CUANTIFICACION DE CARBOHIDRATOS

Juan Felipe Zambrano Bedoya1; Johan Nicolás Anzola Baquero2; Paula Andrea Vera Paz3
Programa de Biología, Facultad de Ciencias Básicas y Tecnologías, Universidad del
Quindío.

Resumen
En la práctica se realizó la cuantificación de carbohidratos utilizando el método de la
espectrofotometría, esto se hizo a partir de 9 soluciones problema, de las cuales 6 contenían
cierta cantidad de agua y las 3 restantes no, ya que tenían una sustancia especifica (sacarosa,
M1 y jugo de fruta), estas pruebas para cuantificar los carbohidratos están fundamentadas en
las propiedades reductoras y las reacciones que estos tienen con ácidos fuertes y fenol a altas
temperaturas, lo cual permitió obtener la absorbancia de cada una de las muestras en base a
estas reacciones.
Introducción
La palabra carbohidrato deriva históricamente del hecho de que la glucosa, el primer
carbohidrato simple que se obtuvo puro, tiene la formula molecular C6H12O6 y
originalmente se pensaba que era un hidrato de carbono C6 (H2O)6, este punto de vista se
abandonó pronto, debido a que al calentar un carbohidrato, se desprende agua y queda un
residuo negro de carbón. Sin embargo no es posible colocar el producto carbonizado en agua
y obtener el carbohidrato original (cuando se calienta un verdadero hidrato de carbono, se
obtiene una sal anhidra que si se combina nuevamente con agua, se puede formar el hidrato
original. “R. Burns (2003) Fundamentos de Química general”.
Los carbohidratos, al igual que el resto de biomoléculas, se determinan y cuantifican por
métodos que se fundamentan en sus propiedades diferenciales respecto al resto de
biomoléculas, en su caso la presencia del grupo carbonilo (además de ser polialcoholes). En
presencia de ácidos fuertes, los carbohidratos pueden hidrolizarse; los polisacáridos, por
ejemplo, se descomponen en sus unidades básicas. Las pentosas y las hexosas se deshidratan
produciendo furfural y derivados hidroximetilfurfural, que pueden condensarse con
compuestos fenólicos, dando lugar a productos coloreados que pueden utilizarse para
determinación de carbohidratos originales. “Roca.P (2003) Bioquímica técnicas y métodos”.
Si se escogen la fuerza del ácido, el periodo de reacción, la temperatura de calentamiento y
el fenol o la amina aromática, puede obtenerse la formación de un color que se asocie a la
presencia de un carbohidrato especifico o a una clase de carbohidrato, lo cual constituye el
fundamento de diferentes métodos de identificación y cuantificación de carbohidratos.
"Quesada. S (2007) Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica”
Figura 1 reacción de carbohidratos (hexosas y pentosas) con ácidos fuertes. Roca. P (2003)
Bioquímica técnicas y métodos.
Un procedimiento analítico muy utilizado en análisis cuantitativo es el llamado curva de
calibración que implica la construcción de una “curva de calibración”; esta es la
representación gráfica de una señal que se mide en función de la concentración de un analito.
La calibración incluye la selección de un modelo para estimar los parámetros que permitan
determinar la linealidad de esa curva y en consecuencia, la capacidad de un método analítico
para obtener resultados que sean directamente proporcionales a la concentración de un
compuesto en una muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo. En el
procedimiento se compara una propiedad del analito con la de estándares de concentración
conocida del mismo analito (o de algún otro con propiedades muy similares a éste). Para
realizar la comparación se requiere utilizar métodos y equipos apropiados para la resolución
del problema de acuerdo al analito que se desee determinar. “Dosal.M (2008) Introducción a
la metrología química “

Figura 2 grafica representativa de una curva de calibración.

Objetivos
 Cuantificar carbohidratos presentes en muestras biológicas mediante un método
espectrofotométrico.
 Realizar una curva de absorbancia con el fin de hallar la relación entre la
concentración y la absorbancia de cada una de las soluciones problema.
 Mediante la ecuación hallar las concentraciones desconocidas de las soluciones de
M1, Sacarosa y jugo natural.
Materiales

Tabla 1. Materiales y reactivos

Metodología
Se dio inicio a la práctica preparando soluciones acuosas de las muestras problema (para las
muestras 7, 8 y 9 se utilizó agua azucarada, jugo de frutas comercial y M1 (mono y
oligosacáridos) respectivamente.)
Se fueron agregando a cada uno de los tubos los reactivos correspondientes en el orden
asignado, siendo para los primeros seis: agua y sacarosa con su respectiva cantidad, 1mL de
fenol y posterior a esto 5mL de Ácido sulfúrico (H2SO4). A las últimas tres soluciones no se
les agrego agua ni sacarosa, todo esto tal y como lo muestra la tabla 2.

Tabla 2. Orden y cantidad de reactivos por muestra problema.

Seguido a esto se debían agitar de manera vigorosa cada tubo de ensayo con las muestras
hasta que estas estuviesen homogéneas, luego de esto se dejaron reposar a temperatura
ambiente durante 10 min, pasado este tiempo se agitaba nuevamente y se colocaban a
reposar por 20 min a 30°C en baño maría, posterior a esto se pusieron a enfriar a
temperatura ambiente. Una vez esto ocurriera se procedía a determinar la respectiva
absorbancia a 490 nm, ajustando el blanco con la solución obtenida en el tubo 1 (agua sin
muestra).
Resultados

De los tubos de ensayo preparados con diferentes volúmenes de sacarosa de 0,06 M se tiene
que.
Tubo Agua Sacarosa 0,06 Fenol (ml) H2SO4 (ml) Volumen final
(ml) M (ml) (ml)

1 1,00 0 1,00 5,00 7,00

2 0,80 0,2 1,00 5,00 7,00
3 0,60 0,4 1,00 5,00 7,00
4 0,40 0,6 1,00 5,00 7,00
5 0,20 0,8 1,00 5,00 7,00
6 0 1,00 1,00 5,00 7,00
Tabla 3
Con estas concentraciones de reactivos se midió la absorbancia en el espectrofotómetro y se
realizaron los cálculos respectivos (ver tabla 4, sección A), obteniendo resultados mayores a
3, donde se deduce que la concentración de cada analito era muy elevada. Para corregir estos
valores, se diluyeron los analitos en 10 ml de agua y se aplicó la formula (Ver formula 1)
para hallar la concentración de cada muestra problema (ver tabla 4, sección B).
𝐶1 𝑉1
 Formula concentración: C1V1=CFVF; donde se despeja Cf; Cf = 𝑉𝑓

Aplicando la formula a cada muestra

A B
0,06𝑀∗0,0 𝑚𝑙 0,06𝑀∗0,0 𝑚𝑙
T1: Cf = =0 T1: Cf = =0
7𝑚𝑙 10𝑚𝑙

0,06𝑀∗0,2 𝑚𝑙 1,71𝑥10−3 ∗0,1 𝑚𝑙

T2: Cf = = 1,71𝑥10−3 𝑔/𝑚𝑙 T2: Cf = 1,71𝑥10−4 𝑔/𝑚𝑙
7𝑚𝑙 10𝑚𝑙

0,06𝑀∗0,2 𝑚𝑙 3,42𝑥10−3 ∗0,1 𝑚𝑙

T3: Cf = = 3,42𝑥10−3 𝑔/𝑚𝑙 T3Cf = = 3,42𝑥10−3 𝑔/
7𝑚𝑙 10𝑚𝑙
𝑚𝑙
0,06𝑀∗0,2 𝑚𝑙 5,14𝑥10−3 ∗0,1 𝑚𝑙
T4: Cf = = 5,14𝑥10−3 𝑔/𝑚𝑙 T4Cf = = 5,14𝑥10−3 𝑔/
7𝑚𝑙 10𝑚𝑙
𝑚𝑙
0,06𝑀∗0,2 𝑚𝑙 6,85𝑥10−3 ∗0,1 𝑚𝑙
T5: Cf = = 6,85𝑥10−3 𝑔/𝑚𝑙 T5:Cf = = 6,85𝑥10−3 𝑔/
7𝑚𝑙 10𝑚𝑙
𝑚𝑙
0,06𝑀∗0,2 𝑚𝑙 8,57𝑥10−3 ∗0,1 𝑚𝑙
T6: Cf = = 8,57𝑥10−3 𝑔/𝑚𝑙 T6:Cf= 8,57𝑥10−3 𝑔/𝑚𝑙
7𝑚𝑙 10𝑚𝑙

Tabla 4
Teniendo en cuenta los valores finales, se midió la absorbancia en 490 nm de las seis
muestras, de este modo se pudo construir una tabla (Ver tabla 5) donde se relacionan los
valores de absorbancia y concentración de cada muestra, para realizar una curva de
calibración.
Tubo Concentración (x) Absorbancia (y)
1 0 0
2 1,71𝑥10−4 𝑔/𝑚𝑙 0,390
3 3,42𝑥10−4 𝑔/𝑚𝑙 0,687
4 5,14𝑥10−4 𝑔/𝑚𝑙 1,059
5 6,85𝑥10−4 𝑔/𝑚𝑙 1,234
6 8,57𝑥10−4 𝑔/𝑚𝑙 1,469
Tabla 5
Completando el componente de las reacciones con fenol y ácido sulfúrico, muestras de jugo,
sacarosa y M1 se sometieron a las reacciones dadas, se midió la absorbancia para cada
muestra y se obtuvo que la muestra de jugo y solución, marcaban una absorbancia mayor a 3
y M1 0,043. En este punto, la concentración de carbohidratos de la muestra de jugo era una
incógnita. Al realizar una curva de valoración, tomando los datos de relación de
concentración y absorbancia del tubo 1 al 6, se hallaría una ecuación lineal que permitiera
encontrar la concentración de carbohidratos del jugo.
En la tabla 5, se denota a la concentración en el eje x, y a la absorbancia (a modo de respuesta)
en el eje y. Haciendo una regresión lineal de la forma y=a+bx, se obtienen los valores a, b y
r. Donde a es el punto de corte del eje y (b) y b es la pendiente de la función (m). De la
regresión lineal se obtiene.
a= -3,67x10−5 (b); b= 5, 764x10−4 (m); r= 0,996
Con los valores obtenidos, se elabora una ecuación de la forma y = mx + b, donde se
reemplazan los valores y se obtiene despejando la x de la ecuación Y= 5,764x10−4 𝑥 -
3,67x10−5, Considerando que se necesita hallar la concentración de carbohidratos del jugo
y x en la función esta en términos de la concentración, se reemplaza el valor de la absorbancia
del jugo donde esta y y se obtiene la concentración del jugo. Se considera a la absorbancia
del jugo como 3,1.
Y=mx +b donde x= (y –b)/m
x= ((𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑗𝑢𝑔𝑜) +3,67x10−5)/ 5,764x10−4
x= ((3.1) +3,67x10−5 )/ 5,764x10−4
Y = 5378.27
Al reemplazar el valor de la absorbancia del jugo en la ecuación, se construye la curva de
valoración con los datos obtenidos, (grafica 1). En efecto, se infiere que el jugo posee una
elevada concentración de carbohidratos y como su absorbancia fue elevada, se concluye que
el resultado obedece a la ley de Beer Lambert, “a mayor concentración, mayor absorbancia”.
 CURVA DE CALIBRACIÓN
1.6
1.4
1.2
ABSORBANCIA

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 0.0006 0.0007 0.0008 0.0009
CONCENTRACIÓN
g/ml

Grafica 1
Conclusiones
 Un carbohidrato puede hidrolizarse en presencia de un ácido fuerte y calor, esto le
permite descomponerse en sus unidades básicas, las cuales posterior a condensarse
tienden a tomar una coloración característica, lo cual resulta útil para el momento en
el que se quiera saber qué cantidad o cuanta concentración de carbohidrato hay en
una muestra especifica.
 La prueba de espectrofotometría es bastante aceptable para poder cuantificar
carbohidratos, aunque se debe tener en consideración, el que si la muestra o solución
a la cual se le va a medir la absorbancia está muy concentrada, es necesario diluirla
en agua para que así el espectrofotómetro pueda realizar una correcta medición
 los resultados obtenidos en la práctica, en cuanto al valor de r indicaron un buen
comportamiento de la gráfica y dieron una idea de cuan perfecta fue, tomando como
valor de referencia el 1, esto nos da a entender que los procesos y los cálculos se
realizaron de manera correcta, ya que permitieron demostrar de manera acertada lo
que la ley de L-Beer da a entender y es el hecho de que a mayor concentración de
carbohidratos en la muestra, mayor será la absorbancia de esta.

Bibliografía

Quesada, S. (2007) Manual de experimentos para laboratorio de Bioquímica; EUNED editorial

universidad estatal a distancia.
Roca, P, Oliver, A M, Rodríguez. (2003) Bioquímica técnicas y métodos; Hélice Madrid
Dosal, M, Villanueva, M (2008) Introducción a la metrología química; Antología de química analítica
experimental.

J, I. Routh (1980). Compendio esencial de Química general, Orgánica y Bioquímica. Editorial

Reverte.
Burns, A (2001) Fundamentos de Quimica; PRENTICE-HALL