BIOLOGÍA CELULAR

Grado en Biotecnología

Práctica 2. TÉCNICA HISTOLÓGICA I: FIJACIÓN,

INCLUSIÓN Y MICROTOMÍA

1
 TÉCNICA HISTOLÓGICA

Procedimientos para el tratamiento de las muestras biológicas

(organismos completos, órganos, tejidos o células) que permiten su
observación en el microscopio óptico o electrónico, de un modo lo más
parecido posible a su estado in vivo.

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 ETAPAS PARA LA PREPARACIÓN DE MUESTRAS
(TÉCNICA HISTOLÓGICA)

1. DISECCIÓN (aislamiento del material a analizar)

2. FIJACIÓN (conservación del material)

3. OBTENCIÓN DE SECCIONES HISTOLÓGICAS (delgadas)

A. PREPARACIÓN PARA LA MICROTOMÍA
- INCLUSIÓN Etapas similares para
Microscopía Óptica
- CONGELACIÓN
y Microscopía Electrónica
B. MICROTOMÍA (obtención de corte) de Transmisión

4. TINCIÓN O CONTRASTE DE LAS SECCIONES

5. MONTAJE

Preparaciones POST-VITALES
3
 1. DISECCIÓN

Aislamiento del material a analizar.

Material de disección Animal

Rapidez

Vegetal
Lupa con luz fría 4
 2. FIJACIÓN

Proceso mediante el cual las muestras biológicas se someten

a la acción de sustancias químicas (fijadores) o agentes
físicos que conservan la estructura de las mismas,
deteniendo los procesos de degradación que tienen lugar en
los organismos muertos.

No existe un “fijador ideal universal” para todos los

casos:
elección de preservación morfológica, molecular o
funcional.

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 2. FIJACIÓN

CONDICIONES DE UN BUEN FIJADOR

1. Detener los procesos de degradación (autolisis y

putrefacción).
2. Actuar rápidamente sobre la muestra (poder de
penetración) e insolubilizar los componentes celulares.
3. Conservar la estructura de la muestra de la forma más
parecida a su situación in vivo.
4. Dar consistencia a la muestra para manipulaciones
posteriores.
5. Incrementar la afinidad de los componentes de la
muestra por los colorantes o soluciones de contraste
(mordiente).

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 TIPOS DE FIJADORES

Calor
FÍSICOS
Frío

Agentes entrecruzantes
Agentes oxidantes
QUÍMICOS
Agentes precipitantes
Otros

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 TIPOS DE FIJADORES
QUÍMICOS
– Entrecruzantes
Entrecruzamiento o reticularización de proteínas a nivel de los
grupos aminos de los aminoácidos.
• Formaldehído (formol): usado para MO
• Glutaraldehído: usado para ME.

– Oxidantes
Reaccionan con las cadenas laterales de los aminoácidos de las
proteína y con otras moléculas como los lípidos provocando su
desnaturalización.
• Tetróxido de osmio (OsO4): cierto nivel de entrecruzamiento entre
las proteínas (proteínas son afectadas por el osmio: no útil para
inmunolocalización de antígenos) y elevada avidez por algunos
lípidos. Muy tóxico. Usado para ME.
• Dicromato potásico (K2Cr2O7): fija proteínas y fosfolípidos.
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 TIPOS DE FIJADORES
QUÍMICOS
– Precipitantes
Desnaturalización de las proteínas (modifican su estructura 3ª y 4ª y
su estado coloidal).
• Alcoholes (metanol, etanol), acetona y cloroformo: retiran el
agua del tejido; modifican la estructura 3ª y 4ª de las proteínas,
precipitándolas. Conservan muy bien la reactividad y
antigenicidad molecular pero no la morfología (retracción). Útiles
para estudiar ácidos nucleicos.
• Ácidos (acido acético): coagula los ácidos nucleicos y modifican
el punto isoelectrico de las proteínas (desestructuración de la
relación histonas y ácidos nucleicos).
• Sustancias metálicas: cloruro de mercurio (HgCl2) y dicromato
potásico.. El cloruro de mercurio reacciona con proteínas
formando proteinatos o sales insolubles. Elevada toxicidad.
- Otros: Ácido pícrico: propiedades precipitantes al formar sales
(picratos) con algunas proteínas. Excelente fijador para morfología.
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FACTORES QUE AFECTAN A LA FIJACIÓN

QUÍMICOS

1. Tipo de fijación
2. Tiempo de fijación
3. Concentración del fijador
4. Temperatura
5. pH
6. Velocidad de difusión / poder de penetración
7. Osmolaridad

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 FACTORES QUE AFECTAN A LA FIJACIÓN

1.Tipo de fijación

• INMERSIÓN
Las piezas de tejido se sumergen en la solución fijadora.
No siempre se fija la pieza de modo homogéneo.
Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de espesor.

• PERFUSIÓN
La solución fijadora se introduce a través del sistema circulatorio.
Fijación rápida y uniforme.
Continuación por inmersión en el mismo fijador en algunos casos
(postfijación).

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 FACTORES QUE AFECTAN A LA FIJACIÓN
1.Tipo de fijación
INMERSIÓN Y LAVADO

Relación volumétrica: Mínimo: 1 : 4 -5 (volumen pieza: volumen fijador).

Recomendado: 1 : 20
12
FACTORES QUE AFECTAN A LA FIJACIÓN
1.Tipo de fijación
PERFUSIÓN

Un organismo completo

Un órgano 13
 FACTORES QUE AFECTAN A LA FIJACIÓN

2. TIEMPO DE FIJACIÓN:

Depende de la naturaleza del tejido y del tamaño de la pieza.

Duración óptima variable según fijador (entre 2 horas y 2-3 días).

El exceso de fijación produce:

• Excesiva retracción y endurecimiento del tejido.
• Inhibición de la actividad de enzimas.
• Inactivación de antígenos.
FIJADOR Tiempo (h)
Paraformaldehído al 4% 12-24
Glutaraldehído al 4% 2-4

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 FACTORES QUE AFECTAN A LA FIJACIÓN

FIJADOR Conc. (%)

3. CONCENTRACIÓN DEL FIJADOR: Formol 4-10
Cada fijador tiene un rango de Paraformaldehído 4
concentraciones: Glutaraldehído 2-5
Tetróxido de osmio 1-2
Etanol 70
Ác. acético 100
Ác. pícrico Solución
saturada

4. TEMPERATURA DE FIJACIÓN:
Temperatura ambiente (técnicas generales de tinción).

0-4ºC (histoquímica, inmunocitoquímica): conservan mejor la actividad

enzimática y antigénica.

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 FIJACIÓN - Parámetros
5. EL pH DURANTE LA FIJACIÓN:
Ajustado al rango fisiológico (entre 6 y 8).
Uso de tampones: no deben reaccionar con el fijador ni con componentes del
tejido. • Fosfato (MO).
Algunos tampones usados en fijación • Cacodilato (ME).
• Citrato.
• Acetato.

6. VELOCIDAD DE DIFUSIÓN (PODER DE PENETRACIÓN):

Muestras pequeñas o delgadas.
Distancia penetrada proporcional a la raíz cuadrada del tiempo:
d=k t
FIJADOR K
k = coeficiente de difusión: distancia Etanol puro 1
en mm que el fijador penetra en el tejido
después de 1 h de fijación. Es específico Paraformaldehído al 4% 0.78
para cada fijador. Glutaraldehído al 4% 0.34
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 FIJACIÓN - Parámetros

7. OSMOLARIDAD DEL FIJADOR:

Presión osmótica del fijador expresada en moles de osmolitos (solutos
osmóticamente activos) por Kg de solvente.

Muy importante
para
microscopía
electrónica

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UTILIZACIÓN DE VARIOS FIJADORES PARA FAVORECER
LA FIJACIÓN DE DISTINTOS COMPONENTES DEL TEJIDO

QUÍMICOS
Uso sucesivo de dos fijadores: fijación secundaria o postfijación.

Utilización simultánea de varios fijadores (mezclas fijadoras):

• Fijador de Bouin: mezcla de un fijador entrecruzante (formaldehído) y dos

precipitantes (ácido pícrico y ácido acético) (5:15:1). Morfología. Glucógeno.

• Fijador de Carnoy: etanol, cloroformo y ácido acético (6:3:1). Ác.

nucleicos.

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MATERIAL FIJADO
QUÍMICOS

19
 A. PREPARACIÓN PARA LA MICROTOMÍA

Proceso mediante el cual las muestras fijadas se

infiltran con un material firme que da consistencia y
permite seccionar en cortes delgados de espesor
homogéneo.

Espesor de los cortes para microscopía óptica: 1-100 µm (3-10 µm).

Medios de inclusión: Parafina (bajo coste y fácil manejo).

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 INCLUSIÓN EN PARAFINA

¿QUÉ ES LA PARAFINA?
• Mezcla de hidrocarburos.
• No miscible con el agua (hidrofóbica).
• Fácilmente manipulable y barata.
• Sólida a temperatura ambiente.
• Punto de fusión: 40-70ºC (>punto fusión, >dureza). Uso 54-58ºC.
• Dureza óptima a temperatura ambiente para obtener secciones (3 µm).

En la inclusión en parafina, la parafina sustituye al medio

acuoso del tejido.

ETAPAS DEL PROCESO:

a. DESHIDRATACIÓN.
b. ACLARAMIENTO.
c. INFILTRACIÓN.
d. CONFECCIÓN DEL BLOQUE.
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 ETAPAS PARA LA PREPARACIÓN DE MUESTRAS
(TÉCNICA HISTOLÓGICA)

Fijar Lavar Deshidratar

(2-24 horas) (3 x 1 h) (1 h en cada alcohol)

22
 ETAPAS PARA LA PREPARACIÓN DE MUESTRAS
(TÉCNICA HISTOLÓGICA)

Estufa a 60 ºC

Baños
en xilol

Aclaramiento / Infiltración Confección del

Diafanización en parafina líquida bloque

(2 x 45 min) (varios baños de 24 h)

23
 a. DESHIDRATACIÓN

AGENTES DESHIDRATANTES: Etanol, acetona, metanol, etc.

- Difunden hacia el interior de los tejidos y se

intercambian con el agua de los mismos, que es extraída.

- Concentraciones progresivamente crecientes, para evitar corrientes

de difusión que provocarían daños en el tejido (retracción).

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 b. ACLARAMIENTO

- Los agentes deshidratantes (etanol) no son miscibles con parafina.

- Tratamiento intermedio del tejido con disolventes miscibles con

agentes deshidratantes (etanol) y con el medio de inclusión
(parafina).

 AGENTES ACLARANTES:

• XILENO (ó XILOL). Ejemplo de aclaramiento

Etanol-xilol 2:1 1 hora
• TOLUENO.
Etanol-xilol 1:1 1 hora
• CLOROFORMO. Etanol-xilol 1:2 1 hora
3 pasos Xilol puro 1 hora
• BENZOATO DE METILO.

25
 c. INFILTRACIÓN EN PARAFINA

Progresiva sustitución del agente aclarante por parafina

(por calor, el agente aclarante se evapora y la parafina ocupa su lugar).

ETAPAS (en estufa a 60ºC):

1. Mezclas de agente aclarante y

parafina con concentraciones
crecientes (2:1, 1:1 y 1:2) para
evitar corrientes de difusión que
deterioran el tejido.

2. Parafina pura (generalmente 2-3

pasos).

Ejemplo de inclusión
Xilol-parafina 2:1 2 horas
Xilol-parafina 1:1 2 horas
Xilol-parafina 1:2 2 horas
Parafina limpia 2-6 horas
2 pasos Parafina limpia 4-24 horas 26
 d. CONFECCIÓN DEL BLOQUE

Moldes: diversos en tamaño, forma y material.

ETAPAS:
1. Vertido de parafina líquida.
2. Depósito de la pieza infiltrada.
3. Solidificación completa de la parafina.
4. Confección de la pirámide.

27
 B. MICROTOMÍA

MICROTOMOS
Instrumentos de precisión con los que se obtienen series
ininterrumpidas de cortes de un grosor determinado y
uniforme que se depositan sobre una superficie de vidrio
(portaobjetos) para su examen microscópico.

• Tejidos incluidos en parafina u otros medios: MICROTOMO.

• Tejidos congelados: CRIOSTATO (CRIOMICROTOMÍA).

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 TIPOS DE MICROTOMOS

Microtomo de Criotomos o
rotación: tejidos Criostatos:
incluidos en parafina, tejidos congelados
3-5 µm. embebidos en OCT,
6-15 µm.

(tipo Minot)

29
MICROTOMO DE ROTACIÓN

Consta de:

-Portabloques

-Cuchilla

-Sistema de avance regulado

Tipos de cuchilla:

-Permanentes (de acero)

-Desechables (adaptador)

30
MICROTOMÍA DEL BLOQUE DE PARAFINA

1 2
4 3

31
MICROTOMÍA DEL BLOQUE DE PARAFINA

Bloque de parafina tallado situado

en el portabloques del microtomo

32
Recogida de secciones del microtomo
 MICROTOMÍA DEL BLOQUE DE PARAFINA

ADHESIÓN DE LAS SECCIONES A

SERIES DE SECCIONES
HISTOLÓGICAS PORTAOBJETOS:
(GROSOR DESDE 3-5 μm)

• Estiramiento de las secciones

(baño de agua histológico 37ºC).

• Pesca de las secciones con un

portaobjetos tratado con adhesivo
(albúmina de Mayer, gelatina, poli-L-lisina).

• Adhesión de las secciones

(estufa a 37º C, 12-24 h).

33
 MICROTOMÍA DEL BLOQUE DE PARAFINA

Separación de las secciones

1 3
Portaobjetos tratados con adhesivo
2 4

34
Estiramiento cortes parafina en baño templado Pesca de las secciones con portaobjetos
 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

1. Disección.

2. Fijación (más rápida y piezas más pequeñas de 0.5-1 mm3):

Fijación primaria: glutaraldehido al 2% (30 min – 6 horas).
Lavado con tampón cacodilato sódico 0,2 M.
Fijación secundaria: tetróxido de osmio (1 hora).
Lavado con tampón cacodilato sódico 0,2 M.

3. Obtención de secciones ultrafinas (50-100 nm):

Deshidratación: concentraciones crecientes de etanol o acetona.
Aclaramiento: agente intermedio (óxido de propileno).
Infiltración: resinas líquidas constituidas por monómeros.
Confección del bloque: polimerización de los monómeros.
Ultramicrotomía.

4. Montaje en rejillas metálicas.

5. Contraste de las secciones (tinción positiva: citrato de plomo y acetato de uranilo).

Observación de rejillas y moldes de resina

PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

Confección del bloque

VERTIDO EN MOLDES Y
POLIMERIZACIÓN DE LA
RESINA EPOXI (60ºC)
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

CUCHILLAS DE VIDRIO
ULTRAMICROTOMO CON BALSA DE AGUA
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

Pesca de las secciones con las rejillas de cobre

Protocolo óptimo de tratamiento del tejido para fijación en formaldehido al
4% e inclusión en parafina.
PROCESO ACTIVIDAD TIEMPO

FIJACIÓN 1. Fijación en Formaldehido 4% (renovando el fijador un par de veces) 6-48 horas, según tamaño
(temperatura ambiente 2. Lavado abundante en agua destilada, renovando el agua varias Varios lavados (1 hora),
o nevera 4ºC) veces para extraer el exceso de fijador según tamaño
3. Etanol 30% 1 - 2 horas
4. Etanol 50% 1 - 2 horas
5. Etanol 70% 1 - 2 horas (o más)
DESHIDRATACIÓN
6. Etanol 90% 1 - 2 horas
(temperatura ambiente)
7. Etanol 100% 1 - 2 horas
8. Etanol 100% 1 - 2 horas
9. Etanol 100% 1 - 2 horas
10. Etanol-xilol 2:1 1 hora
11. Etanol-xilol 1:1 1 hora

ACLARAMIENTO 12. Etanol-xilol 1:2 1 hora

(temperatura ambiente) 13. Xilol 45 min - 1 hora
14. Xilol 45 min - 1 hora
15. Xilol 45 min - 1 hora
16. Xilol-parafina 2:1 2 horas
17. Xilol-parafina 1:1 2 horas
INFILTRACIÓN 16. Xilol-parafina 1:2 2 horas
DE PARAFINA
(estufa 60-70ºC) 17. Parafina 2-6 horas
18. Parafina 6-24 horas
19. Parafina 6-24 horas
CONFECCIÓN DEL BLOQUE
20. Confección del bloque 39
(dejar enfriar a temperatura ambiente)