DIAFANIZACIÓN DE TEJIDOS VEGETALES

SEBASTIÁN GIRALDO GÓMEZ

Microtécnicas
Medellín
2016
 Contenido

- Introducción
- Publicaciones destacadas
- Aplicaciones
- Revisión general de la técnica
- 3 estudios de caso
 DIAFANIZACIÓN

- Diáfano: del griego διαφανής ("transparente")

- Técnica mediante la cual una muestra biológica es aclarada, haciendo

algunos de sus componentes visibles a expensas de otros, mientras su
forma y estructura original se mantienen más o menos sin alteración.
(Gardner, 1975)

- Promovido por paleobotánicos: material de estudio consta

principalmente de impresiones de hojas

- Arquitectura foliar: estudio de los patrones de venación foliar

 DIAFANIZACIÓN

- Primera descripción de un método de aclaramiento foliar: Cirujano

Marcus Aurelius Severinus en Bartholini Epistolarum medicinal,
Centuria I (1645)

-- Largo periodo en H20

- Varios métodos de aclaramiento se han desarrollado

- Publicaciones científicas sobre todo (1940-2014)

 DIAFANIZACIÓN
Métodos de aclaramiento
 DIAFANIZACIÓN
Métodos de aclaramiento
 DIAFANIZACIÓN
Métodos de aclaramiento
 DIAFANIZACIÓN
Métodos de aclaramiento
 DIAFANIZACIÓN
Métodos de aclaramiento
 DIAFANIZACIÓN
Métodos de aclaramiento
 DIAFANIZACIÓN
Métodos de aclaramiento
 DIAFANIZACIÓN
Métodos de aclaramiento
 DIAFANIZACIÓN
Métodos de aclaramiento
Resumen de los principales compuestos utilizados históricamente
- Hidróxido de sodio (NaOH)
- Hidróxido de potasio (KOH)
- Hidrato de cloro (C2H3Cl3O2) ACLARAMIENTO AGENTE ACLARANTE:
- Etanol (C2H6O) (T°amb - ± 100°C) Disuelve
- Tolueno (C6H5CH3) selectivamente
componentes de los
tejidos
- Hipoclorito de sodio (NaClO)
- Hipoclorito de potasio (KClO) BLANQUEAMIENTO
- Hipoclorito de calcio (Ca(ClO)2)
- Peróxido de hidrógeno (H2O2)
- Trióxido de cromo (CrO3)
 DIAFANIZACIÓN
Métodos de montaje
- Referencias para el montaje y almacenamiento son escasas
 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones

- Varias oleadas de interés en el tema: creciente gama

de enfoques y aplicaciones

- Para todos los estudios a continuación: esencial tener

una manera de observar en detalle incluso las venas más
pequeñas
 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones

- Evolución de la forma y función de la hoja

 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones

- Mecanismos genéticos en la ontogenia de la venación

foliar
 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones
- Taxonomía y sistemática
 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones
- Taxonomía y sistemática
 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones

- Identificación de floras y manejo forestal

 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones
- Identificación de floras y manejo forestal
 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones

- Análisis cuantitativo de la venación foliar y otros sistemas

de redes
 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones
- Investigación en paleofloras y paleoecología
 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones

- Investigación en paleofloras y paleoecología

 DIAFANIZACIÓN
Aplicaciones

- Investigación en paleofloras y paleoecología

 DIAFANIZACIÓN
Revisión general de la técnica

- Una a varias células o tipos tisulares permanecerán debido a sus propiedades químicas o
físicas.

- Ej: La naturaleza densa y resistente de los elementos lignificados, a menudo asegura su

persistencia.

- Técnica apropiada se pueden hacer visibles: cristales, idioblastos, tricomas, laticíferos,

estomas, incluso núcleos.
 DIAFANIZACIÓN
Revisión general de la técnica
Pretratamiento
- Material fresco, fijado o seco

- tseco < tfresco  Alteración del protoplasto vs Pigmentos oscuros x Oxid. Enzimát. Comp.
Fenólicos

- Material fijado en 70 % et-OH u otro: puede acelerar aclaramiento

- Fijadores con formaldehído: perjudicial para el aclaramiento

• Entrecruzamiento de proteínas (Resistencia al tratamiento alcalino-Desintegración)

• Rxn con fenoles (Esp. taninos) formando polímeros negros (Blanqueamiento fuerte –
Desintegración)
 DIAFANIZACIÓN
Revisión general de la técnica
Disolución del protoplasma

- Primer paso: solución caústica alcalina (Pérdida del protoplasma por hidrólisis y oxidación)

- En este paso es casi universal que se presente oxidación fenólica: produce pigmentos
oscuros.
• Afinidad de estos fenoles con las proteínas: Protección para el tejido
• Si el material es muy pigmentando: usar 50% et-OH en la solución alcalina
• Tejido que se oscurezca con tratamiento alcalino: deber ser blanqueado

- Ácido en vez de base: normalmente son muy fuertes

 DIAFANIZACIÓN
Revisión general de la técnica
Tratamiento post-alcalino

- Pigmentos fenólicos producidos reducen transparencia, así se halla perdido el

protoplasma
• Lavados en H2O, 70%, 95% et-OH pueden remover parte de los pigmentos
(Innecesario el blanqueamiento)

- Otra razón poca transparencia: cristales (Oxalato de Calcio)

• 10% HCl @ 40°C x 2 h
 DIAFANIZACIÓN
Revisión general de la técnica
Blanqueamiento

- Blanqueadores oxidativos para remover los pigmentos oscuros

• Disuelven celulosa y lignina (Usar con cuidado)

- Blanqueadores reductivos parecen no haber sido usados.

• Diotinito de sodio (Na2S2O4): para tejidos poco decolorados. Opera en
condiciones neutras, no hidroliza celulosa.
DIAFANIZACIÓN
ESTUDIO DE CASO 1
 MANUAL OF LEAF ARCHITECTURE
MÉTODOS - Aclaramiento

- Hojas secas o frescas

- Hojas en contenedor de vidrio, cubiertas por malla de fibra de vidrio.

- Sumergir en 1-5% NaOH. (cambiar 1-2días)

- Blanquear en Clorox comercial x 5-30s

- Lavar en H20
 MANUAL OF LEAF ARCHITECTURE
MÉTODOS - Tinción

FUCSINA ÁCIDA

1. Lavado en 50% et-OH

2. Teñir con 1% Fucsina ácida x 3-8 min
3. Decolorar en 50% y 95% et-OH
4. Parar decoloración con 100% et-OH
5. Enjuagar en Aceite de clavo -> Xilol -> Almacenamiento temporal en
Xilol:HemoDe®
 MÉTODOS – Tinción

Espeletia sp. nov (Sonsón, Páramo de las Palomas)

Sin colorante Safranina Fucsina ácida Azul de toluidina Azul de metileno

 MANUAL OF LEAF
SECCIÓN I. CARACTERES SECCIÓN II. VENACIÓN Cct
FOLIARES Cct Estructura de la vena primaria 23 ARCHITECTURE
Inserción foliar 1 venas basales desnudas 24
número de venas basales 25
MÉTODOS - Descripción
filotaxia 2
venas agróficas 26
organización foliar 3
Estructura de las venas 2o
organización de los foliolos 4 principales 27 SECCIÓN III. DIENTES Cct
Inserción de los foliolos 5 Secundarias interiores 28 Espaciamiento de los dientes 44
Característica del peciolo 6 curso de las secundarias menores 29 número de órdenes de los
CARACTERES DE LA LÁMINA: Venas perimarginales 30 dientes 45
Posición de la inserción laminar 7 espaciamiento de las secundarias dientes / cm 46
Tamaño foliar 8 principales 31
forma del seno 47
relación foliar L:W 9 Variación del ángulo de las
formas del diente 48
secundarias 32
forma de la lámina 10 Vena principal 49
Inserción de las secundarias
simetría medial 11 principales 33
simetría de la base 12 curso proximal 34,1 terminación de la vena principal 50
simetría de la base 12 longitud de las intersecundarias 34,2 curso de las venas accesorias 51
lobulación 13 curso distal 34,3 características del ápice del
tipo de margen 14 frecuencia de venas 34,4 diente 52
DIAFANIZACIÓN
ESTUDIO DE CASO 2
PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES

- Protocolo completo con estrategias y procedimientos para

diafanizar hojas.

- Método de montajes permanentes de hojas aclaradas.

- En comparación con métodos tradicionales: rápido, bajo costo,

genera muestras que pueden ser fácilmente fotografiadas,
escaneadas y almacenadas.
PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES

- Medios de montaje tradicionales: serios problemas para

archivar hojas diafanizadas.

- El vidrio tiene cualidades ópticas y de archivo deseables. Su

rigidez conduce a la formación de burbujas (independiente del
sellador)
PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES

Bálsamo de Canadá: Burbujas, amarillamiento, cristalización Permount: Burbujas, pérdida colorante, cristalización
 PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS - Aclaramiento

- Hojas secas o frescas (50% et-OH x 2 semanas)

- Hojas fijadas en FAA: no aclaran fácil

 PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS - Aclaramiento

Algunos grupos presentan problemas en aclaramiento,

tinción o montaje:

- Helechos y Monocots acuáticas (frágiles)

 PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS - Aclaramiento

Algunos grupos presentan problemas en aclaramiento, tinción o

montaje:

- Rapateaceae y Bromeliaceae (mucílagos – NaClO)

- Hojas muy pubescentes

- Hojas coriáceas
PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS – Aclaramiento

(A) Leaf in glass container, covered

with nylon screening and weights.

(B) Leaf immersed in 5% NaOH.

(C) Leaves in oven at 40–54°C.

(D) Leaf partially cleared.

(E) Cleared leaf. H20 x 3 -->10min

(F) Leaf immersed in 4.5–5.5%

NaClO x 20s-10min. H20 x 3
->10min
 PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS – Tinción

FUCSINA ÁCIDA

1. Lavado x 2 en 50% et-OH

2. Fucsina ácida >24h
3. Decolorar en 50% et-OH x tvariable
4. Lavar 70% et-OH x 10 min
5. Decolorar en 95% et-OH + 3-6 gotas 37% HCl x 10-30min (Mesófilo -> blanco)
6. 2 veces en 100% et-OH x 10 min (Se puede dejar 1-2 semanas en 100% et-OH sin decolor.)
7. Antes del montaje en 100% et-OH >24h (Firmeza)
 PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS – Tinción

SAFRANINA

1. Deshidratar en serie de et-OH (50%, 70% & 95%) x 30 min

2. Safranina en 95% et-OH x 3h-1 noche
3. Lavar en 95% et-OH x 10 min
4. Decolorar en 95% et-OH + 3-6 gotas 37% HCl x 10-30min (Mesófilo -> blanco)
5. 2 veces en 100% et-OH x 10 min (Se puede dejar 1-2 semanas en 100% et-OH sin decolor.)
6. Antes del montaje en 100% et-OH >24h (Firmeza)
 PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS – Montaje

Caroplastic no catalizada es soluble sólo en acetona. Beaker solo para uso con Caroplastic y usar campana de extracción
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A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS – Montaje

1. Transferir de 100% et-OH a Acetona:et-OH (1:1) x 30 min

2. Sin dejar que la hoja se seque -> 2 veces a 100% Acetona x 30 min
3. Acetona:Caroplastic no catalizada (1:1) x 3h
 PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS – Montaje

4. Caroplastic + catalizador (30mL/4 gotas). Revolver >1min. Reposar 2-5min (Evitar burbujas)
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A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS – Montaje

5. Retirar de Acetona:Caroplastic no catalizada. Escurrir exceso de resina, sin dejar secar la hoja
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A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS – Montaje

6. Con la resina catalizada, montar entre hojas de Acetato de escribir

PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS – Montaje

7. Secar durante 1 noche. Poner

pequeños pesos sobre el acetato
(Mantener hoja plana)
8. Horno 40–54°C x > 3h
(Polimerización). Si no hay horno,
secar x 48h
9. Dejar enfriar, retirar excesos de resina
y/o recortar acetato con tijeras
calientes. Archivar
 PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
MÉTODOS – Toma de imágenes

- Resina tiene excelentes propiedades ópticas, pero se recomienda fotografiar antes del
montaje en resina (Daño o decoloración)
- Flotar en 100% et-OH en recipiente de vidrio
- Fotografiar observando en un estereomicroscopio con iluminación de fondo
- (Katifori and Magnasco, 2012) usaron escáner especial. Fotos de 6400dpi (1 sola foto)

(Katifori and Magnasco, 2012)

 PREPARATION OF SAMPLES FOR LEAF ARCHITECTURE STUDIES,
A METHOD FOR MOUNTING CLEARED LEAVES.
CONCLUSIONES

- Método de montaje reduce el tiempo de secado de 3 días (Permount) a 3 semanas (Bálsamo

de Canadá)
- Largos periodos de almacenamiento en buenas condiciones (± 37 años) (Sin burbujas ni
decoloración)
 DIAFANIZACIÓN
ESTUDIO DE CASO 3

Publicado en Biotech Histochem (1992)

TECHNIQUES FOR CLEARING OVULES FOR STUDIES OF MEGAGAMETOPHYTE AND EARLY
POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON

- Biología reproductiva: 33.600 óvulos

de Rhododendron nuttallii T. W. Booth
(Ericaceae) [2000 óvulos/carpelo]

- Megagametofito y postfertilización
temprana

- Intervalos diarios desde la antesis hasta

3 semanas después de la polinización.
TECHNIQUES FOR CLEARING OVULES FOR STUDIES OF MEGAGAMETOPHYTE AND EARLY
POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON

- Alto número óvulos:

• Secuencia de desarrollo
• Rango de variabilidad

- Óvulos seccionados
• Reconstrucción con base en varias
secciones

- Aclaramiento de óvulos completos

• Conservar relaciones 3D
TECHNIQUES FOR CLEARING OVULES FOR STUDIES OF MEGAGAMETOPHYTE AND EARLY
POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
MATERIALES Y MÉTODOS
Disección, fijación y procesamiento de segmentos de ovarios

- Ovarios enteros y disectados (4-5 transversales) (FAA 24h-48h  70%

et-OH)

• Enteros: desarrollo tubo polínico

• Disectados: megagametofito (se extrajeron óvulos)

- Hidratar en serie de et-OH (50%, 30%, 10% x 15min)

- Varios cambios en H2O

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POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
MATERIALES Y MÉTODOS
Remoción de almidón

- Óvulos jóvenes (2-3 semanas < antesis): NO REQUIEREN

- Óvulos viejos: Almidón del gametofito e integumento

• 4% Amiloglucosidasa (Amilasa) en buffer acetato 0.2M – pH 4.5 x 4-5 días
@ 37°C

- Lavar en H2O
ERROR?: α-amilasa (Hongos)  Amiloglucosidasa (±)
TECHNIQUES FOR CLEARING OVULES FOR STUDIES OF MEGAGAMETOPHYTE AND EARLY
POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
MATERIALES Y MÉTODOS
Remoción de taninos

- Taninos se depositan antes que los almidones

- Solución de Stockwell [t es crítico α (sp. + nivel de desarrollo)]

Jóvenes: NO REQUIEREN
• 10 mL Ácido acético
• 1 g Ácido crómico (Color: Café pálido)
• 1 g Dicromato de potasio
• 90 mL H2O Viejos (Antesis 3 sem. > polinización)
- 20h @ Tamb
- Varios lavados 0.1% Bicarbonato de sodio (y overnight)
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POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
MATERIALES Y MÉTODOS
Aclaramiento

- Solución de Herr 4½ [2:2:2:2:1 en peso] Alternativa: Salicilato de metilo

• 2: 85% Ácido láctico
• 2: Hidrato de cloral
• 2: Fenol cristalizado
• 2: Aceite de clavo ¿Tinción antes que aclaramiento?
• 1: Xilol

- 1: Benzoato de bencilo (BB)

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POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
MATERIALES Y MÉTODOS
Tinción
- Tinción:
• Hematoxilina de Mayer x 2
días

- Decoloración :
- Decoloración (Alternativa) :
• 0.5% Ácido acético (Malos
• 70% et-OH x 1día-2semanas
resultados)
• BB:Herr 4½ x 0.5-1h
• 2% Ácido acético (Acelera –
Resultados impredecibles: x
11h-24h)
• !Debe ser con monitoreo¡
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POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
MATERIALES Y MÉTODOS
Pos-Tinción

- Exceso de líquido decolorante:

• Absorción con Papel filtro
- 50% et-OH x 1 min
- 100% et-OH x 1min
- BB:Herr 4½
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POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
MATERIALES Y MÉTODOS
Pos-Tinción

- Microscopio de contraste por interferencia diferencial (DIC)

- Observaciones c/hora (3-10h): Intensidad de coloración deseada
- Lavado 0.1% Bicarbonato de sodio x >12h
- Serie et-OH  100% et-OH
- Coloración dura 2-3 días, pero retienen buen contraste óptico
TECHNIQUES FOR CLEARING OVULES FOR STUDIES OF MEGAGAMETOPHYTE AND EARLY
POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
TECHNIQUES FOR CLEARING OVULES FOR STUDIES OF MEGAGAMETOPHYTE AND EARLY
POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
TECHNIQUES FOR CLEARING OVULES FOR STUDIES OF MEGAGAMETOPHYTE AND EARLY
POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

- No hay un protocolo único confiable para aclarar óvulos con

buen contraste óptico, ni siquiera para la sp. estudiada
(>33.000 óvulos¡)
TECHNIQUES FOR CLEARING OVULES FOR STUDIES OF MEGAGAMETOPHYTE AND EARLY
POSTFERTILIZATION DEVELOPMENT IN RHODODENDRON
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

- Aclaramiento permitió :
• Observar Todas las partes del óvulo
• Relaciones entre partes
• Procesar alto # de óvulos. Observar distintas posiciones (+ Foco)
• No hubo necesidad de hacer reconstrucción seriada
• Continuidad del desarrollo
• Tiempo tradicional ≈ Tiempo con aclaramiento (Almidón + Tanino)
• Ventaja en estudios cuantitativos
• Varios estados dllo. en 1 ovario: Estado α posición del óvulo, …