I.

MARCO TEORICO

1.1. MICROBIOLOGÍA DE AGUAS

El principal riesgo asociado al agua en los abastecimientos es el de

enfermedades infecciosas relacionadas con la contaminación fecal. Por
esto, en el examen microbiológico del agua de beber se atribuye gran
importancia a la evaluación de la calidad higiénica del abastecimiento.
Para ello es necesario aislar y enumerar los microorganismos
indicadores. (CCAYAC-M-004, 2006)

1.2. MICROORGANISMOS INDICADORES

Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por

vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es
necesario contar con microorganismos que funcione como indicador de
contaminación fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y
exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a
la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse
extraintestinalmente. El grupo coliforme es constante, abundante y casi
exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las características de
sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino
también se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme
se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; conforme
mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad
de estar frente a una contaminación reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino

que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme
adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En productos
alimenticios que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización,
horneado, cocción, etc.), se utilizan como indicadores de malas
prácticas sanitarias. Los microorganismos coliformes constituyen un
grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la
mayoría de las especies que involucra. El grupo de bacterias coliformes
totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con
producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este
grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-

negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las
48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C.
Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más
prominente es Escherichia coli. La demostración y el recuento de
organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios
de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y
diferenciales.
1.2.1. ESCHERICHIA COLI:
Es un miembro de la familia de las enterobacteriáceas, y se
caracteriza por la posesión de las enzimas β-galactosidasa y β-
glucuronidasa. Se desarrolla a 44-45 ºC en medios complejos,
fermenta la lactosa y el manitol con producción de ácido y gas.
Abunda en las heces humanas y animales, en las heces frescas
puede llegar a concentraciones de 109 por gramo, puede estar
presente y hasta multiplicarse en aguas tropicales no sujetas a
contaminación fecal humana.
También se puede decir que es un bacilo corto Gram negativo
que se encuentra clasificado dentro de la familia
Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal
en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo,
hay algunas cepas de E. coli patógenas que provocan
enfermedades diarreicas. Estas E. coli se clasifican con base en
las características que presentan sus factores de virulencia
únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo
diferente. Las propiedades de adherencia a las células
epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por
genes situados en plásmidos. De manera similar las toxinas son
mediadas por plásmidos o fagos. Este grupo de bacterias se
encuentra constituido por las siguientes cepas:

 E. coli enterotoxigénica (ETEC)

 E. coli enteropatógena (EPEC)
 E. coli enterohemorrágica (EHEC)
 E. coli enteroinvasiva (EIEC)
 E. coli enteroagregativa (EAEC)
 E. coli enteroadherente difusa (DAEC).

Existen otras cepas que no han sido perfectamente

caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están
implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua
y alimentos contaminados. (Camacho, A., M.Giles, 2009)

 ESCHERICHIA COLI ENTEROTOXIGÉNICA (ETEC): Es

reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la
cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este
tipo de infecciones es muy frecuente en países
subdesarrollados y afecta principalmente a los niños.
Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos
 tipos de toxina. Una toxina termolábil de aproximadamente 89
kDa cuya secuencia, antigenicidad y función es similar a la
toxina del cólera, la otra toxina que produce es termoestable
y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir
temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos. La infección
puede ser adquirida por el consumo de alimentos como
vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis
infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente
108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis
infectiva puede ser más baja.

 ESCHERICHIA COLI ENTEROPATÓGENA (ECEP): Es

causa importante de diarrea en los lactantes particularmente
en los países en vías de desarrollo. La ECEP se adhiere a las
células de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de
virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las
células mucosas. La infección por ECEP provoca diarrea
acuosa generalmente auto limitada aunque en ocasiones
puede ser crónica.
Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la
intimina que es codificada por el gen eae y un factor de
adherencia que es codificado por un plásmido, ambas
proteínas permite su unión a los enterocitos y la destrucción
de las microvellosidades intestinales. Las epidemias
causadas por este microorganismo se deben al consumo de
agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con
voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de 106
microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con
múltiples serotipos específicos de E. coli los cuales pueden
ser identificados mediante la tipificación del antígeno O
(somático) y en ocasiones del antígeno H (flagelar).

 ESCHERICHIA COLI ENTEROINVASIVA (EIEC): Este

microorganismo se encuentra estrechamente relacionado
con el género Shigella, produce una enfermedad similar a
la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en
niños de países subdesarrollados y en personas que viajan
a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea
disentérica invasiva) al invadir las células epiteliales de la
mucosa intestinal.
A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a
100 microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva
es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas
características importantes de este microorganismo que
 permiten diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No
utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan
la lisina, es inmóvil y anaerogenicos.
La patogenicidad de este organismo se debe a su
capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido
a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas.

 ESCHERICHIA COLI ENTEROHEMORRÁGICA (EHEC):

Produce verotoxina, denominada así por su efecto
citotóxico sobre las células Vero, una línea de células
renales de monoverde africano. Existen al menos dos
variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado
con colitis hemorrágica, una variedad grave de diarrea; y
con el síndrome urémico hemolítico, enfermedad capaz de
producir insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica
microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina tiene
muchas propiedades similares a la toxina shiga producida
por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los
serotipos de E. coli que producen la verotoxina el más
común y el único que puede identificarse en muestras
clínicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea
sorbitol y es negativa a la prueba de MUG.
La causa más común de esta infección es el consumo de
carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne
picada procesada en grandes cantidades. Los casos de
colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas
pueden prevenirse mediante la cocción completa de la
carne. (Camacho, A., M.Giles, 2009)

En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y

síntomas causados por las cepas de Escherichia coli antes
descritas.
 1.2.2. MICROORGANISMOS COLIFORMES:
Conocidos también como coliformes totales desde hace largo
tiempo, los microorganismos coniformes han sido considerados
como un indicador microbiano. El término “microorganismos
coniforme” se aplica a las bacterias Gram-negativas, de forma
de bastoncillos, capaces de desarrollarse en presencia de sales
de la bilis u otros agentes tensoactivos con propiedades
análogas como inhibidores del crecimiento.
Tradicionalmente, las bacterias coniformes han venido siendo
consideradas como pertenecientes a los géneros: Escherichia,
Enterobacter y lebsiella. Sin embargo, según los métodos
taxonometricos modernos, el grupo es heterogeneo. Incluye
bacterias fermentadoras de la lactosa, tales como Enterobacter,
Cloacae y Citrobacter freundii, que puede encontrarse tanto en
las heces como en el medio ambiente (aguas ricas en nutrientes,
suelo, materia vegetal en descomposición), pueden multiplicarse
en agua potable de una calidad relativamente buena, por
ejemplo, Serratia fonticola, Rabnella aquatilis y Buttiauxella
agrestes.

1.2.3. ENTEROBACTERIAS:
La familia Enterobacteriaceae se encuentra ampliamente
distribuida en el medio ambiente. Las especies que la integran
son colonizadores normales del tracto intestinal del hombre y
animales de sangre caliente.
La familia Enterobacteriaceae tiene 26 géneros:
SALMONELLA, XENORHABDUS, TATUMELLA,
MORGANELLA, CITROBACTER, OBESUMBACTERIUM,
KOSERELLA, CEDECEA, KLEBSIELLA, ESCHERICHIA,
MOELLERELLA, LECLERCIA, PROTEUS, SHIGELLA,
BUTIAUXELLA, PRAGIA, PROVIDENCIA, EDWARDSIELLA,
YERSINIA, BUDVICIA, KLUYVERA, HAFNIA,
ENTEROBACTER, LEMINORELLA , EWINGELLA, SERRATIA
El uso de esta familia como indicador resulta útil para detectar
contaminación posterior, en aquellos productos que han sido sometidos
a algún tratamiento tecnológico, para evaluar la efectividad del proceso
y también en aquellos alimentos en los cuales no se realiza RAM
(Recuento de Microorganismos Aerobios Mesófilos Viables).
1.3. ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA
Al hacer el análisis de las aguas no buscamos tal o cual microorganismo
patógeno, es decir, no aislamos o identificamos los microorganismos
patógenos del agua, sino que averiguamos si esta tiene o no contaminación
de origen fecal.
El interés se centra en los microorganismos patógenos, que son los
diferentes tipos de bacterias, virus, protozoos y otros organismos, que
transmiten enfermedades.
 1.4. PARAMETROS BIOLOGICOS DEL AGUA
Todos los organismos que se encuentran en el agua son importantes en el
momento de establecer el control de la calidad de la misma sin considerar
si tienen su medio natural de vida en el agua o pertenecen a poblaciones
transitorias introducidas por el ser humano.
Se debe conocer la forma de los patógenos hídricos y determinar su
presencia y origen, la magnitud y oscilación de su número, el curso de su
ciclo vital y el índice de su supervivencia.
Hay muchos seres vivos que se emplean como indicadores de la calidad
de un agua. Así, según predominen unos organismos u otros, podemos
saber el estado de un agua.
Para que un organismo sea considerado como indicador microbiológico ha
de reunir unas condiciones que son:
 Debe ser incapaz de desarrollarse en el agua
 Debe tener una supervivencia en el agua superior a los organismos
patógenos
 Debe soportar mejor a los desinfectantes
 Deben ser muy abundantes en heces y escasos en otros medios
La normativa recoge una serie de análisis microbiológicos según se efectué
sobre el agua
 Un análisis mínimo: Coliformes Totales y Fecales
 Un análisis normal: los anteriores más bacterias aeróbicas a 37°C,
estreptococos fecales y clostridios sulfito reductores.
 Un análisis completo: los anteriores más aerobias a 22°C,
microorganismos parásitos o patógenos

1.5. METODOS DE DETERMINACION DE MICROORGANISMOS:

 Siembra en profundidad
 Siembra por extensión
 Métodos del número más probable (NMP)
 Métodos por filtración
 Impedancia
 Biología molecular

1.6. MÉTODO DE LOS TUBOS MÚLTIPLES (NMP NÚMERO MÁS

PROBABLE)
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del
Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este
grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al
incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que
contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase
presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo
que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la
recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren
presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como
fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de
cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite
el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las
sales biliares como el verde brillante.
La determinación del número más probable de microorganismos coliformes
fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y
se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y
producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por
un periodo de 24 a 48 h.
La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos
de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos
y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y
posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las
colonias típicas. (CCAYAC-M-004, 2006)

1.6.1. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1.6.1.1. PARA ANÁLISIS DE AGUA:

 5 ó 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril

sulfato de sodio o caldo lactosado concentración doble o triple
con campana de Durhama.
 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde
brillante con campana de Durham.
 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y
campana de Durham o caldo EC MUG con campana de
Durham.
 2 cajas Petri con agar para métodos estándar
 2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno
 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar
SIM (opcional)
 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser
o citrato de Simmons (opcional)

1.6.1.2. PARA ANÁLISIS DE ALIMENTOS

 1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o

solución amortiguadora de fosfatosa
 2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1
% o solución amortiguadora de fosfatosa
  15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato
de sodio concentración sencilla o caldo lactosado
concentración sencilla con campana de Durham
 15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde
brillante con campana de Durham.
 15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-
MUG con campana de Durham.
 2 cajas Petri con agar para métodos estándar
 2 cajas Petri con agar Mac Conkey
 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VP
 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar
SIM
 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o
caldo citrato de Kosere

1.6.2. SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

 Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovac

 Frascos gotero con indicador rojo de metilo.
 Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1
 Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 %
VP2
 COLORANTES PARA TINCIÓN DE GRAM

1.6.3. MATERIAL Y EQUIPO

 Mechero
 Propipeta
 Gradilla
 Balanza granataria
 Stomachera
 Bolsas para stomacher
 Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366
nm)
 Lentes de seguridad
 Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodón
 Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodón
 Pipetas Pasteur estériles
 Asa bacteriológica
 Portaobjetos
 Microscopio óptico
 Termómetro calibrado
 Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.
  Incubadora a 35° ± 2,0ºC
 Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°C
 Autoclave

DETERMINACION DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO

POTABLES

FUENTE: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-tot-fecales-Ecoli-NMP_6529.pdf
DETERMINACION DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SOLIDAS O
ALIMENTOS

FUENTE: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-tot-fecales-Ecoli-NMP_6529.pdf
 BIBLIOGRAFIA
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009.
Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de
Química, UNAM. México.
CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica
del número mas probable, detección de coliformes totales, cliformes
fecales y Escherichia coli por el número mas probable”