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U N I V E R S I D A D D E SUCÍRE:
F A C U L T A D DE E D U C A C I Ó N Y C I E N C I A S
D E P A R T A M E N T O DE B Í O L O G Í A Y Q U Í M Í C A
LABGa4TORfQ:D£ B Í O Q U Í M I C A
PROT^ESOI^: R A B O N L 0 2 A D A D E V I A

PRÁCTICA mm

ACTIVIDAD ENZíMÁJICA Y FACXQRÉS QUE LE AFECTAN

•1, RfARCO TEÓRICO : - - - " — r

t.1. DefinÉcfón .
Las- reacciones bioquímicas- se realizan con- gran, rapidez por• intermedio de catalizadores naturales
sfenommados snz/mss, Ei alio grado de especificidad y ia gran eficiencia de las enzimas hace que mediante
reacGionessecusnciales definidas se efectúan transformaciones de compusstos Qigánicos. Las enzimas están
aniversaímente presentes en los organismos vivos, y (a existencia de reacciones metabólicas comunes a todas
Í3S, cáíulas xeñeja Ja .espedficidad'de las enzimas responsables

Hast3 1926, todos los estudip? qye m realizaron sopre ías ^nzimas iban dirigidos al conocimiento de sus
efectos; osea, las enzimias se caracterizaban de acuerdo con las reacciones químicas que catalizaban. Debido
.3 su .capacidad de .cristalización, jas .enzimas ban sido iambléa invasísgadas desde .punto de vlsía
reracionadocon ta química de las pnDteínas.. Desde Juego,, eí avance de ios conocimientos, actuales sobre la
química de tas proteínas y sus procesos metabólicos ha venido del estudio de la naturaleza y mecanismos de
de i'as enzimas.

Una- parte importante det estudio- de tas células-vivas- esté hoy dí^dedicado a las erhzimas, puesto que todas las-
funciones fisiológicas, por ejemplo, la contracción muscular, la transmisión nerv^iosa y la excreción renal, ¿así
com.o la misnia vida» e-stáa inexQrable.m.e.rit9 llnadas a Ja actjvi^ad.de las .8,nzl.mas. Un proceso complejo, tal
<x>m0- ía eontraccíán muscular, que requiere la utilización de energja, puede distribuirse dentro de una serie de
{^acciones catalizadas por enzimas. Muchas de estas reacciones han sido ahora estudiadas "in vitro" mediante
.sstgmas .aislacíos .títüizando .enzimas p,ucgs cristalizadas.

1.2. Naturaleza general de ías enzimas

£-5 útil c,Q.nslcie-rar las propiedades generaJas de las enzim-as-.

Todas las enzimas son proteínas

Se desconocen catálisis biológicas de naturaleza no proteica. Las catálisis no proteicas incrementan la
.velocidad de las isacciones químicas, y .unas po.oas ,altera-h las veiocidades en un rango sLmllar a! ejercid.o por
)ás enzimas, pero estos casos no se han encontrado en los seres vivos. l.as enzimas presentan tamaños
considerablemente vanabíes, habiéndose descrito que el peso molecular de unas cuantas es tan pequeño como
10'*. Qerieralmente son jnás grandes, .pscilaüdo .su p,eso .molecular ,8nt.re .1.5 x lO" y 10®. Corno todas Jas
proteínasV las ervzimas-son lábiles- y pierden: su- actividad si se desnaturalizan-.

%Jí.2. Las ^nzin??,s . ^ ^ í ^ r g o Já yelpcidad d s ia xsaccióís quíniisa, psr.o no ,SJS .consiimer. .duraats .&!
proceso,
t a eficiencia de ¡as enzimas es extremadamente alta; una molécula de enzima puede catalizar la
feasfQrm.3C.ión,(l8 una a 10® isoiáculas .ds sustrato p.or irJnuío.

•1.2.3. Las ertifnTas presentan uii alfo grado de éspecrficídacf para s a sustrato
Algunas enzimas catalizan una reacción con solamente un conjunto simple de reactantes. Así la fumarasa
•ESíafíza la lriíerGG^".'^rsión.deKfum3F^^^^
 2

OH CO2
\ "
-OaC-CHa-C-GOa" « CH=CH + H2O
í /
H -O2C
L-Maiaío Fumaraío

Ni ei ivialeato, que es el esiereoisómero en cis del fumarato, ni el D-maiato son sustratos. Otras- enzimas
presentan un rango más amplio de especificidad. Por ejemplo, cada enzima proteolítica hjdroliza enlaces
pepí.ídicos, pero es .específica pa.ra enlaces formados por aminoácidos con diferentes g.rupos R. E.stas enzimas
muestran también una estricta estefeoéspeGifieidad-, al igual qbe la-fumarasa, y catalizan la hidrólisis de enlaces-
peptídicos fonmados solamente por L y no por D-am,inoácidos. Las enzimas también son específicas para el tipo
tís reacciones que catalizan, as Ha fum.a.rasa cataliza ia hid.'-atación o deshidratación de sus sustratos; l3.s
enzirnas proteoliticas- catalizar? una reacción hidrolítica- y no catalizan otras posibles reacciones- de sus
sustr3'tos; por ejemplo, reacciones de oxido-reducción o descarboxilación. Sin embargo, algunas enzimas tienen
un .'•ango más amplio de especificidad, así muchas 8nzim=.3s prot80iííiG.3s también catalizan .hidróü-sis de ásteres .
Gtioéteres.

1.2.4. La catálisis enzlmáífca i.nyoiue.ra la formación ds un complejo intermedio entre la enzi.rna y su

sustrato o sustratos

Ls inequívoc-a demo-Stración de la form,3c.ión de com.plejos snzima-sust.F-ato co.m>o i.nte.rnnediarios en las

reacciones- catalizadas por. eE>zimas fue ei mayor avance de la bioquímica.-Varios: investigadores.sugirieron su
existencia, pero quizá ninguno más elocuente e incisivo que Emil Fischer en 1890, cuyos experimentos con
glueocidas-as indicaron que e.sí.as snzim.as sonalíam-ente esíereoaspecíficas respecto a sus susíratos. El sugirió
una especificidad simiíar en fa estructura de las enzimas, la cual podría solamente explicarse si reaccionasen.la
enzima y.el sustrato. .Su-s hlpóte-sis han ..sido a.mp!Í3msn.t8 cií.adas.

Los estudios de todos los estudios posteriores han estado de acuerdo con la formación de un complejo enzima-
sustrato como intermediario de fa acción enzimática; dichos estudios han incluido análisis cinéticos,
snodlficación quíniica mediante reactivos aspecífIxíQs ds grupos R, inijibición de !a sn2}sría por compuestos
específicos- que interaccionan con el centro activo, determinación de las características espectrales de las
bandas de absorción cuando la enzima actúa sobre su sustrato y cristalografía con rayos X de las enzimas que
se. yma M ,(^újmpst0p .estructurales .semeianteis ,á ..s«s suíáraips.

1.2.5. La región de una enzima tjue interaccioná específicamente con el sustrato se denomina centro
sctivo
La conformación áe- .una e.nzima es ta! que ciertos grupos R dei. .8.-gn!j.e].eto poüpepíídico -ss .8r!cuenL':an en
yuxt^posicióh formando una estructura altamente específica que constituye el centro activo. La organización
espacial de las estructuras dei centro activo detenminaría no solamente qué compuestos pueden encajar
esíereosspscífjoameníe en i ! , sino también ias,características 4 9 JÍÍS acontecirrúeníos posteriores qu8 conducen
a ta conversión ]del sustrato en producto. La unión del sustrato al centro activo puede ocurrir mediante la
foonación de enlaces específicos no covalentes, incluyendo enlaces hidrofóbicos, interacciones electrostáticas y
pusní.es de hidróge.no. y.na ysz unido a este .sitio, el -sustrato se .aproxim.a a dete.nminados grupos específicos de
la enzima, tos cuales desestabilizan cooperativamente ciertas uniones del sustrato, haciéndolas más reactivas
fjuí.rnicamsnte. Muc-íias yec-es se fo.Tna un .enlace c^iyalenie transito-ric entre ei su-straío y la enzlm,3.

1.2.6> Las enzimas disminuyen la energía de activación requerida por una reacción química
Un conjunto de moléculas tienen, a temperatura constante, una energía cinética que se distribuye entre las
«lismas como lo puede .mo-sí.r.af .una curva parabóUcs.. A .uria tempe-ratur-a Ti, si conjusito .d.s m^ólécuias tiene una
energía insuficiente para dar lugar a una reacción química específica, pero sí la temperatura se eleva a T2, ia
distribución de la energía da lugar a.cambios como se podrían mostrar en uná.gráfica. A la tennperaíura T2 í^ay
gngrrtfa suficiente .na.ra Ir!.crefr!ení-3r ,8i nú.m.ero ds c-oLi-sion^s .entre las m.oléculas, lo que da Jugar a la ra-acción
QüírTTÍGa Por íanínf Guando ígrnperaíura paga de Ti a J-.., s! incremento de ig yeiociaad .de la rsaGción .ss &}
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resuiíádo de un incremento en el número de moléculas activadas, o sea, aquella fracción que posee la energía
de activación requerida.

1.2.7. Algunas enzimas ayudan en iareguiación de las velocidades de Feacción

Los organismos vivos generalmente no influencian la velocidad de sus reacciones metabólicas miediante
cami5!0-s de temperatura, ai pueden sabrevlvir a tem.peraturas altas. Por tanto, son necs-sarias las reacciones
catalizadas para que un procesa se realice con-
suficiente rapidez a la temperatura de un organismo. Sin embargo, si las reacciones biológicas importantes
tuvis-ssn !u§ar .sin Gatá-Usi-s, no p-odría ejsrc-erse ningún control -sobre sus velocidades. Si e! organism.o pierde el
control de la velocidad de sus reacciones químicas, se pierde el mantenimiento de su estructura y función
norma!-y muere.

Hay numerosos mecanismos reguladores del metabolismo, algunos de ellos operan a nivel de la misma enzima.
Las sustancias que incrementan o decrecen la velocidad de las reacciones catalizadas actuando directamente
sobre una enzima se denominan efectores. Ellos ejercen su acción alterando la esiructu.ra ds la enzim-a de
fórirra^qtre-sófo afecte a'ía-vefoadatfderlaTeácción.

I.2.S. La amiiasa sa^va^

La amiiasa. salival actúa sobre ios enlaces glicosídicos a-1,4. de polisacáridos como la- amüopectina. y ei
glicógeno. La hidrólisis es catalizada por el ion cloruro (C¡7 y oíros hafijros. Los productos finales son fen su,gran
m.ayona í?,-malto.sa y pocas cantidades de giuco-sa y m.altotriasa. Sé puede considerar que ios enj.acss a-1,6 y
a-1,4 de la maltosa no son afectados apreciabiemente. La amiiasa al igual que la mayoría de las enzimas se
verá afectada por c3,mbfos en el pH.

2. OBJETiVOS-
2.1. Determinar la actividad Peroxidasa del Hígado y de la. papa
2.2. Detennina!- los factores que afectan la actividad Pero.xida.sa ds hígado y de papa
2.3. Dstsnrnlnar laacílyiriad y los factores que afsfptanJa actiyidad gliccsidasa Üs la amiiasa saüya!

3. MATEFUAUESXBEACTiyOS
3.1. iVTATERÍALES
Tubos de ensayo y gra.cii!ía,.
Termómetro
Mo.rts.ro de porcelana
Beaker
Reloj*
Hielo*
Hígado fresco*
Papa frssca*

3.2rREÁeTiVOS
Agua oxigenada'
NaOHaí20%'
Reactivo dé Bené'dict
Solución de almidón al 1 %
Solución ds HÓl ai 30%

NOTA: Los maíeriales marcados con * debe traerlos el esí-udianíe.

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4. MÉTODO

4.1. A C C I Ó N DE LAS PEROXíDASAS D E L T Í Í G A D G Y DE LA PAPA

4.1.1. Tome dos tuijos de ensaya y agregue 2 nrrt de agija oxigenada a cada uno.. Tómete la'temperatura.
Anótela.
4.1.2. .Ai tubo #1 .agregúele u.n ped-azo ds híg-ado fresco, cuando vea cambio, íóm,slsiatsm.psr.3tura, Obse.r^^'e
durante' 5 minutos y repita ta temperatura.
4.1.3. Ai tubo #2 adicione ¡a misma cantidad de hígado pero triturado en e! mortero. Tome ia temperatura-al
.momento ds rsaccionar. Observe 5 m.inuíos. Ánots l-as obss.rvaciones. Sanue conclusiones.
4.1.4. Tome dos tubos de ensayo: Al tubo #1 colóquele un pedazo de hígado frescO: Al #2 la misma cantidad
de hígado pero triturado. Introdúzcalos en un baño de maría hin/iendo durante 5 minutos. SáqueJos y
agre-gue a cad-a uno 2 m.i ds agua o.xigsnada.
4.1 Repita el procedimiento anterior utilizando agua- fría (pedazos de hielo).- Observe. Saque conclusiones.-
-4.1.6. Tome un tubo de ensayo^ colóquele en su interior hígado triturado. Agregúele 2 mi de solución de
NaOH al 20%. Obsen/8 por 5 minutos, luego agrégusls 1 mJ ds agua o.xigsnada,
4,1.7. Repita-todos-los pasos anteriores-(1.2-,3.4i5,6) utilizando papa en trozos y-rallada-en-vez de hígado.

4.2.1. Tome 4tub0s.de ensayo, agregue, a. cada, uno 2 mJ.de.saliva

4.2.2. Al tubo #1 agregúele 1 mide solución de almidón al 1 % , deje en reposo a tsmiperatura ambiente por 5
minutos. Haga la prusba ds Bsnsdlct.
4.2.3. _ Al tubo.. #2..agregúele 2. mi de. solución. d,e. HCl. ai 3.0.%.. Observe durante. 2.minutos, hag.a. la prueba, d.e
Benedicí
4.2.4. Al tubo #3 calisnts ha-sta hsn/ir, agregue 1 .mi ds .solución ds aim-idón. Qbssn/e 5 .minutos, H-aga la
prueba de Benedict
4.2.5. En el tubo #4 agregúele 1 m! de almidón y unas gotas de Benedict
.(Ds-spu-és ds agrsgar Bsnsdict sn cada caso caliente y obsep/e).

5 ; "PREQÜNTAS
.5,1, En cuál ds los tubos dslaprim.er.a-parís seobser/aron bu.rbuj.as?
5.2, Qué gassefonnó en la primera-parte?
5.3, Cuál tubo presentó mayor reacción? Por qué?
5.4, Qué pape! ds-ssmpsña.s!.hígadO-y-la-p3pa.en-lar8ac~olón?
5.5,-Cómo aétúa-et..agua;OxigQn.a.da?-
5.6, Haga un listado dé enzimas que Ud, conozca con sus sustratos.
5.7-. Qué infiuencia-tubo.ia-tsmperatLira, HCl, NaOH-sobrs ta acción-catalítica?
5.8:. Se libera Calor en laS: reacciones enziniáticas? Por qué?

6. BiBLIOQRAFÍA
6.1, ALEMANY, y . YFONT, S. PrácficaB,ds.Bi0quimica. € d . Alhambra, España, 1933.
6.2, AMAR¡S, R, Y OTRO; Prácticas-de Bioquímica. Universidad de Antroquia Idiciones; MedellíOi 1995
6.3, PLUMiVIER, D,T. Introducción a la Bioquímica Práctica, McGraw Hill, Bogotá, 1981
6.4, WH!TE, .A. Y OTROS. Principios ds Bioquímica. 6^. Ed, N4cG.r.3y>'JHi}!d8 .México, 1985