Guía de Trabajos Prácticos

MATERIAL COMPLEMENTARIO

Plásmidos: clonamiento y complementación

Plásmidos y su uso como vectores

El DNA de una cepa bacteriana, puede ser extraído de las células por diferentes
procedimientos y puede separarse el DNA cromosómico del DNA extracromosomal
(plásmido). Con un extracto de DNA plasmídico, puede realizarse una electroforesis y
visualizar lo que se denomina el “perfil plasmídico” de una cepa bacteriana. Este
procedimiento tiene gran aplicación fundamentalmente en epidemiología. A partir de
plásmidos obtenidos en el laboratorio, ya sea provenientes de una cepa “portadora
natural” o construidos artificialmente, es factible transferir información genética contenida
en estas moléculas a una cepa bacteriana. Este procedimiento se denomina
transformación y consiste en forzar a una cepa a captar de alguna forma el DNA extraño.
Esta captación es en general más eficiente cuando el DNA a incorporar se encuentra
como una molécula circular cerrada. También las bacterias en la naturaleza, utilizan la
transferencia de DNA plasmidal como método habitual para intercambiar material génico,
aunque muchas veces está mediado por contacto entre una célula dadora y una receptora
(conjugación). En general los plásmidos son moléculas ampliamente utilizadas para
transferir información de una cepa a otra en el laboratorio

Fig. 1. (Izquierda) Bacteria con su material genético, el plásmido es un material extracromosomal

circularizado. (Derecha) Mapa característico de un plásmido con un origen de replicación, una zona de
multiclonamiento y un gen de resistencia para su selección.

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Digestión, clonamiento y ligación

Los plásmidos pueden ser modificados y de esta forma convertirse en una

poderosa herramienta de la biología molecular. Desde hace años son utilizados tanto para
la expresión heteróloga de proteínas como para la complementación de mutantes. Las
“tijeras” moleculares que nos permiten la modificación (eliminar o insertar segmentos de
DNA) de los plásmidos se conocen como enzimas de restricción.

Estas enzimas son endonucleasas que reconocen una secuencia entre 4-8 pb en
DNA de doble hebra, se encuentran en diversas especies bacterianas y desde su
descubrimiento produjeron un avance exponencial en las metodologías de biología
molecular y genética.

Su función in vivo se ha descrito experimentalmente como parte de un sistema de

restricción y modificación (sistema R/M). Este sistema podría compararse al sistema
inmune de los mamíferos, ya que la función principal es reconocer DNA foráneo y
degradarlo como mecanismo de defensa y protección (función de restricción). El DNA
propio no es degradado por estas enzimas, puesto que previamente ha sido metilado por
la acción de una metiltransferasa (función modificación).

Tipos de enzimas de restricción

Sistemas tipo I

Una sola enzima (multimérica, posee 3 subunidades) reconoce la secuencia

específica de DNA, metila y restringe. Pero la restricción no ocurre en el sitio de
reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.

Sistemas tipo II

Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el

sitio de reconocimiento o adyacente. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en el
clonamiento de genes, puesto que permiten romper el DNA en sitios específicos, y así,
recuperar secuencias conocidas.

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Sistemas tipo III

Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las
actividades enzimáticas, rompen el DNA 25-27 bp más allá del sitio de reconocimiento

Procedimiento

A. Digerir el DNA blanco y plásmido con una misma enzima de restricción

B. Ligar DNA blanco y plásmido.

C. Transformar células bacterianas con el producto de ligación obtenido en el paso anterior

D. Selección de
colonias

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Complementación en E. coli DH5

E. coli sintetiza una -galactosidasa que es capaz de hidrolizar el disacárido

lactosa en los monosacáridos glucosa y galactosa. La actividad de esta enzima puede ser
puesta en evidencia utilizando un sustrato cromogénico como el X-gal (5-bromo 4-cloro 3-
indolil  D galactósido) el cual es convertido por la -galactosidasa en un compuesto azul
insoluble. Muchos vectores comúnmente utilizados en el laboratorio para clonar genes de
interés (pUC, Bluescript, pGEM, pTOPO entre otros) portan un segmento del DNA de E.
coli conteniendo la secuencia regulatoria y la información codificante para los primeros
146 aminoácidos de la -galactosidasa. Inmediatamente adyacente a esta región del
plásmido se encuentra el sitio de multiclonamiento del vector, que mantiene intacto el
marco de lectura y resulta en la incorporación de unos pocos aminoácidos a la secuencia
de la enzima. Este tipo de vectores pueden ser utilizados en cepas de laboratorio que
expresan la porción carboxi-terminal de la -galactosidasa. Una cepa de este tipo por sí
sola no podrá expresar la enzima, pero cuando es transformada con el plásmido, la
-galactosidasa podrá sintetizarse de forma completa de manera de ser enzimáticamente
activa. Este tipo de complementación se denomina -complementación. Las bacterias
lac+ que resultan de esta -complementación, son fácilmente reconocidas en presencia
del sustrato cromogénico X-gal, observándose de color azul. La inserción de un fragmento
de DNA exógeno en la zona de multiclonamiento (polylinker) del vector resultará en la
producción de una subunidad de beta galactosidasa que no será capaz de complementar
la actividad enzimática, por lo que las colonias portadoras del plásmido conteniendo el

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inserto no serán capaces de metabolizar el sustrato cromogénico y se observarán
incoloras en los cultivos. Este método permite el screening (búsqueda) de miles de
colonias transformantes a la vez. Hay que considerar que el método de selección no es
infalible, ya que existe la posibilidad de que la inserción no inactive la capacidad de
complementación (sobre todo cuando se trata de insertos menores de 100pb que no
cambian el marco de lectura) y que no todas las colonias blancas porten plásmidos
recombinantes. Para corroborar que las colonias seleccionadas poseen el inserto de
interés es necesario extraer los plásmidos y corroborar mediante ensayos de restricción
y/o PCR específica la presencia de éste.

Fig. 2. Esquema del sistema de  complementación