteína -hSA
(anti-human serum albumin) con una concentración 1·10-7 M. Las medidas se llevaron a cabo
en una solución tampón (PBS), con un pH de 7.35 a temperatura ambiente y con una
velocidad de flujo de 33 l/min. Los anticuerpos forman una monocapa, por adsorción física,
sobre la superficie de la guía de un espesor aproximado de 10 nm, originando un cambio en el
índice de refracción efectivo del modo guiado y, por lo tanto, en la señal de salida del
interferómetro.

Fig.6

25-4-01
1785-8 IMM_6_3 (nitruro atacado)
R=80 mm, L=15 mm
Polarización TE
8
-7
Ab (10 M)
6
∆Φ (2π)

4
PBS

4
Señal (u.a.)

2
0 10 20 30 40

Tiempo (min)

Referencias:
L.M. Lechuga, F. Prieto, A. Calle, A. Llobera and C. Domínguez. Química Analítica 18 (suppl.), 144-146 (1999).
F. Prieto, L.M. Lechuga, A. Llobera, A. Calle and C Domínguez. J. of Lightwave Tech. (In press)
L.M. Lechuga. Química Analítica 19 (2000). REVIEW

62
MODELIZACIÓN TEÓRICA DE ESTRUCTURAS ARROW PARA SU EMPLEO EN
BIOSENSORES ÓPTICOS

F. Prieto, A. Llobera, A. Calle, C. Domínguez, L.M. Lechuga.

En el desarrollo de biosensores ópticos integrados, basados en guías de onda ARROW como

transductor, es importante el diseño de guías que proporcionen una respuesta lo más alta
posible, cuando tiene lugar el proceso de reconocimiento molecular en la etapa biosensora, de
forma que dicho proceso sea detectado por la interacción del campo evanescente del modo
guiado con el medio exterior. Esta interacción induce un cambio en las propiedades ópticas de
propagación del modo guiado, es decir, en su índice de refracción efectivo, que está
relacionado con la sensibilidad del sensor. Por tanto, interesa diseñar una guía en la que la
interacción del campo evanescente con el medio exterior sea máxima.

En este tipo de estructuras se pueden distinguir entre dos tipos de Sensibilidad (ver Figura 1):
(i) Sensibilidad homogénea (Shom): cuando la variación de índice de refracción es
homogénea en el volumen del medio exterior, (ii) Sensibilidad superficial (Ssup): cuando la
variación de índice de refracción se produce en la superficie de la guía de ondas, en una
región de espesor menor que la longitud de penetración del campo evanescente en el medio
exterior. Este último es el caso de la adsorción de moléculas sobre la superficie del sensor, así
como de la detección de reacciones biomoleculares en las que uno de los componentes ha sido
inmovilizado previamente sobre la superficie.

a) b)
Figura 1. a) Sensibilidad homogénea. b) Sensibilidad superficial para una estructura ARROW

Para obtener las expresiones analíticas de la sensibilidad para guías ARROW hay que hallar la
condición de resonancia transversal para dicha guía, y posteriormente, la sensibilidad por
diferenciación implícita de dicha ecuación, resultando las expresiones:
ρ
∂N no éê æ N ö ù
2 2ρ 2ρ
= = ⋅ 2çç ÷÷ − 1ú
Po ∂N γ o éêæ n l ö æn ö ù P
S hom ⋅ S sup = ≈ ⋅ çç ÷÷ γ o2 − çç o ÷÷ γ l2 ú ⋅ o
∂n o N ê è n o ø ú PT ∂d l N êè no ø è nl ø ú PT
ë û ë û
(con ρ=0 (TE), ρ=1 (TM) y donde no es el índice de refracción del medio exterior, N es el índice de refracción efectivo del
modo y Po/PT es la fracción de la potencia total del modo que viaja por el medio exterior)

Para hacer una simulación teórica de la variación de ambas sensibilidades, en función de

diversos parámetros de la guía de ondas ARROW, se adapta un programa de cálculo basado
en el Método de las Diferencias Finitas No Uniforme. En este estudio se modifican los dos
parámetros más relevantes de la guía (espesor e índice de refracción del núcleo) con los que
se puede obtener una mayor respuesta del sensor (Figura 1). Después de estos cálculos, y
como resumen, en la Tabla I se muestran los valores máximos de la Sensibilidad homogénea
y superficial que se pueden obtener, y que corresponden al caso de menor espesor e índice de
refracción del núcleo:

63
 æ ∂N ö æ ∂N ö
ç ÷ ç ÷ (10-4nm-1)
dc ( m) / nc ç ∂n ÷ ç ∂d ÷
è o ø max è l ø max
Modo TE 2 / 1.46 0.004 0.06
Modo TM 2 / 1.46 0.0055 0.08
Modo TE 3 / 1.46 0.001 0.019
Modo TM 3 / 1.46 0.002 0.028
Modo TE 4 / 1.46 5.34·10-4 0.008
Modo TM 4 / 1.46 7.56·10-4 0.012

Los valores para dc = 2 m difieren entre un factor 40 y 60 de los obtenidos para las guías
TIR convencionales. Se podría seguir aumentando la Sensibilidad si se disminuye más el
espesor del núcleo. Esta opción no es deseable ya que se perderían las ventajas tecnológicas
de las guías ARROW respecto de las TIR y porque, además, se aumentarían excesivamente
las pérdidas de propagación. Por lo tanto, se debe buscar otra solución. Después de evaluar
detalladamente diferentes alternativas, se concluyó que se puede lograr un aumento
significativo de Sensibilidad cuando la superficie del núcleo de la estructura ARROW se
recubre con una capa delgada de un material de índice de refracción alto. Para este caso se
obtienen de nuevo las expresiones de la condición de resonancia transversal y por
diferenciación implícita de las mismas las expresiones de la sensibilidad homogénea y
superficial. En la Fig. 2 puede observarse la simulación realizada para este caso.
La sensibilidad se incrementa claramente
cuando el espesor del núcleo disminuye.
Los valores de transición del espesor de
la capa superpuesta están alrededor de los
35 nm, para la polarización TE, y de 65
nm, para la TM. Si se mantiene el espesor
dov por debajo de estos valores, para
evitar que la capa de alto índice soporte
modos guiados TIR (unos 30 nm (para
los modos TEo) y 60 nm (para los modos
Figura 2. Aumento de la sensibilidad en función del
TMo)), los valores máximos de
espesor de la capa superpuesta (Si3N4, n=2.00) y del sensibilidad obtenidos corresponden a un
espesor del núcleo para una guía ARROW (nc=1.485, espesor de núcleo de 2 m:
n2=1.46, d2= 2 m).

æ ∂N ö æ ∂N ö
ç ÷ ç ÷ (10-4nm-
dc ( m) / nc ç ∂n ÷ ç ∂d ÷
è o ø max è l ø max
1
)
Modo TE 2 / 1.485 0.065 0.8
Modo TM 2 / 1.485 0.075 1.15
Modo TE 3 / 1.485 0.035 0.6
Modo TM 3 / 1.485 0.55 0.8
Modo TE 4 / 1.485 0.025 0.35
Modo TM 4 / 1.485 0.04 0.65
Estos valores implican un aumento de la sensibilidad de más de un orden de magnitud
respecto a la obtenida para la guía sin capa superpuesta.

Referencias:
F. Prieto, A. Llobera, A. Calle, C Domínguez and L.M. Lechuga. J. Lightwave Tech. 18(7), 966-972 (2000).

64
FABRICACIÓN DE MICROCUBETAS DE FLUJO MEDIANTE
MICROMECANIZADO EN SILICIO

F. Prieto, A. Llobera, A. Calle, C. Domínguez, L.M. Lechuga.

Un aspecto de fundamental importancia en el funcionamiento y eficacia de los biosensores es

la forma en que la “muestra” a medir es conducida hasta la zona de “trasducción” donde tiene
lugar la reacción de reconocimiento molecular. Reducir los volúmenes de muestra y de los
reactivos necesarios, así como optimizar los soportes y superficies dónde están inmovilizadas
las moléculas inmunoactivas es un condicionante para conseguir la miniaturización del
sistema sensor de medida. Por tal motivo, la necesidad de desarrollar sistemas compactos,
reproducibles y que se puedan fabricar en grandes cantidades, con tecnologías de bajo coste,
condiciona el desarrollo de microcubetas de flujo, con un diseño que garantice una adecuada
dinámica de fluidos en su interior (sin control difusional) y que posibilite una distribución
homogénea de las líneas de flujo sobre la superficie inmovilizada con la fase biológica. Estas
microcubetas deben ser fabricadas de forma reproducible y con mínimos errores de tolerancia,
procurando utilizar materiales estables, biocompatibles al medio y con técnicas de producción
de bajo coste y que se integren con el soporte de inmovilización y el sensor óptico.

Para ello se ha diseñado un sistema de flujo miniaturizado que permite su acoplamiento al

sensor, y que garantiza una alta velocidad de transporte de masas del analito hacia la superficie
del transductor, disminuyendo así el tiempo de respuesta del dispositivo. Según nuestros
cálculos, las distancias de trabajo deben ser inferiores a 100 µm para conseguir un buen
transporte de masas: para trabajar con estas dimensiones hay que plantearse el realizar la
cubeta de flujo mediante micromecanización en silicio. Esta cubeta sería acoplable al sensor
formando así un dispositivo completo.

Estas microcubetas han sido fabricadas en Sala Blanca con tecnología de micromecanización
en Silicio. En la Figura 1 puede observarse la estructura de una de ellas y como se acopla
mediante la técnica de “fusion bonding” al sensor, dejando un espacio de 50 µm por el que
circulan las disoluciones, evitando los problemas difusionales y consiguiendo un ahorro de
reactivos.

8 µm

50 µm

35 m m

Figura 1 – Microcubeta de flujo (arriba) y microsensor interferométrico (abajo)

para la medida de disoluciones en flujo continuo.

65
PROTOTIPO DE BIOSENSOR DE RESONANCIA DE PLASMÓN SUPERFICIAL
DE DOBLE CANAL PARA LA MEDIDA DE INTERACCIONES
BIOMOLECULARES ESPECÍFICAS.

F. Prieto, B. Sepúlveda, A. Calle, L.M. Lechuga.

El Prototipo sensor desarrollado está basado en el Principio de Resonancia de Plasmón

Superficial y es especialmente útil para la detección selectiva y cuantitativa de sustancias
químicas y bioquímicas de forma directa (sin necesidad de marcadores).

La Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) es un fenómeno óptico que permite la detección

de cambios de índice de refracción en las proximidades de la superficie de separación entre un
metal y un dieléctrico. Por ello, el sensor de SPR se engloba dentro de los sensores ópticos de
Campo Evanescente. Este tipo de sensores se está convirtiendo en una seria alternativa a los
análisis químicos clásicos (costosos, complicados y lentos) ya que permite la realización de
medidas en tiempo real con gran sensibilidad. Es posible la detección de cambios de índice de
refracción del orden de 10-5 y la adsorción de capas de moléculas sobre la superficie del
sensor de un grosor medio de 0.1 nm. Su utilización como Biosensor, haciendo uso, por
ejemplo, de reacciones de reconocimiento tipo antígeno/anticuerpo, debido a su gran afinidad,
asegura la especificidad y la fiabilidad de la detección. Se trata de una medida directa, por lo
que no es necesario el marcado de las moléculas a analizar. Los campos de aplicación más
destacables son el biomédico, el veterinario, la industria alimentaria, el control de procesos
industriales o el control medioambiental.

En un sensor de SPR, la luz que incide en la interfase entre un metal y un dielectrico provoca
la excitación de un plasmón superficial para un determinado ángulo de incidencia de dicha luz
(llamado ángulo de resonancia). La excitación del plasmón superficial provoca un descenso
muy grande de la reflectividad del metal ya que los fotones incidentes son absorbidos por el
gas de electrones. Si se mide la intensidad del haz reflejado en función del ángulo de
incidencia de la luz, se observa un mínimo muy pronunciado para el ángulo de resonancia. El
ángulo de resonancia depende fuertemente del índice de refracción del medio colindante a la
lámina metálica. Por ello, las variaciones de índice van a ser detectadas como cambios del
ángulo de resonancia y este cambio es proporcional a la concentración.
Fig. 1: (a) Detección de la variación de índice de refracción del medio externo como desplazamiento del ángulo de resonancia
para tres disoluciones salinas con distintos índices de refracción (b) Detección del cambio de índice de refracción del medio

5.2
n=1.3323
n=1.3352
n=1.3363
12 5.0

n = 1.3323
10
señal (V)

4.8
se
ñal 8
(V)
4.6 n = 1.3335

4 2900 3000 3100 3200 3300

tiempo (s)
60 62
ángulo

externo a ángulo fijo. Paso de agua, n=1.3323 a una disolución salina de índice n=1.3335.

66
 Fotodiodo Doble Cubeta
de flujo 0.3
Lámina de oro de
41 nm
láser

Divisor

Fig. 2: Prototipo de Biosensor SPR con doble canal

El Prototipo de Sensor SPR desarrollado puede observarse en la Figura 2. La fuente de luz es

un diodo láser de 3 mW (670 nm), que se divide en dos haces iguales mediante un divisor de
haz, se hace incidir a través de un prisma semicircular sobre una lámina metálica de oro de 41
nm. La lámina metálica queda en contacto directo con las cubetas de flujo, dichas cubetas
están realizadas en metacrilato, poseen un volumen de 300 nl, y tienen una separación de 3.1
mm. La luz reflejada es detectada por un fotodiodo en cuadrante, amplificada y digitalizada
por una tarjeta de adquisición. Los datos digitales se transmiten a un PC, donde serán
representados en tiempo real. Esta configuración permite la realización de medidas
simultáneas independientes o el uso de uno de las cubetas como referencia. Esto es de gran
importancia para discriminar las variaciones de intensidad provocadas por inestabilidad del
láser y cambios de temperatura, así como para diferenciar la señal debida a la reacción de
reconocimiento frente a las de los cambios de índice de refracción de la disolución.

Para su utilización como biosensor, se deposita sobre la superficie metálica una capa de
moléculas receptoras capaces de enlazar únicamente las moléculas del analito que se quiera
determinar. Esto supone un cambio de índice de refracción sobre la superficie del metal y,
como consecuencia, un desplazamiento del ángulo de resonancia. Esto permite realizar
medidas directas en tiempo real, así como el análisis de muestras complejas sin purificación
previa. En la Fig 3 pueden observarse los pasos seguidos para la detección de de la
inmoglobulina IgG ( anticuerpo α-HSA, Human Serum Albumin) con su antígeno específico
(HSA). Las medidas se realizan en una disolución salina, PBS con un pH de 7.35, a
temperatura ambiente y manteniendo un flujo constante de disolución de 20µl/min.

67
 Lavado
con PBS
1.0 Lavado
con PBS

Reflectancia
0.9

Bloqueo con
BSA
0.8
Adsorción de
Antígeno

0.7

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo (min)
Fig. 3(a): Formación de monocapa de HSA
y bloqueo de la superficie del oro con BSA

0.60

0.55

0.50 Lavado
Reflectancia

con PBS
0.45

0.40 Diferencia
de señal
0.35 Inmunorreacción de
Anticuerpos
0.30
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (min)
Fig 3(b): Inmunorreacción α-HSA / HSA

En la Figura 4 se puede observar la respuesta del sensor para diferentes concentraciones de α-

HSA. Mediante un ajuste adecuado se puede determinar la constante de afinidad de la pareja
antígeno/anticuerpo objeto de estudio. El valor obtenido mediante este dispositivo es del
mismo orden que el recogido en la bibliografía para esta pareja Ab/Ag.

1.4

1.2
Inmunorreacción

1.0 HSA- α HSA

0.8
∆V (V)

0.6
Ajuste Langmuir
0.4

0.2 K=3.25E8 M-1

0.0 n=1.27
1E-10 1E-9 1E-8 1E-7

[Ab]
Fig. 4: Obtención de la constante de afinidad de lainmunoreacción.

Referencias:
L.M. Lechuga, A. Calle and F. Prieto. Química Analítica 19 (2000). REVIEW

68
BIOSENSORES NANOMECÁNICOS BASADOS EN MICROPALANCAS DE
SILICIO

J. Tamayo, L. M. Lechuga

La invención del microscopio de fuerzas atómicas (AFM, Atomic Force Microscope) en 1986
ha permitido la caracterización de superficies orgánicas e inorgánicas a escala nanométrica.
Este tipo de microscopía se basa en la medida de una fuerza entre una sonda de tamaño
nanométrico (punta) y la superficie de la muestra a analizar mediante la detección de la
deflexión de una micropalanca de silicio a la cual va unida la sonda. Las dimensiones típicas
de estas micropalancas son de 100 µm de longitud, 10 µm de anchura y espesor inferior a la
micra. La expansión de las técnicas AFM originó la comercialización de las micropalancas de
silicio.

Por otro parte, mediante numerosos experimentos realizados en los últimos años, se ha
demostrado que las micropalancas de silicio son lo suficientemente sensibles para medir la
fuerza correspondiente a un solo enlace entre moléculas biológicas complementarias (para
ello se inmoviliza una molécula biológica en la punta y su complementaria en la superficie de
un substrato). Esto ha dado lugar a un nuevo tipo de biosensor biológico basado en el uso de
dichas micropalancas. En estos dispositivos se inmovilizan, sobre la superficie de la
micropalanca, moléculas biológicas, tales como
anticuerpos, que se enlazan de forma específica
con aquella sustancia que se desea detectar. Cuado
el analito se enlaza a las moléculas previamente
inmovilizadas en la superficie, se produce una
respuesta de tipo nanomecánico en la
micropalanca que consiste en un cambio de la
deflexión y/o una variación de la frecuencia de
resonancia. La respuesta de la micropalanca se
mide generalmente mediante un sistema óptico
que consiste en un haz láser que incide sobre la
superficie final de la micropalanca y se refleja en
un fotodetector segmentado en dos sectores.

Existen dos modos de detección de la respuesta

nanomecánica de la micropalanca: modo estático y
Fig.1. Esquema del dispositivo biosensor. modo dinámico. En el modo estático, la magnitud
medida es la deflexión de la micropalanca. Las
moléculas receptoras se inmovilizan sólo en uno de los lados de la micropalanca. Cuando se
introducen en la solución las moléculas del analito, éstas se enlazan sobre la superficie
funcionalizada, produciéndose un cambio de la tensión superficial de este lado con respecto al
otro lado de la micropalanca, dando lugar a un curvamiento de la micropalanca y una
deflexión del orden del nanometro. Sin embargo, la deflexión de la micropalanca es muy
sensible a cambios de temperatura debido al efecto bimetálico. Generalmente sobre las
micropalancas de silicio se evapora una delgada capa de oro con doble propósito: por un lado
para que refleje perfectamente el haz láser y por otro lado para la inmovilización covalente de
las moléculas receptoras sobre esta superficie. El efecto bimetálico hace poco prácticos estos
dispositivos al ser necesarios tiempos de termalización de varias horas o bien la
microfabricación de micropalancas de referencia.

69
 En el modo dinámico se mide la frecuencia de
resonancia, que depende tanto del cambio de
tensión superficial como del cambio de masa. La
frecuencia de resonancia es inmune a cambios de
temperatura. Sin embargo la detección AC no ha
podido ser desarrollada en estos dispositivos
debido al bajísimo factor de calidad de las
micropalancas en medio líquido (Q∼1) , debido a
la fricción hidrodinámica de la micropalanca con
Fig.2. (a) Espectro de frecuencia de la el fluido. En este trabajo se ha desarrollado un
micropalanca en solución acuosa. (b) Espectro nuevo dispositivo biosensor basado en
de frecuencia con el sistema de control de Q
implementado en el dispositivo biosensor. micropalancas de tal forma que el bajo Q se puede
aumentar hasta tres órdenes de magnitud, mediante
un sistema de control del movimiento de la
micropalanca. Esto permite la detección AC de moléculas biológicas con una sensibilidad
muy alta.

En la fig. 1 se muestra un esquema del dispositivo. Sobre la superficie de la micropalanca se

evapora una delgada capa de Co para excitarla mediante un campo magnético AC. Para
aumentar el Q, la micropalanca se excita mediante dos señales: una sinusoidal a la frecuencia
de resonancia y otra de realimentación compuesta por la oscilación, detectada mediante el
sistema óptico, desfasada 90º y amplificada. Dado que la micropalanca se comporta como un
oscilador armónico, se puede demuestrar que el sistema de realimentación modifica el factor
de calidad efectivo en función de la ganancia del amplificador (G). En la figura 2, se puede
observar como este sistema de control aumenta el Q de la micropalanca desde un valor de 2-3
en solución acuosa hasta un valor de 625.

Este dispositivo ha sido aplicado para la detección de

antígenos mediante la inmovilización previa de los
Ab específicos en uno de los lados. Se empleó
detección AC y DC simultáneamente (Fig. 3).
Cuando en la celda de fluidos se introducen 5µl de la
misma solución tampón se produce un cambio de la
señal de deflexión debido al efecto bimetálico. Sin
embargo la señal AC es insensible a este efecto.
Cuando se introduce una concentración muy baja del
Ag (≈10-9 M), se produce un cambio de la señal de
Fig. 3. Adquisición simultánea en función del
tiempo de la deflexión y la frecuencia de deflexión debido, en parte, a la ligera variación de
resonancia de una micropalanca en la cual sobre temperatura entre la solución que se introduce y la
uno de sus lados se han inmovilizado anticuerpos. celda de fluidos, por lo que es difícil estimar la
La celda de fluido contiene 50 µl de buffer PBS.
respuesta inmunológica. Sin embargo, se produce
un cambio muy claro en la señal de la frecuencia de
resonancia. Actualmente estos dispositivos se están desarrollando para detectar mutaciones y
polimorfismos en genes humanos así como para la detección de contaminantes en aguas con
alta sensibilidad.

Referencias:
J. Tamayo, A. Humphris & M.J. Miles, 77, Appl. Phys. Lett. 582 (2000).
J. Tamayo, A.D.L. Humphris, A.M. Malloy & M.J. Miles, Ultramicroscopy 86 (2001).

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