Aspectos Generales de la

Brucelosis Bovina

Jornada de Actualización Técnica

La Paloma, Rocha,
Uruguay, Marzo, 2003

Luis Ernesto Samartino M.V., Ms, Ph D

Email: lsanma@correo.inta.gov.ar
Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria
Castelar, Buenos Aires, Argentina
ENFERMEDAD INFECTO-CONTAGIOSA QUE
OCASIONALMENTE SE TRANSMITE DE LOS
ANIMALES AL HOMBRE
AGENTE CAUSAL: BRUCELLA

ZOONOSIS
BRUCELOSIS

Salud Pública
Salud Animal
Factores Económicos
Factores Sociales
Factores Políticos
Brucelosis Humana
Grupos de Riesgo
„ Médicos Veterinarios
„ Laboratoristas
„ Empleados de frigoríficos
expuestos.
„ Empleados de establecimientos.
lecheros (infectados).
„ Empleados de establecimientos de
carne (infectados).
 Brucelosis Humana
Grupos de Riesgo-Prevención
„ Empleo de guantes (tactos,
manipulación de fetos, lesiones
mamarias)
„ Quemar restos de fetos y placentas
„ Empleo de desinfectantes (amonio
cuaternario, alcohol 70º)
„ Manipulación correcta de jeringas y
frascos de vacunas contra la brucelosis
„ En determinadas circunstancias usar
anteojos protectores.
Brucelosis Bovina

„ Conocimiento de la enfermedad
„ Métodos de diagnóstico
„ Métodos de prevención
„ Eliminación de reaccionantes
positivos con destino faena
Brucelosis Bovina
Conocimiento de la Enfermedad

„ Etiología
„ Epidemiología
„ Patogénesis
„ Implementación de los
conocimientos adquiridos
Brucelosis Bovina
Epidemiología

„ Transmisión
„ Vías de Infección
„ Vías de Eliminación(fuente de contagio)
„ Movimientos de Animales
„ Prevalencia de la enfermedad en el
rodeo, adyacentes, cuartel, partido,
región, etc.
 Género Brucella
ESPECIE HUESPED

abortus Bovinos
suis Porcinos
Ovinos
melitensis
Caprinos
canis Canino
ovis Ovino
neotomae Neotomae lepida (roedor)
maris Mamíferos marinos
Brucelosis
Etiología
Biovariedades

„ Brucella abortus (8 biovars)

„ Brucella suis (5 biovars)
„ Brucella melitensis (3 biovars)
„ Brucella canis (1 biovar)
„ Brucella ovis (1 biovar)
„ Brucella neotomae (1biovar)
„ Brucella maris (2 biovares)
Brucelosis Animal
Vías de Entrada

„ MUCOSAS
„ La vía oral es la principal
„ Venérea en porcinos y caninos
„ En bovinos NO es una enfermedad
venérea a pesar de que el toro elimina
brucelas por semen.
Brucelosis Animal
Vías de Eliminación
„ Secreciones vaginales post partum-
aborto.
„ Sémen
„ Leche
„ Orina
„ Materias Fecales??????
Brucelosis Animal
Infección de un establecimiento
„ Ingreso por compras de animales infectados
„ Se debe conocer el estado sanitario de los
animales antes de incorporarlos al rodeo
„ Si no se conoce lo mejor es NO
COMPRAR!!!!
„ Si se conoce realizar sangrados en origen o
antes de incorporarlos al rodeo!!!
„ De todas maneras es conveniente realizar
una cuarentena previa a juntar los animales
„ Perros y otros animales pueden jugar un
papel secundario.
Brucelosis Bovina
Patogénesis
„ El género BRUCELLA está conformado
por bacterias capaces de invadir y
multiplicarse dentro de las células
fagocíticas y del tejido linfático.
„ La persistencia de BRUCELLA en las
células huéspedes es fundamental para
perpetuar la enfermedad.
Brucelosis Bovina
Patogénesis
„ Periódo de incubación!!!!!!
„ Se relaciona con el estado fisiológico del
animal
„ Puede variar desde 10/15 días hasta
varios meses.
„ Es corto en animales preñados
LA BACTEREMIA ES
IMPORTANTE EN EL HOMBRE Y
EN EL PERRO
Brucelosis Bovina
Patogénesis
„ Elsíntoma mas importante en
brucelosis bovina es el aborto tardío.
„ La eliminación de brucelas por vía
vaginal puede comenzar una semana
antes del parto/aborto hasta 45-60 días
posteriores al mismo.
„ La cantidad de brucelas excretadas es
variable y puede alcanzar hasta
1x1014/gramo de placenta (rumiantes).
 ALANTÓIDE
Tejido córion- AMNIO
alantoidio
Brucelosis Animal
Patogénesis
„ La eliminación de brucelas por vía mamaria es
intermitente pero se puede extender a lo largo de
la lactancia.
„ En el caso de necesitar ordeñar animales
infectados, estos deben pasar en último
término desinfectando las instalaciones con
posterioridad.

„ Se debe separar inmediatamente del rodeo a

los animales preñados en los que se
determine infección brucélica!!
Síndrome de las Vaquillas
Latencia en terneras
„ HIJA DE MADRE INFECTADA
„ Infección preparto
„ No detectable hasta la primera parición
donde generalmente aborta
„ Solo se produce en vaquillas de primera
parición
„ El porcentage estimado es menor al 2%
Diagnóstico

Circunstancias epidemiológicas.
CLINICO Manifestaciones clínicas.
Lesiones anatomopatológicas macroscópicas.

Diagnóstico bacteriológico (o de certeza).

LABORATORIAL
Diagnóstico serológico (o presuntivo).
 DIAGNOSTICO CLINICO

Abortos
Orquitis y
epididimitis

Síntomas clínicos
de la Brucelosis Esterilidad
animal
Lesiones
articulares
Animales
Retención nacidos débiles
de placenta
 TOMA DE MUESTRAS
DIAGNOSTICO
Identificación
Serológico Bacteriológico
Sangre, suero Fetos: Pulmón, líquido de
abomaso, hígado
Leche, semen Placenta, membrana
corioalantoidea
Leche, calostro
Animal Sacrificado: Ganglios,
bazo, hígado
CUANDO SE PRETENDE AISLAR BRUCELAS, NUNCA SE ADICIONARAN ANTIBIOTICOS
Y/O BACTERIOS
BACTERIO TATICOS A LOS MATERIALES RECOGIDOS, LOS CUALES SE
REMITIRAN RAPIDAMENTEAL LABORATORIO, REFRIGERADOS Y/O CONGELADOS
Diagnóstico Bacteriológico

• Es el diagnóstico de certeza. Se realiza en

escasas oportunidades debido a su
complejidad (bioseguridad).
• Aislamiento e identificación de especies y
biovariedades de Brucelas.

•Brucella es una bacteria Gram negativa,

muy simple
Diagnóstico Bacteriológico

• Diagnóstico bacterioscópico, cocobacilos Gram

negativos.
• Aislamiento: Sembrar con material sospechoso,
placas de agar triptosa con y sin suero e incubar a
37ºC en CO2
•Sembrar en medios selectivos, Kudas Morse,
Farrel.
•Brucella en primer aislamiento crece muy
lentamente y las colonias se ven a las 48-72 horas
•Tipificación e identificación de biovariedades.
AGENTE
CAUSAL

Coco bacilo

Bacteria Gram negativa

Diagnóstico Serológico de la
Brucelosis Animal

„ Pruebas serológicas, fundamento e

interpretación de las mismas.
„ Capacidad de los laboratorios para
realizar las técnicas de diagnóstico.
„ Metodología empleada en un área, país
o región.
Diagnóstico Serológico de la
Brucelosis Animal

„ Factores inherentes al antígeno

bacteriano, LPS, cadena O, proteínas
de membrana, dosis, etc.

„ Factores inherentes al huésped, edad,

sexo, preñez, salud, inmunoglobulinas,
clases, evolución de las mismas.
Diagnóstico Serológico de
Brucelosis

Detección de
anticuerpos circulantes

Inmunoglobulina Ambas se producen Inmunoglobulina

M Post-vacunación G
Post-infección
 Cepas de Brucella Lisa y Rugosa
Cadena - O

lisa

Lípido A Core

rugosa

Inmunodominante anticuerpos
INTA Castelar - Brucelosis
 cadena O

Lípido A Core
ANTIGENO A
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

1 2 1 2

1 2 1 2 1 2
1 3

ANTIGENO M
Diagnóstico Serológico de la
Brucelosis
„ Técnicas de „ Técnicas definitorias
screening o tamiz
„ Técnicas
„ Técnicas estandars anamnésicas
o clásicas

„ Técnicas
„ Técnicas de
experimentales
vigilancia
epidemiológicas
 Diagnóstico Serológico de la
Brucelosis
positivo
Sensibilidad X 100
positivo + falso negativo

negativo X 100
Especificidad
negativo + falso positivo
Diagnóstico Serológico de la
Brucelosis
„ Tamiz o Screening: „ Vigilancia
BPA, RB, RAP Epidemiológica: GD,
Ring Test
„ Clásicas: Wright,
Huddlesson, „ Nuevas técnicas:
Inmunodifusión
„ Complementarias: (poly B), Enzimo
Rivanol, 2-ME, FC inmunoensayos,
Polarización
fluorescente,
Técnicas usadas como tamiz
(screening)
„ Prueba de Antígeno „ Prueba de Rosa de
bufferado de placa Bengala (pH, 3.65)
(BPA) (pH, 4)
„ RAP test (técnica „ Prueba en placa de
automatizada que Huddleson
emplea como
antígeno el Rosa de
Bengala) „ ELISA
PRUEBA DE ANTIGENO BPA (Buffered Plate Antigen)

0,08ml SUERO 0,03ml ANTIGENO

MEZCLAR Y LEER A LOS 8 MINUTOS

NEGATIVO POSITIVO
SIN AGLUTINACION AGLUTINACION
 Técnicas Convencionales
Pruebas clásicas Pruebas complementarias
„ Prueba de „ Prueba del 2-
Huddleson (Método mercaptoetanol
de Placa) „ Prueba de Rivanol
„ Prueba de Wright
(Método de tubos „ Estas dos técnicas
que se expresa en inhiben las IgM
UI detectando IgM e presentes en el
IgG) suero.
PRUEBA EN TUBOS (WRIGHT) PRUEBA DE 2-MERCAPTOETANOL

1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º
TUBO TUBO TUBO TUBO TUBO TUBO TUBO TUBO

SUERO: 0,08 ml. 0,04 ml. 0,02 ml. 0,01 ml 0,08 ml. 0,04 ml. 0,02 ml. 0,01 ml.

DILUCION: 1/25 1/50 1/100 1/200 1/25 1/50 1/100 1/200

1 ML. DE SALINA FENOLADA 0,5% 1 ML. DE SOLUCION 2-ME 0,1 M.

30' A TEMPERATURA AMBIENTE

1 ML. DE ANTIGENO AL 2%

ESTUFA A 37ºC DURANTE 42-48 HRS.

LECTURA
Técnica de Fijación de
Complemento
„ Se emplea como técnica definitoria en
muchos programas de brucelosis
„ Es muy laboriosa y requiere de personal bien
entrenado
„ Necesita 4 componentes perfectamente
estandarizados para poder medir la actividad
de un quinto (suero problema)
„ Se puede realizar en tubos o placas. Se
recomienda la técnica que detecta el 50% de
unidades de complemento.
Técnica de Anillo en la Leche
(Ring test)
„ Se emplea como vigilancia epidemiológica en
bovinos de producción de leche
„ Originada en 1937, es de ejecución simple.
„ La leche debe estar en reposo al menos 48
horas y se deben evitar leches calostrales y
mastiticas.
„ Se realiza en forma individual o en tanque.
„ Un rodeo lechero cuya prueba del anillo es
positiva se lo califica como sospechoso,
debiendo recurrir al sangrado individual.
Diagnóstico de brucelosis
„ Tamiz o screening: Buffer plate
antigen (BPA)

„ Confirmatoria: Wright y 2-
mercaptoetanol

„ Definitoria: Fijación de Complemento

 Diagnóstico de Brucella canis y ovis

Aglutinación en placa con 2-ME

(Badakhsh et. al 1982)
Brucela canis
Gel difusión con Ag ovis y canis
Microaglutinación con Ag canis
(Carmichael et al 1999)

Fijación de complemento
Brucela ovis ELISA Indirecta
Gel difusión con Ag ovis y canis
Vacunación con Cepa 19
„ Cepa lisa
Anticuerpos detectables por ELISA,
FPA, Seroaglutinación, FC.

Solamente C-ELISA y FPA pueden

diferenciar estos anticuerpos de los
producidos por las cepas de campo de B.
abortus
 lisa lisa

Vacuna Cepa 19 Cepa de Campo

ANTICUERPOS
no diferenciables
por las pruebas
INTA Castelar - Brucelosis
clásicas
Secuencia de los títulos serológicos
en bovinos vacunados con cepa 19
tardíamente o con doble dosis
1:3200 IgM

1:1600
Sero-aglutinación en tubos (SAT)
1:800
.
1:400 IgG

1:200

1:100

1:50
2-Mercaptoetanol (2-ME)
1:25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tiempo en meses
Nuevas Técnicas
Objetivos

• Aumentar sensibilidad y especificidad.

• Eliminar subjetividad.
• Diferenciar animales infectados de vacunados.
• Económica, Sencilla, Rápida ...
 NUEVAS TECNICAS

„C ELISA

„ POLARIZACION FLUORESCENTE

Capaces de distinguir animales infectados con B. abortus

de vacunados con S19 e infectados con otras bacterias
Gram negativas que pueden tener reacción cruzada
ELISA
„ I-ELISA en suero
„ I-ELISA en leche
„ I-ELISA ovis
„ C-ELISA O-polisacarido
„ C-ELISA LPS
 ENZIMO INMUNOENSAYO DE COMPETENCIA (CELISA)

EQUIPAMIENTO NECESARIO

• Lector
de ELISA tipo Titertek Multiskan Plus MKII
para microplacas de 96 wells con filtro de 405 o 414.
• Shaker o agitador de placas
• Lavador de placas
• Micropipetas simples y multicanal
• Agua Milli-Q
• Microplacas NUNC de 96 well y fondo plano
• Heladera, Freezer, estufa de 28 a 37ºC.
•Vortex, timers, pH meter.
 ENZIMO INMUNOENSAYO DE COMPETENCIA (CELISA)
Monoclonal
Suero M84
Competencia
Fijar antígeno por antígeno
overnight

Negativo Positivo

Conjugado antiratón
Anti IgG1

Sustrato cromogeno
Temperatura amb.

Lectura
ENZIMO INMUNOENSAYO - ELISA

• IELISA
OD test sample x100
% P = ------------------------------- =
OD mean of BAC ++

• CELISA
OD test sample x100
% I = 100 - ------------------------------
-=
OD mean of BACc
 Polarización Fluorescente (FPA)
Antecedentes

1950s Mediciones de interacciones proteicas

1970s Sistemas biológicos, estudios sobre la interacción

receptor-hormanas, reacciones enzimáticas

1980s Niveles de drogas terapéuticas en sangre

1995, Diagnóstico de enfermedades infecciosas,

1996, Detección de toxinas en semillas

 CONCEPTOS BASICOS DE FPA

• Las moléculas rotan en medio líquido

• Las moléculas pequeñas rotan más rápidamente
que las grandes
• Las moléculas fluorescentes emiten fotones
• Un cambio en la emisión de fotones indica
cambios en el tamaño molecular
• Química interna de la unión anticuerpo-antígeno
CARACTERISTICAS DE FPA

• Homogénea
- tiempo de reacción de
segundos a minutos
- sin artefactos de fase sólida
• Reactivos estables
- sin enzimas, sustratos o
radioisótopos
• Altamente automatizables
- incubación única
- único reactivo trazador- receptor
- sin etapas de lavado
 Antígeno usado en FPA para
diagnosticar brucelosis
Cadena - O

lisa

Lípido A Core
Molécula isotiocianato
de fluoresceína
rugosa

Inmunodominante anticuerpos
INTA Castelar - Brucelosis
Polarización Fluorescente

Los resultados son expresados como unidades de

milipolarización (mP) del suero frente al antígeno.

Cálculo de las unidades de mP de cada muestra

mP = (Iv - (Ih x G) / (Ih x G) x 1000

Iv = intensidad vertical de la luz

Ih = intensidad horizontal de la luz
G = Factor de polarización
INSTRUMENTAL

1) EL SENTRY (Diachemic corporation) es un

instrumento para un tubo de ensayo que lee una
muestra por vez en tubos de 10mm x 75mm. Es
transportable al campo y puede funcionar una
hora sin fuente externa de energía.
2) EL POLARION (Tecan) es un intrumento para
multiplacas de 96 pocillos, capaz de procesar
1500 muestras por hora. Puede automatizarse
totalmente.
PROTOCOLO FPA

1) Agregar 10 µl de la muestra a 1 ml. de buffer

2) Leer el blanco
3) Agregar 10µl del antígeno
4) Incubar no menos de 2 minutos
5) Realizar la lectura de la muestra.
6) Las muestras con lectura de 10 mP mayores al
control negativo son consideradas positivas
 Polarización Fluorescente
Solución Buffer Cuando existen
+ partículas visibles,
Suero problema dejar equilibrar mas
tiempo

Homogeneizar y aplicar luz polarizada

Antígeno O-polisacárido
de
B. abortus 1119-3
conjugado con
isothiocyanato de
fluoresceina
Homogeneizar, incubar a tº amb. 2 minutos

Lectura aplicando luz polarizada

Polarización
Fluorescente Control Bovino Límite mínimo Límite máximo
BAC++ 211.9 272.8
BAC+ 95 164.5
Diluciones suero bovino BACv 60.9 89.3
1/100 BAC- 58.5 88.8
BAC Buffer 75.5 80.7

Suero Bovino Límite mínimo Límite máximo

Negativo BPA, SAT y 2-ME 58.5 88.8
hasta 200 SAT y negativo 2-ME 58.5 89.3
hasta 200 SAT y 25 2-ME 60.9 93.3
hasta 200 SAT y 50 2-ME 75.5 164.5
hasta 200 SAT y 100 2-ME 75.5 272.8
hasta 200 SAT y > 100 2-ME 90 272.8

Status Unidades mP
Negativo >104
Sospechoso 94 -104
Positivo <94

Colocar controles cada 100 muestras

Aplicaciones del FPA en el
diagnóstico de brucelosis
„ Diagnóstico serológico de la brucelosis
bovina
„ Diagnóstico con sangre entera(bovino)
„ Diagnóstico de la brucelosis porcina
„ Diagnóstico de la brucelosis caprina
„ Diagnóstico de la brucelosis en bisón
„ Diagnóstico con leche bovina
Polarización Fluorescente
Diagnóstico de la Brucelosis por PCR

Extracción de DNA a partir de muestras de

leche u otros líquidos orgánicos

Detección de Brucella sp. usando primers

flanqueadores de secuencias de DNA
específicas para cada Brucella sp.

Diferenciación debida a que cada Brucella sp.

tiene distinto numero de repeticiones en
tandem de genes que resulta en bandas de
diferentes tamaños.
Tiempo de duración de diferentes
tests de diagnostico en brucelosis
BPA 2-ME FC IELISA CELISA FPA

TIEMPO
8m 48h 48h 1.30h 1.30h 5m
 Diagnóstico de la Brucelosis Animal
Consideraciones finales

Ninguna técnica diagnóstica es capaz de

detectar el 100% de animales infectados

Cada país debe adecuar una metodología diagnóstica

acorde a sus posibilidades y necesidades

La elección de la metodología diagnóstica deberá basarse

en los objetivos que se fijen en el país o región.
 Polarización Fluorescente
Buffers
0.01M Phosphate buffered saline, containing 0.1% sodium azide and
0.05% lithium dodecyl sulphate, pH 7,2 ± 0.1
Sodium Phosphate Dibasic 1.100 gms
Sodium Phosphate Monobasic 0.315 gms
Sodium Chloride 8.500 gms
Sodium Azide 1.000 gm
Dodecyl Lithium Sulfate 0.500 gm

0.01M Tris / 0.15M NaCl / 0.05% NP40 / 10mM EDTA, pH 7.0

NaCl 8.50 gms
TRIS 1.21 gms
EDTA 3.72 gms
IGEPAL 500 µl
Agua milli Q 1000 ml
Phosphate buffer 0.01M
Sodium Phosphate Dibasic 1.10 gms
Sodium Phosphate Monobasic 0.32 gms
 BRUCELOSIS
PATOGENESIS
Animal preñado
vía hematógena
útero
Trofoblastos eritrofagocíticos del placentoma
infección contigua

Trofoblastos de la membrana corioalantoidea

(Ulceración y ruptura de la membrana)

Vía hematógena feto y placentoma

El endometrio no es afectado por brucella

INTA - CCVyA - Brucelosis

 BRUCELOSIS
PATOGENESIS Brucella

Mucosa oral o nasal

Dentro de Libres en la
los fagocitos circulación
Ganglios regionales (Inflamación)
Este proceso puede durar varios meses
Localización secundaria
Animal no preñado
Brucella

Destruídas por PMN y MO Invaden órganos del SRE

Bazo Hígado Médula osea
INTA - CCVyA - Brucelosis