Determinación de riboflavina por la perturbación de oxígeno activo en una reacción química

oscilante

Resumen

Este artículo estudia la perturbación del oxígeno activo (O2? -! H2O2) producido a partir de la
riboflavina irradiada en una reacción química oscilante, y se propone un enfoque
metodológico nuevo y sensible para la determinación de la riboflavina.

La configuración experimental anautomática está diseñada para combinar la irradiación de

riboflavina con la reacción análoga de Belousov-Zhabotinskii, que se implementa en un reactor
de tanque agitado de flujo continuo (CSTR). El oscilador de la reacción catalizada por Mn (II)
entre la diacetona y el bromato de potasio en un medio ácido se utiliza para evaluar el efecto
de la perturbación.

La presencia de oxígeno activo inhibe la oscilación y da como resultado períodos de oscilación

más largos.

El cambio del período de oscilación es linealmente proporcional a la concentración de

riboflavina en el rango de 6.5? 10−9? 1,2? 10−7 mol / l, con un límite de detección de 2,4?
10−9 mol / l.

Se utilizan métodos potenciales y espectrofotométricos para monitorear la reacción. Se

investiga la influencia de las variables experimentales en la perturbación y se discute el posible
mecanismo de la acción del oxígeno activo en el sistema oscilante.

1. Introducción

Los sistemas químicos oscilantes son siempre complejos e involucran un gran número de
especies químicas, que pueden clasificarse como reactivos, productos e intermedios que
interactúan a través de un mecanismo inusual [1].

El uso de estas reacciones se ha centrado hasta ahora en términos físico-químicos con el fin de
dilucidar los complejos comportamientos no lineales observados en los sistemas
experimentales [2–4].

La reacción oscilante también ha sido de interés para algunos químicos analíticos que utilizan
el período de oscilación, la amplitud o el tiempo de inducción como parámetros analíticos
basados en la reacción de Belousov-Zhabotinskii (BZ).

En 1972, Zhabotinskii [5] encontró una correlación lineal entre la concentración de reactivo y
el período de la reacción BZ y propuso el uso de este fenómeno para

análisis químico; Yatsimirski reportó un aumento en la frecuencia de ciclos en presencia de Ru

(III / II) y aplicó este efecto en la determinación de trazas de rutenio.

ion [6,7]; J.F. Tyson et al.

determinado Hg (II) y Tl (I) en un colector de inyección de flujo (FI) de doble línea que incluye
una celda de flujo de 30 ml y un espectrofotómetro UV-VIS [8]; varios otros investigadores han
mejorado la idea al agregar diferentes catalizadores o inhibidores a la reacción para
determinar Fe (CN) 6 3− [9,10], Mn (II) [11], Cl− [12], Hg (II) y Tl (III) [13].
El reactor de tanque agitado de flujo continuo (CSTR) se usa ampliamente para garantizar que
la reacción oscilante esté permanentemente alejada del equilibrio termodinámico.

Recientemente, sistemas oscilantes que no involucran compuestos halogenados.

(En particular, la reacción catalizada por CuSO4 de peróxido de hidrógeno con ion tiocianato)
ha despertado una atención creciente [14].

Utilizando este sistema y el CSTR, el grupo de investigación Pérez-Bendito D. desarrolló la

técnica de 'perturbación del pulso analito' (APP) [15] y la aplicó en muchas determinaciones,
como glutatión [16], vainillina, paracetamol, ácido ascórbico [17]. ], ácido gálico, resorcinol
[18] y vitamina B6 [19].

La técnica de APP ha facilitado enormemente la aplicación de reacciones oscilantes en las

prácticas de monitoreo analítico, especialmente para analitos orgánicos.

El radical superóxido (O2? -) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) son dos tipos importantes de
oxígeno activo, que desempeñan un papel fundamental en la salud humana: pueden proteger
a la célula del ataque de virus y bacterias, y provocar daños oxidativos Proteínas, ADN y
peroxidación lipídica [20-22].

En presencia de iluminación UV, la riboflavina (VB2) produce un radical superóxido [23,24],

que es inestable en medio ácido y proporciona un producto de desproporción.

H2O2 [25]. Introdujimos la configuración de irradiación en el sistema de flujo y la combinamos

con el CSTR por primera vez.

Esta mejora puede evitar efectivamente que los errores provengan de la diferencia entre la
celda de muestra, el tiempo de irradiación, la distancia de irradiación de la celda de muestra
de la fuente de luz, etc., ya que todos estos factores están fijados en el aparato propuesto.

La interacción del oxígeno activo con el sistema oscilante Mn (II) -BrO3 −-diacetona-H2SO4
muestra que puede inhibir la reacción y alargar el período de oscilación.

A 303 K, el aumento del período de oscilación es linealmente proporcional a la concentración

de riboflavina en el rango de 6.5? 10−9? 1.2? 10−7 mol / l. Un estudio adicional de H2O2 en
ausencia de iluminación UV y riboflavina revela que su efecto de perturbación es muy similar al
de la riboflavina irradiada, lo que confirma que

El H2O2 es la principal especie activa en la reacción.

El método propuesto abre una nueva vía para el uso de la reacción BZ en la determinación
analítica.

2. Experimental

2.1. Reactivos

Todos los productos químicos utilizados fueron de grado reactivo analítico.

Las soluciones de diacetona, MnSO4 y KBrO3 se prepararon en 1,0 mol / l de ácido sulfúrico. La
riboflavina se preparó en tampón fosfato (pH 7,4). Se utilizó agua bi-destilada durante todo el
proceso.
2.2. Aparato

La configuración experimental utilizada para producir un radical superóxido a partir de la

riboflavina irradiada y para perturbar la reacción química oscilante se muestra en la Fig. 1. Los
componentes del colector incluyen un reactor de tanque agitado de vidrio de flujo continuo de
18 ml (CSTR), un agitador magnético (HJ- 3, Hangzhou Electric Instrument), una grabadora XY
(3086, Yokogawa Hokushin Electric), un espectrofotómetro UV-VIS de exploración rápida (941,
Kontron), una computadora de control, una lámpara de mercurio de alto voltaje (250W,? <380
nm, Wuhan Lámpara), un termostato (TB-85, Shimadzu), una válvula de inyección de seis
puertos y una bomba peristáltica (Masterflex, Cole-Parmer Instrument).

La reacción de oscilación en el CSTR fue monitoreada por un electrodo de platino y el

electrodo de referencia fue un electrodo de calomelano saturado.

El espectrofotómetro también se usó para controlar la curva cinética de los intermedios de

reacción durante la reacción.

El CSTR y los cuatro tanques que contenían soluciones de reactivos fueron equipados con una
camisa hermostada conectada al termostato.

El flujo de soluciones de reactivos a través del CSTR fue impulsado por la bomba peristáltica;

se utilizaron tres canales para administrar los reactivos y el cuarto fue la corriente portadora
de agua utilizada para transportar muestras inyectadas en el modo.

La solución en el cuarto canal fluía a través del tubo de PTFE que se enrollaba alrededor de la
lámpara de mercurio de alto voltaje.

Para eliminar el efecto térmico de la lámpara y mantener constante la temperatura de la

solución en el tubo de PTFE, la lámpara de mercurio de alto voltaje se instaló en el agua del
termostato. También se utilizaron tubos de bombeo de poli (cloruro de vinilo) y tubos de PTFE
(0,75 mm y 0,5 mm i.d.) para el colector.

2.3. Procedimiento

La temperatura del colector se termostató a 303 K. La bomba peristáltica suministró las

corrientes de reactivo (0.08 mol / l de MnSO4, 0.15 mol / l de KBrO3 y 0.1 mol / l de CH2
(COCH3) 2 en 1.0 mol / l de H2SO4) y una corriente de agua transportadora a un caudal global
constante de k0D3.7? 10−3 s − 1. Cuando los reactivos se mezclaron, el sistema comenzó la
reacción de oscilación de inmediato.

Después de que la amplitud y el período de oscilación se hubieran estabilizado, se inyectaron

secuencialmente concentraciones variables de riboflavina. Cuando la muestra fluyó a través de
la tubería alrededor de la lámpara de mercurio de alto voltaje, se irradió riboflavina y se
produjo un radical superóxido, que fue entregado por la bomba al CSTR para perturbar la
reacción de oscilación.

Después de que la oscilación recuperó su estado estable, se puede tomar una nueva
determinación. El cambio en el período de oscilación obtenido en presencia de oxígeno activo
se utilizó como parámetro medido para construir el gráfico de calibración.
 Fig. 1. Esquema experimental para la
determinación de riboflavina basada en la
perturbación del oxígeno activo en el sistema
de oscilación química Mn (II) -BrO3 −-
diacetona-H2SO4.

3. Resultados y discusión

3.1. Comportamiento oscilatorio típico

Los sistemas oscilantes son altamente vulnerables a las perturbaciones externas.

La oxidación catalizada por Mn (II) de la diacetona por BrO3 en un medio ácido fuerte implica
una oscilación sucesiva en las concentraciones de la forma oxidada y reducida del ion metálico
que da lugar a la formación y posterior desaparición

de un Br2-Mn (III) intermedio de color verde amarillento que gobierna la velocidad del proceso
y es responsable de los cambios de color observados.

La mezcla de reacción tiene un solo pico en la región visible a 405 nm correspondiente a la

absorción del complejo Mn (III).

En la interacción con este sistema oscilante, el oxígeno activo causó cambios en el período de
oscilación y después de la perturbación, el sistema recuperó gradualmente el estado estable.
Debido a que los cambios del período de oscilación fueron proporcionales a la riboflavina.

Las concentraciones y el sistema recuperados de la perturbación con bastante rapidez,

exploramos la posibilidad de aplicar este método a la determinación de riboflavina.

La Fig. 2 muestra los perfiles típicos para el sistema oscilante Mn (II) -BrO3 −-diacetona-H2SO4
en ausencia y presencia de perturbación. Se puede ver que a la concentración seleccionada, en
ausencia de iluminación UV, la riboflavina no causó ninguna perturbación en la oscilación.

Después de la irradiación, la cantidad traza de riboflavina dio lugar a períodos de oscilación más
largos.

Cuando la concentración de riboflavina irradiada estaba por encima de 5.0? 10−5 mol / l, el
sistema dejaría de oscilar y la interrupción de la irradiación puede restaurar la oscilación de
inmediato, lo que indica el efecto de inhibición del radical superóxido sobre la reacción de
oscilación.
La región donde se debe introducir la inyección es crítica. La muestra debe inyectarse cuando el
potencial está en su valor mínimo del ciclo, porque este es el punto donde el sistema responderá
al máximo a la perturbación.

El período entre los picos tercero y cuarto después de cada inyección respondió sensiblemente
a la perturbación y se seleccionó como el parámetro para evaluar la perturbación.

Cuando el sistema recuperó la oscilación normal, se podría realizar una nueva determinación.

Fig. 2. Perfiles típicos para el sistema oscilante Mn (II) -BrO3 −-diacetona-H2SO4 en ausencia y
presencia de perturbación. Las puntas de flecha 1, 2 y 3 indican el tiempo en el que se
inyectaron, respectivamente, 2,0 \ sim 10-8 mol / l, 4,0 \ sim 10-8 mol / ly 5,0 \ sim 10−5 mol / l
de riboflavina irradiada.

t0 es el período en ausencia de riboflavina; t1 y t2 son los períodos en presencia de 2.0? 10−8

mol / ly 4,0? 10−8 mol / l de riboflavina, respectivamente. Condiciones: 0.08 mol / l MnSO4, 0.15
mol / l KBrO3 y 0.1 mol / l CH2 (COCH3) 2 en 1.0 mol / l H2SO4, temperatura 303 K.

3.2. Influencia de las variables experimentales.

Se estudió el efecto de las variables experimentales sobre la reacción oscilante para establecer
las condiciones de trabajo óptimas para la determinación.

Para lograr la máxima sensibilidad y precisión posible de la determinación, así como la capacidad
de mejorar el rendimiento del análisis, se estudió la influencia de variables experimentales
seleccionadas en presencia y ausencia de riboflavina irradiada.

La diferencia de período 1t (1tDt − t0) obtenida en ambos tipos de condiciones se usó como el
parámetro medido.

La periodicidad en la tasa de evolución del calor durante la oscilación en algunos sistemas

autocatalíticos ha sido descrita por Körös et al. [26].

El efecto de la temperatura en el sistema de oscilación química Mn (II) -BrO3 −- diacetona-H2SO4

también se probó en este trabajo y se encontró que la temperatura tiene una gran influencia en
el sistema de oscilación.

Un aumento de 293K a 313K disminuyó dramáticamente el período de oscilación,

Sin prácticamente ningún cambio en la amplitud oscilante (potencial).

Mientras que la curva cinética monitoreada a 405 nm mostró que con el aumento de la
temperatura, tanto los períodos de oscilación como la absorbancia del intermedio de reacción
disminuyeron. La figura 3 es el cambio de la absorbancia intermedia a diferentes temperaturas
en un período de oscilación.

Por lo tanto, fue necesaria una temperatura constante para obtener valores de fondo estables
(t0). Desde el punto de garantizar reproducibilidad y aumentar el rendimiento.

Del análisis, se eligió una temperatura de 303K.

El efecto de la concentración de H2SO4 en el comportamiento oscilatorio se ilustra en la Fig. 4.

Se puede observar que las características del sistema de oscilación dependían en gran medida
de la concentración de H2SO4. Cuando se incrementó en el rango de 0.5 a 5.0 mol / l, el período
de oscilación disminuyó considerablemente.

En diferentes concentraciones de H2SO4, el color del sistema tomó diferentes transiciones, que
son de color verde amarillento a incoloro, de naranja a incoloro y de rosa a incoloro, con la Fig.
4.

Comportamiento oscilatorio del sistema oscilante químico Mn (II) -BrO3 −- diacetona-H2SO4 en

diferentes concentraciones de H2SO4.

Condiciones:

0.08 mol / l de MnSO4, 0.15 mol / l KBrO3 y 0.1 mol / l CH2 (COCH3) 2, temperatura 303 K.

Las concentraciones relacionadas de H2SO4 son 0.5 × 2.0 mol / l, 2.0? 3.5 mol / ly 3.5? 5.0 mol /
l, respectivamente. Estos fenómenos pueden deberse a la tasa productiva de Mn.

(III) aumentó mientras que la de Br2 disminuyó con el aumento de la concentración de H2SO4.

Sin embargo, la presencia de riboflavina irradiada dio un resultado como en la Fig. 5 (A). Por lo
tanto, elegimos una concentración de 1,0 mol / l como la concentración óptima.

El efecto de la concentración de MnSO4 se estudió en el rango de 0.025 a 0.15 mol / l. Se

encontró que el período de oscilación aumentaba al aumentar la concentración de manganeso
(II).

El efecto de la perturbación de riboflavina irradiada se puede ver en la Fig. 5 (B).

Se eligió una concentración de 0.08 mol / l de MnSO4 para experimentos posteriores, ya que
resultó en la máxima respuesta posible del sistema a la perturbación. La concentración de KBrO3
se investigó entre 0.1 y 0.3 mol / l. En ausencia de riboflavina irradiada, el aumento de la
concentración de KBrO3 causó la oscilación

Período para disminuir sin alterar la amplitud oscilante. Por otro lado, la perturbación con
riboflavina irradiada provocó una respuesta que se ajustó a una curva en la Fig. 5 (C). Se eligió
una concentración de KBrO3 de 0,15 mol / l como la óptima.
 Fig. 3. Efecto de la temperatura sobre la
absorbancia del intermedio en la
reacción de oscilación a la longitud de
onda de 405 nm. Los cambios de
absorbancia se dieron en un período a
cada temperatura de 303 a 316 K.
Condiciones: 0.08 mol / l MnSO4, 0.15
mol / l KBrO3 y 0.1 mol / l CH2 (COCH3)
2 en 1.0 mol / l H2SO4.

Fig. 4. Comportamiento oscilatorio del sistema de

oscilación química Mn (II) -BrO3 −-diacetona-
H2SO4 en diferentes concentraciones de H2SO4.

Condiciones: 0.08 mol / l MnSO4, 0.15 mol / l

KBrO3 y 0.1 mol / l CH2 (COCH3) 2, temperatura
303 K.
 Fig. 5. Influencia de la
concentración de (A) H2SO4, (B)
MnSO4, (C) KBrO3 y (D)
diacetona sobre una reacción de
oscilación con perturbación de
riboflavina irradiada de 2,0 × 10-
8 mol / l. Condiciones: (A) 0,08
mol / l MnSO4, 0,15 mol / l
KBrO3, 0,1 mol / l CH2 (COCH3) 2;
(B) 0,15 mol / l KBrO3, 0,1 mol / l
CH2 (COCH3) 2, 1,0 mol / l
H2SO4; (C) 0.08 mol / l MnSO4,
0.1 mol / l CH2 (COCH3) 2, 1.0
mol / l H2SO4; (D) 0,08 mol / l
MnSO4, 0,15 mol / l KBrO3, 1,0
mol / l H2SO4.

A medida que la concentración de diacetona aumentó de 0.025 a 0.25 mol / l, sin la

perturbación, el período de oscilación aumentó lentamente, mientras que la amplitud tuvo una
ligera disminución.

El efecto de la perturbación por la riboflavina irradiada se puede ver en la Fig. 5 (D).

Con el fin de garantizar una medición precisa y el mínimo detrimento posible de la sensibilidad,
se eligió una concentración de 0,1 mol / l de diacetona.

El momento en que la riboflavina recibe la radiación de la lámpara de alto voltaje es crucial en

la medición, porque es el factor clave que decide la salida del oxígeno activo. El experimento
demostró que el tiempo de 50 s es el tiempo óptimo de irradiación, ya que se puede obtener un
efecto de perturbación sensible y preciso bajo esta condición.

Hay dos factores que decidieron el tiempo de irradiación: uno es el caudal de la corriente
portadora y el otro es la longitud y el diámetro interior del tubo que rodea la lámpara de
mercurio de alto voltaje.

Finalmente, se investigó la influencia del caudal global k0 al CSTR.

k0 es el recíproco del tiempo promedio que una molécula pasa en el reactor.

Está dada por el volumen de líquido que fluye a través del reactor en unidad de tiempo dividido
por el volumen del reactor [27]. En un período del estado oscilatorio A (Fig. 6), el color en los
cuatro cursos (I, II, II y IV) tomó un color diferente como rosa, verde amarillento,

Naranja e incoloro respectivamente.

Tenga en cuenta que el estado A y el estado B son estables en k0D2.2? 10−3 s − 1.

Cuando k0 cambió en el rango de 2.7? 10−3 s − 1 a 6.4? 10−3 s − 1, no se observó ningún cambio
apreciable en el sistema oscilante.

A un tiempo de irradiación constante, se debe elegir un caudal lento para acortar la línea del
tubo, ya que cuanto más larga sea la línea del tubo, mayor será la resistencia que se producirá
desde la pared interior del tubo.

Sin embargo, aumentar el caudal puede acortar el tiempo necesario para restaurar el sistema
de oscilación después de la perturbación y, por lo tanto, mejorar el rendimiento de la muestra.

Por lo tanto, un índice de flujo de compromiso correspondiente a un flujo general de volumen

es aproximadamente igual a este, dado que el flujo es de 1 ml / min.

Fig. 6. Efecto del caudal en el

comportamiento oscilatorio en el
sistema de oscilación química Mn (II)
-BrO3 −-diacetona-H2SO4. En los
momentos indicados por las flechas,
se cambia el caudal. La tasa de flujo
en cada segmento de tiempo se
muestra en la parte superior.
[H2SO4] D1.0 mol / l; otras
condiciones ver en la Fig. 4.

3.3. Determinación de riboflavina.

El sistema oscilante se perturbó con diversas concentraciones de riboflavina en las condiciones

óptimas descritas anteriormente. Varios experimentos repetidos indicaron que existe una
relación lineal entre el cambio del período de oscilación (1t)

y la concentración de riboflavina en el rango de 6.5? 10−9? 1.2? 10−7 mol / l. Los datos de
calibración obedecen a la siguiente ecuación de regresión lineal (RB representa la riboflavina).

El límite de detección, calculado como la concentración de analito que produce una señal
analítica igual a tres veces la desviación estándar del período de oscilación

(nD30) en ausencia de perturbación [15], que se tomó como el blanco, se encontró que era de
2,4 a 10−9 mol / l.

La precisión, la desviación estándar relativa, calculada a partir de 11 perturbaciones de 4,0 ± 10-

8 mol / l de riboflavina, fue de 4.1%.
Teniendo en cuenta que cuando se usa la reacción de oscilación en el análisis, las variaciones
muy pequeñas en las condiciones iniciales significan que los errores experimentales podrían
aumentarse [8], tal precisión es bastante aceptable y el potencial de este método es claramente.

Bajo las condiciones experimentales descritas anteriormente, se permitió que el sistema

químico proporcionara una oscilación estable durante al menos 10 h, durante las cuales se
podrían aplicar tantas perturbaciones como sea necesario para implementar la determinación
analítica sin detener la oscilación. Según el tiempo necesario para que el sistema se recupere
después de cada perturbación, se puede estimar que el rendimiento es de 6? 9 muestras / h, lo
que es mucho mejor que el rendimiento típico de la muestra de enfoques discretos (1–2
muestras / h como máximo ).

3.4. Interferencias

Los sistemas oscilantes se alteran muy fácilmente por la presencia de especies extrañas.
Investigamos el efecto de algunos iones extraños y algunas posibles interferencias de sustancias
con estructuras químicas o características similares a las de la riboflavina.

La cantidad de una sustancia que causó un error de menos del 5% en la determinación de 4,0 \
sim 10-8 mol / l de riboflavina se tomó como el límite de tolerancia. El resultado obtenido se
proporciona en la Tabla 1. El ácido ascórbico y el tocoferol, que tienen fuertes efectos de
eliminación en el radical de oxígeno activo, mostraron una interferencia grave, ya que pueden
oxidarse con el radical superóxido.

La riboflavina se puede separar de las interferencias por el método de HPLC. De los métodos
disponibles para la determinación de riboflavina, la HPLC con espectrofotometría.

los métodos [28-31] son los más utilizados debido a la ventaja de la sensibilidad de la
espectrofotometría y la separación de la riboflavina de las interferencias.

El método propuesto exhibe una precisión similar a estos métodos espectrofotométricos y su

sensibilidad es mayor que la de dichos métodos y aquellos basados en TSP LC-MS y ESP MS [32],
debido a la perturbación específica del oxígeno activo en la reacción química oscilante.

3.5. Mecanismo de la acción del radical superóxido sobre el sistema oscilante.

Con el fin de aclarar el mecanismo del efecto de perturbación del radical superóxido en la
reacción de oscilación, se investigó el efecto de perturbación de H2O2 en ausencia de
iluminación UV y riboflavina.
Los resultados indican que el H2O2 tiene un efecto de perturbación muy similar al de la
riboflavina irradiada.

Se puede concluir que la principal especie activa en esta reacción es el H2O2 que se obtiene de
la irradiación de riboflavina.

La siguiente reacción puede jugar un papel importante en el sistema de investigación.

De acuerdo con el fenómeno experimental y los espectros de UV-VIS de exploración rápida en

el curso de la reacción, y la idea básica del mecanismo de FKN [33], así como el modelo caótico
de la reacción BZ informada por Györgyi et al. en 1991 [3], propusimos el posible mecanismo de
reacción de la acción del radical superóxido a través de H2O2 en el sistema de oscilación química
Mn (II) -BrO3 −- diacetona-H2SO4.

El sistema puede involucrar cuatro cursos de reacción importantes correspondientes a cuatro

partes.

(I, II, III y IV) en un período de oscilación (Fig. 6).

Cada una de estas reacciones es virtualmente irreversible y comprende algunas reacciones

elementales.

Se trata de dos ecuaciones químicas como se indica a continuación:

La producción de Mn3C domina la reacción en este curso, de modo que el sistema oscilante
adquiere un color rosa de Mn3C.

Este curso comprende las siguientes reacciones:

Es el curso que el Br− gasta mucho y el radical superóxido también puede aumentar el gasto a
través del H2O2. En este curso, la producción de Br2 domina la reacción (II) y el sistema tiene un
color verde amarillento con Br2.

Este es un proceso de retroalimentación positiva (autocatálisis) de BrO2, y el Mn3C produce

nuevamente como el mecanismo de FKN.

El sistema presenta una mezcla de color naranja de Br2 y Mn3+.

Quizás debido a la acción de catálisis de Mn3+, el Br− produce rápidamente y el sistema se vuelve
incoloro.

El mecanismo anterior muestra que es consistente con observaciones experimentales. La

reacción global =(A) + (B)+(C)+2(D)
Las curvas oscilantes en diferentes condiciones son la suma de los cuatro cursos principales.

Un curso diferente desempeña el papel dominante en diferentes condiciones, por lo que la curva
cinética toma una forma de onda diferente y el intermedio toma un color diferente.