2016 PDF

CRIOTOLERANCIA ESPERMÁTICA Y EFECTO DE LOS
ANTIOXIDANTES Y EL SISTEMA DE EMPAQUE SOBRE LAS

CARACTERÍSTICAS ESPERMÁTICAS DE SEMEN ASNAL
CRIOPRESERVADO
Andrés Pareja López
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias
Medellín, Colombia
2016
CRIOTOLERANCIA ESPERMÁTICA Y EFECTO DE LOS
ANTIOXIDANTES Y EL SISTEMA DE EMPAQUE SOBRE LAS
CARACTERÍSTICAS ESPERMÁTICAS DE SEMEN ASNAL
CRIOPRESERVADO
Andrés Pareja López
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Doctor en Biotecnología
Director:
Ph.D., Delmis Omar Camargo Rodríguez
Línea de Investigación:
Biotecnología de la Reproducción
Grupo de Investigación:
Biotecnología Animal
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias
Medellín, Colombia
2016
Dedico este trabajo a mi hijo Tomás quien es
mi fuente infinita de motivación y a Erika que
me acompaño incondicionalmente durante
este tiempo.
Agradecimientos
Se agradece especialmente a CENIRED (Corporación Red Especializada de Centros de
Investigación y Desarrollo del Sector Agropecuario de Colombia), por la financiación de
este proyecto a través del contrato No. 13158-022-03. Al Dr Arlindo de Alencar Araripe
Moura y todos los integrantes del grupo de investigación del grupo de fisiología de la
reproducción animal de la Universidad Federal de CEARÁ-UFC-Brasil, por todo su apoyo
y colaboración en los análisis del proteoma del plasma seminal. Se agradece muy
especialmente a Colciencias por su apoyo financiero a través de la beca doctoral de la
convocatoria 528 “Doctorados Nacionales”
Resumen y Abstract IX
Resumen
Una estrategia exitosa que se ha abordado a nivel mundial para la conservación recursos
zoogenéticos que se encuentran en condiciones desfavorables y con peligro de
endogamia, como sucede con la población de asnales en Colombia, consiste en la
implementación de programas de criopreservación de semen y el establecimiento de
bancos de germoplasma ex situ. Pero los resultados de criopreservación de semen
asnal, obtenidos de diferentes protocolos son muy variables, caracterizándose por la
existencia dos poblaciones de reproductores cuyos espermatozoides responden de
manera diferencial a los procesos de criopreservación, los malos criotolerantes (MC), y
los buenos criotolerantes (BC). Lo cual limita el uso de una gran proporción de
reproductores para los programas de inseminación artificial (IA) con semen congelado.
En el presente trabajo se estableció un criterio de selección de reproductores (MC y BC)
con base en la metodología de componentes principales (CP) que incluyó 19 variables
espermáticas pos descongelación, se evaluó la diferencia en el estatus oxidativo del
semen pre congelación y la composición proteica del plasma seminal entre estas dos
poblaciones. De igual manera se evaluó las características cinemáticas, estructurales y
funcionales de los espermatozoides entre los MC y BC. Sumado a esto, se investigó el
efecto que tienen los antioxidantes vitamina E y quercetina y el sistema de empaque en
pajillas de 0.25 ml y 0.5 ml sobre las características espermáticas pos-descongelación,
con el propósito de evaluar la respuesta diferencial de estas dos poblaciones a las
modificaciones en el protocolo de criopreservación y que luego pueda ser utilizado para
la conformación de bancos de germoplasma. Los resultados obtenidos en los diferentes
experimentos permitieron establecer que la velocidad progresiva (VSL) pos
descongelación, es un parámetro adecuado para hacer la selección de BC y MC,
encontrando que todas las variables cinemáticas, estructurales y funcionales pos
descongelación fueron significativamente diferentes (p < 0,05) entre estos dos grupos,
siendo los clasificados como BC los que mejor desempeño mostraron. No se encontró
diferencia estadística (p > 0,05) para los resultados del estatus oxidativo del eyaculado
pre congelación, no obstante los promedios encontrados sugieren que tanto el plasma
seminal como los espermatozoides de los reproductores buenos congeladores (BC)
tienen una mayor capacidad antioxidante y menor peroxidación lipídica, lo cual se refleja
en los mayores valores de porcentaje de inhibición del radical DPPH, en los mayores
valores FRAP y en los menores valores de µM de equivalentes MDA. Se identificaron 5
familias de proteínas (KLK1E2, CRISP3, BSP, HSP-1 y HYOU1) presentes en el plasma
seminal. Aunque no se encontraron diferencia estadística significativas para las
diferentes concentraciones de los antioxidantes, su adición si mejoró significativamente
las características cinemáticas de los reproductores MC, más sin embargo, también
pareció afectar negativamente las membranas plasmáticas, lo cual contrasta con lo
reportado por otros autores. De igual manera, se logró dilucidar también que el sistema
de empaque juega un papel importante en la preservación de las características
estructurales y funcionales de los espermatozoides de los reproductores MC sometidos a
X Criotolerancia espermática y efecto de los antioxidantes y el sistema de empaque sobre las características espermáticas de semen
asnal criopreservado
un procedimiento de criopreservación, obteniéndose los mejores resultados con las

pajillas de 0.25. No se encontró una relación estadísticamente significativa entre las
variables estudiadas y su comportamiento después del proceso de criopreservación,
pero la interpretación biológica de los promedios de las variables del estatus oxidativo
fueron importantes ya que se logró evidenciar que los reproductores BC tienen un mejor
estatus oxidativo que los MC, lo cual respalda la hipótesis de que dichas propiedades
pueden proteger los espermatozoides de los daños oxidativos en membranas y en otras
organelas, como se evidencia en estos resultados.
Se hace necesario darle continuidad al presente proyecto de investigación, vinculando

las asociaciones de criadores y profesionales del área, para fortalecer las capacidades
en biotecnologías reproductivas, optimizar protocolos de criopreservación seminal y
generar redes de colaboración internacional que permitan fortalecer las capacidades
nacionales en la conservación de recursos zoogenéticos.
Palabras clave: Burro, criopreservación, criorresistencia, antioxidantes, calidad

espermática, plasma seminal.
Abstract
A successful strategy that has been tackled globally for the conservation of animal
genetic resources that are in unfavorable conditions and in danger of inbreeding, is the
case with the population of donkey in Colombia, consists in the implementation of semen
cryopreservation programs and establishment of ex situ germplasm banks. The results of
donkey sperm cryopreservation, obtained from different protocols are very variable,
characterized by the existence of two populations of breeders whose spermatozoa
respond differently to cryopreservation, bad freezers (BF) and good freezers (GF). This
limits the use of a large proportion of breeders for artificial insemination (AI) programs
with frozen semen. In the present work, a criterion for the selection of breeders (BF and
GF) was established based on the main components methodology (MC), which included
19 sperm variables after thawing, the difference in the oxidative status of pre-freezing
semen and the protein composition of the seminal plasma between these two
populations. The kinematic, structural and functional spermatozoa characteristics were
evaluated in BF and GF populations. In addition, were investigated the effect of vitamin E
and quercetin antioxidants and the 0.25 ml and 0.5 ml straws on the post-thawing
characteristics, in order to evaluate the differential response of these two populations to
the modifications in the protocol of cryopreservation and then later can be used for the
conformation of germplasm banks. The results obtained in the different experiments
allowed to establish that the progressive velocity (VSL) after thawing, is a suitable
parameter to make the selection of GF and BF, finding that all the kinematic variables,
structural and functional after thawing were significantly different (p <0.05) between these
two groups, being those classified as GF whom showed best performance .No
significance (p> 0.05) was found for the results of the ejaculate pre-freezing oxidative
status, however the mean values found suggest that both the seminal plasma and the
spermatozoa of GF have a higher antioxidant capacity and lower lipid peroxidation, which
Contenido XI
is reflected in the higher values of percent inhibition of the DPPH radical, higher FRAP
and lower µM MDA equivalents values. Five protein families (KLK1E2, CRISP3, BSP,
HSP-1 and HYOU1) present in seminal plasma were identified.
Although no statistically significant difference (p > 0,05) was found for the different
concentrations of antioxidants, its addition did significantly improve the kinematic
characteristics of the BF, however, it also appeared to negatively affect plasma
membranes, which contrasts with that reported by other authors. Likewise, it was also
possible to elucidate that the packaging system plays an important role in the
preservation of the structural and functional characteristics of the spermatozoa of the GF
submitted to a cryopreservation procedure, obtaining the best results with straws of 0.25.
There was no statistically significant relationship between the variables studied and their
behavior after the cryopreservation process, but the biological interpretation of the
averages of the oxidative status variables were important as it was shown that GF have a
better oxidative status than the BF, which supports the hypothesis that such properties
can protect sperm from oxidative damage in membranes and other organelles, as
evidenced in these results.
It is necessary to give continuity to this research project, linking the associations of

breeders and professionals in the area, to strengthen capacities in reproductive
biotechnologies, optimize seminal cryopreservation protocols and generate international
collaboration networks to strengthen national capacities in the conservation of animal
genetic resources.
Keywords: Donkey, cryopreservation, cryotolerance, antioxidants, sperm quality,

seminal plasma.
Contenido XIII
Contenido
Pág.
1. Capítulo 1: Criotolerancia de espermatozoides asnales y su relación con las
características seminales ............................................................................................... 5
1.1 Resumen .................................................................................................................... 5
1.2 Introducción ............................................................................................................... 6
1.3 Metodología ............................................................................................................... 7
1.3.1 Animales .................................................................................................................... 7
1.3.2 Recolección de la muestra seminal ........................................................................... 7
1.3.3 Preparación de muestras seminales .......................................................................... 8
1.3.4 Capacidad antioxidante equivalente al Trolox (TEAC) ............................................... 8
1.3.5 Poder reductor férrico/antioxidante (FRAP) ............................................................. 8
1.3.6 Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) ................................................. 9
1.3.7 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) .................................................. 9
1.3.8 Criopreservación de las muestras seminales ............................................................. 9
1.3.9 Evaluación de la movilidad ...................................................................................... 10
1.3.10 Funcionalidad de la membrana plasmática (HOST) ................................................. 10
1.3.11 Integridad de la membrana plasmática (IMP) ......................................................... 10
1.3.12 Potencial de membrana mitocondrial (PMM) ......................................................... 11
1.3.13 Reacción acrosómica (RA) ....................................................................................... 11
1.3.14 Daño en ADN (SCSA) ................................................................................................ 11
1.3.15 Análisis Estadístico .................................................................................................. 12
1.4 Resultados ................................................................................................................ 12
1.4.1 Selección de buenos criotolerantes y malos criotolerantes .................................... 12
1.4.2 Estatus oxidativo ..................................................................................................... 13
1.4.3 Perfil proteico del plasma seminal SDS-PAGE ......................................................... 15
1.4.4 Movilidad espermática podescongelación de buenos y malos congeladores ......... 16
1.4.5 Variables estructurales y funcionales posdescongelación de buenos y malos
criotolerantes .......................................................................................................................... 17
1.5 Discusión ................................................................................................................... 18
2. Capitulo 2. Efecto de la vitamina E y el tamaño de la pajilla sobre espermatozoides

asnales buenos criotolerantes y malos criotolerantes .................................................. 22
2.1 Resumen ................................................................................................................... 22
XIV Criotolerancia espermática y efecto de los antioxidantes y el sistema de
empaque sobre las características espermáticas de semen asnal
criopreservado
2.2 Introducción .............................................................................................................. 23

2.3 Materiales y métodos ................................................................................................ 24
2.3.1 Animales .................................................................................................................. 24
2.3.2 Recolección de la muestra seminal ......................................................................... 24
2.3.3 Criopreservación de las muestras seminales ........................................................... 24
2.3.9 Daño en ADN (SCSA) ................................................................................................ 26
2.4 Resultados ................................................................................................................ 27
2.4.2 Resultados reproductores buenos criotolerantes (BC) ........................................... 29
2.4.3 Resultados de reproductores malos criotolerantes (MC) ....................................... 30
2.5 Discusión ................................................................................................................... 31
3. Capítulo 3: Efecto de la quercetina y el tamaño de la pajilla sobre la criotolerancia

de espermatozoides asnales ........................................................................................ 35
3.1 Resumen ................................................................................................................... 35
3.2 Introducción .............................................................................................................. 36
3.3 Metodología .............................................................................................................. 37
3.3.1 Animales .................................................................................................................. 37
3.3.2 Recolección de la muestra seminal ......................................................................... 37
3.3.3 Criopreservación de las muestras seminales ........................................................... 37
3.3.9 Daño en ADN (SCSA) ................................................................................................ 39
3.4 Resultados ................................................................................................................ 40
3.4.2 Resultados reproductores buenos criotolerantes (BC) ........................................... 42
3.4.3 Resultados reproductores malos criotolerantes (MC) ............................................ 43
3.5 Discusión ................................................................................................................... 44
4. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................... 47

4.1 Conclusiones ............................................................................................................. 47
Contenido XV
4.2 Recomendaciones ..................................................................................................... 48

4.3 Anexo 1: Protocolos de experimentación .................................................................. 51
4.3.1 COLECTA DE SEMEN ASNAL Y EVALUACIÓN EN CAMPO (PCR-001) ........................ 51
4.3.2 PRUEBA HIPOOSMÓTICA (HOS) (PCR-003) .............................................................. 54
4.3.3 EVALUACIÓN DE MOVILIDAD (% DE ESPERMATOZOIDES MOVILES Y CALIDAD DE
MOVIMIENTO) (PCR-004) ........................................................................................................ 56
4.3.4 VIABILIDAD MEDIANTE EXCULSIÓN DE COLORANTE VITAL EOSINA-NIGROSINA
(PCR-006) ................................................................................................................................. 59
4.3.5 PROTOCOLO CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN ASNAL (PCR-007) ............................. 62
4.3.6 PRUEBA DE FUNCIONALIDAD DE MEMBRANA MITOCONDRIAL (DIO6) (PCR-008) . 66
4.3.7 PRUEBA ESTRUCTURA DE CROMATINA ESPERMÁTICA (SCSA-AO) (PCR-009) ......... 68
4.3.8 EVALUACIÓN DE INTEGRIDAD ACROSOMAL MEDIANTE COLORACIÓN CON FITC-
PNA (PCR-010) ......................................................................................................................... 70
4.3.9 ELECTROFORESIS 2D-PAGE DE PLASMA SEMINAL ASNAR (PCR-011) ...................... 72
4.3.10 EVALUACIÓN DE MOVILIDAD ESPERMÁTICA POR CASA (PCR-012) ........................ 85
4.4 Anexo 2: CONGRESO CRYO 2015. ............................................................................... 87
4.5 Anexo 3: Nota de Prensa ........................................................................................... 91
5. Bibliografía ........................................................................................................... 93
Contenido XVI
Lista de figuras
Pág.
Figura 1-1: Estatus oxidativo (media ± DE) del plasma seminal pre congelación mediante
las variables A. TAC, B. FRAP, C. TBARS de 12 reproductores, 6 BC y 6 MC ................ 14
Figura 1-2: Resultados del estatus oxidativo (media ± DE) de los espermatozoides pre
congelación, mediante las variables A. TAC, B. FRAP, C. TBARS de 12 reproductores, 6
BC y 6 MC. ........................................................................................................................ 15
Figura 1-3: Proteínas de plasma seminal asnal separadas en gel de poliacrilamida 15% y
teñidas con azul de comassie y nombres de las proteínas predominantes en cada banda
según Drurart et al. (89) .................................................................................................... 16
Contenido XVII
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1-1: Análisis de componentes principales y la participación de cada variable dentro

de cada componente CP. .................................................................................................. 12
Tabla 1-2. Comparación de los resultados de 11 variables cinemáticas pos
descongelación (media ± EEM) de 18 reproductores, 10 clasificados como BC y 8
clasificados como MC y valor p para cada una de las variables ....................................... 17
Tabla 1-3. Comparación de los resultados (media ± EEM) de la funcionalidad de la
membrana plasmática (HOST), integridad de la membrana plasmática (IMP), potencial de
la membrana mitocondrial (PMM), reacción acrosómica (RA), daño en ADN (SCSA),
entre 10 BC y 8 MC (n= 18), y valor p para cada una de las variables. ............................ 18
Tabla 2-2: Análisis de componentes principales y la participación de cada variable dentro
de cada componente CP. .................................................................................................. 28
Tabla 2-3. Comparación de resultados (media ± EEM) de 11 variables cinematicas
posdescongelación de 18 reproductores asnales, 10 clasificados como BC y 8
clasificados como MC y valor p para cada una de las variables. ...................................... 28
Tabla 2-4. Comparación de resultados (media ± EEM) de la funcionalidad de la
membrana plasmática (HOST), integridad de membrana plasmatica (IMP), potencial de la
membrana mitocondrial (PMM), reacción acrosómica (RA), daño en ADN (SCSA), entre
10 BC y 8 MC (n=18) ......................................................................................................... 29
Tabla 2-5: efecto de la concentración de vitamina E sobre la funcionalidad de la
membrana plasmática (media ± EEM) mediante la técnica HOST para 10 reproductores
BC (n=10) .......................................................................................................................... 30
Tabla 2-6: Efecto de la concentración de Vitamina E en los reproductores MC sobre las
variables tamaño promedio de las cabezas de los espermatozoides (A), integridad de
membrana plasmática (IMP) y funcionalidad de la membrana plasmática (HOST) para 8
reproductores MC (n=8) .................................................................................................... 30
Tabla 2-7 : Efecto del tamaño de la pajilla (0,25ml y 0,5ml) sobre las variables de
porcentaje de espermatozoides móviles (%mov), porcentaje de espermatozoides
prograsivos (%prog), velocidad de la trayectoria (VAP), velocidad progresiva (VSL) y
velocidad curivilinea (VCL) para 8 reproductores MC (n=8). ............................................ 31
Tabla 3-1: Análisis de componentes principales y la participación de cada variable en
dentro de cada componente CP. ....................................................................................... 40
XVIII Criotolerancia espermática y efecto de los antioxidantes y el sistema de
criopreservado
Tabla 3-2. Comparación de resultados (media ± EEM) de 11 variables cinemáticas

posdescongelación de 18 reproductores asnales, 10 clasificados como BC y 8
clasificados como MC y valor p para cada una de las variables. ...................................... 41
Tabla 3-3. Comparación de los resultados (media ± EEM) de la funcionalidad de la
membrana plasmática (HOST), integridad de la membrana plasmática (IMP, potencial de
la membrana mitocondiral (PMM), reacción acrosómica (RA), daño en ADN (SCSA),
entre 10 BC y 8 MC (n = 18), y valor p para cada una de las variables. ........................... 42
Tabla 3-4: Comparación de los resultados de la concentración de quercetina (media ±
EEM) para las variables de velocidad curvilínea (VC), frecuencia de batido de la cola
(BCF) tamaño promedio de la cabeza de los espermatozoides A, índice de linealidad
(LIN) y funcionalidad de la membrana plasmática (HOST) para reproductores BC (n =10)
........................................................................................................................................... 43
Tabla 3-5: Comparación de los resultados de la concentración de quercetina (media ±
EEM) para las variables de tamaño promedio de la cabeza de los espermatozoides (A),
reacción acrosómica (RA), integridad de la membrana mitocondrial (PMM) y
funcionalidad de la membrana plasmática (HOST) para reproductores MC (n = 8). ........ 44
Contenido XIX
Lista de abreviaturas
Abreviaturas
Abreviatura Término
%mov Porcentaje de espermatozoides móviles
%prog Porcentaje espermatozoides con movimiento progresivos
2D SDS-
2D Electroforesis en gel de poliacrilamida
PAGE
A Tamaño promedio de las cabezas de los espermatozoides
ADN Ácido Desoxirribonucleico
ALH Amplitud lateral de la cabeza
ANOVA Análisis de Varianzas
BC Reproductores Buenos Criotolerantes
BCF Frecuencia de batido de la cola
PMM Potencial de membrana mitocondrial
E Elongación
EEM Error Estandar de la Media
ERO Especies Reactivas de Oxigeno
RA Reacción acrosómica
FRAP Ferric reducing/antioxidant power
HOST Funcionalidad de la membrana plasmática
IA Inseminación Artificial
KM Diluyente Kenny Modificado
LIN Índice de Linealidad
MANOVA Análisis de Varianza Multivariado
MC Reproductores Malos Criotolerantes
MDA Malondialdehido
NA Fluorocromo Naranja de Acridina
SCSA Daño en ADN
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida
STR Índice de Rectitud
TBARS Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity
VAP Velocidad de la trayectoria
VCL Velocidad curvilínea
IMP Integridad de la membrana plasmática
VSL Velocidad progresiva
Introducción
Históricamente la domesticación de los asnos se remonta a Mesopotamia hace unos
5000 años (1) y su importancia económica ha estado ligada a los humanos por su
capacidad de tracción, carga y de resistir condiciones ambientales adversas. Los burros
se encuentran distribuidos alrededor del mundo y se estima que hay unos 52 millones de
individuos entre asnales y sus híbridos mulares. No obstante, en el último siglo estos
animales han perdido importancia en países desarrollados y su importancia ancestral
solo se ha mantenido en países en vía de desarrollo (2,3). Particularmente en Colombia,
donde la mayoría de su población es rural (75%) y gran parte de su economía primaria se
concentra en la región rural andina; los asnales y mulares, son considerados una
herramienta de trabajo imprescindible, sobre todo en aquellas regiones más apartadas y
de topografías más agrestes.
No obstante, la FAO ha reportado que muchas poblaciones de razas asnales se

encuentran en serio peligro de extinción, debido a las bajas poblaciones y al alto nivel de
la endogamia que las caracteriza (4–8). Por esta razón, se hace imprescindible
establecer programas de repoblamiento, para evitar la pérdida de esta especie. Una de
las estrategias que se han propuesto a nivel mundial es la conformación de bancos de
germoplasma tanto in situ como ex situ a través de entidades gubernamentales para la
conservación de recursos zoogenéticos (5,9). Afortunadamente, en los últimos años se
ha venido incrementando el interés en su uso como reproductores para la obtención de
mulares, que son empleados por su fuerza de trabajo en las granjas y por la novedosa
práctica de usar estos mulares para la monta recreativa y de exposición de paso fino; lo
cual ha incrementado el interés de entidades privadas por establecer programas de
reproducción de esta especie (1–3,10,11).
En este sentido, las biotecnologías reproductivas como la inseminación artificial (IA), la

congelación de semen y la transferencia de embriones, son herramientas de gran
importancia al servicio de la equinocultura mundial, como estrategia de repoblamiento y
un instrumento directo para el mejoramiento genético. En Colombia, actualmente los
sistemas reproductivos en los criaderos de asnales se basan en los procedimientos de
monta natural e inseminación artificial (IA) con semen fresco y refrigerado. La aplicación
de la IA se ha extendido por la posibilidad de la utilización intensiva de reproductores, la
reducción de las posibilidades de introducción de enfermedades a las explotaciones, la
facilidad para el manejo reproductivo, al reducir el tiempo y el trabajo necesario, así como
un mejor control de la calidad del semen (12–15).
El uso de semen congelado para los procedimientos de IA puede resultar ventajoso en

relación con el uso del el semen refrigerado como son: el transporte a largas distancias,
la conservación durante un tiempo muy prolongado (años), el control sanitario, genético
2 Introducción
y/o productivo que se puede hacer a los machos antes de su uso como reproductores
donantes; la creación de bancos de germoplasma para razas en peligro de extinción o de
individuos sobresalientes; la propagación de líneas que se encuentren en circunstancias
desfavorables, como por ejemplo, movilidad restringida a causa de un brote infeccioso o
un desastre natural (4,16). Otra ventaja importante es que al aumentar el tiempo de
anaquel, se pueden optimizar los procesos de comercialización (importación y
exportación) de germoplasma, lo que permitiría crear nuevas unidades de negocio dentro
de los diferentes criaderos asnales (16–19).
La mayoría de protocolos para la criopreservación de semen asnal han sido adaptados

de los protocolos de congelación de semen equino, en los cuales el semen se somete a
centrifugaciones seriadas para la remoción del plasma seminal, lo cual induce una
liberación significativa de especies reactivas de oxigeno (ERO) por los espermatozoides
y neutrófilos presentes en el semen, a través de tres vías principalmente, la NADPH
oxidasa en la forma Nox5, la mitocondria y la L-amino acido oxidasa (20–27). Además, se
han relacionado con la inestabilidad de la membrana, daño de los receptores de
membrana, alteraciones del citoesqueleto (28), perturbaciones del axonema (el cual es
asociado con la pérdida de movilidad) (29), inhibición de la fusión esperma-oocito, y daño
nuclear, entre otros (8,27,30–34). Sumado a esto, se ha encontrado que los
espermatozoides equinos son particularmente susceptibles al choque térmico y al
enfriamiento, lo cual está directamente relacionado con la formación de cristales a nivel
intracelular y extracelular durante los procesos de congelación y descongelación (18).
Buscando alterar al mínimo las calidades funcionales y estructurales de los

espermatozoides sometidos a congelación, en los últimos años se han venido
modificando los protocolos de criopreservación de semen, tanto en equinos como en
otras especies que presentan dificultades para la criopreservación. Se han adaptado y
desarrollado diferentes sistemas de empaque: pajillas de 0.5 ml y 0.25 ml (35–38),
Flatpacks (39), Mini-Flatpacks (40) y algunos sistemas abiertos (41). Se ha ensayado
también con las tasas de enfriamiento y una variedad amplia de diluyentes y
crioprotectores (18,21,37,38,42–47). En este sentido, se ha demostrado la necesidad de
suplementar los diluyentes de congelación con antioxidantes (48–57), a fin de evitar o
reducir daños como la peroxidación lipídica, el daño en ADN y demás organelas que
afectan el óptimo comportamiento espermático pos-descongelación (49–52,55). Estos
desarrollos, permiten avanzar en un protocolo de criopreservación de semen asnal,
donde se determinen el tipo y la concentración de antioxidante necesario para disminuir
los daños producidos por el estrés oxidativo, establecer al menos un sistema de
empaque y unas tasas de enfriamiento que permitan un delicado equilibrio en la
formación de cristales intracelulares y extracelulares y que al final se traduzcan en la
obtención de un elevado porcentaje de espermatozoides con sus propiedades
estructurales y funcionales lo más intactas posible para que puedan llevar a cabo un
procedimiento de IA exitoso.
Los resultados obtenidos a partir de la evaluación de diferentes protocolos de

criopreservación de semen de asnos son muy variables y se caracterizan por la
existencia de una elevada población de reproductores cuyos espermatozoides muestran
pobre criotolerancia o también denominados malos criotolerantes (MC) (58–62), mientras
que una proporción más pequeña de la población muestran buena criotolerancia o
también conocidos como buenos criotolerantes (MC); esta variabilidad individual a la
criotolerancia limita el uso efectivo de ejemplares valiosos en un programa de IA basado
en semen congelado. Hasta ahora, la selección de los reproductores se ha basado en
Introducción 3
características fenotípicas de importancia comercial y no por su criotolerancia

espermática, rasgo este, que de seleccionarse complementariamente facilitaría la
creación de bancos genéticos, tal como funcionan desde hace más de medio siglo en el
ganado vacuno (12).
Entre las hipótesis que tratan de explicar la razón de dicha variabilidad individual, se
hallan las relacionadas con las características del plasma seminal (63,64), la composición
lipídica de la membrana plasmática de los espermatozoides (65,66), la expresión
diferencial de proteínas que le confieren crioresistencia (67–73), y las características
estructurales y cinemáticas de los espermatozoides antes del proceso de
criopreservación (58,67,74–78), entre otras. Aunque el fenómeno permanece sin dilucidar
completamente, cada teoría ha venido acumulando evidencias para explicar el fenómeno
lo cual hace necesario tomar elementos de cada una de ellas al momento de intentar
explicar la variabilidad individual a la criotolerancia en semen asnal.
Mejorar la eficiencia productiva del semen asnal criopreservado, implica conocer con
mayor exactitud los posibles factores extrínsecos e intrínsecos al individuo que estarían
condicionando y determinando la variabilidad individual a la criotolerancia; aunque aún
son escasos los estudios que han abordado dicha problemática en la especie asnal, un
camino interesante por explorar son las características cinemáticas, estructurales,
funcionales, análisis proteómico y del estatus oxidativo del eyaculado, lo cual podría
permitir identificar otros factores para ser sumados al incompleto y complejo mapa
explicativo de la variabilidad individual a la criotolerancia, tras lo cual se podrían
promover acciones nuevas y mejor orientadas que permitan minimizarla, ya sea desde la
adición de antioxidantes a los diluyentes de criopreservación o la utilización de diferentes
sistemas de empaque, entre otras.
1. Capítulo 1: Criotolerancia de
espermatozoides asnales y su relación con
las características seminales
Andrés Pareja López1, Mauricio Rojas López2, Arlindo de Alencar Araripe Moura3, Delmis
Omar Camargo Rodríguez4.
1
Biología CES – EIA; Universidad CES, 2 Grupo de Inmunología Celular e
Inmunogenética; Universidad de Antioquia, 3. Fisiología de la Reproducción; Universidad
Federal de Ceará, 4 Biotecnología Animal; Universidad Nacional de Colombia – sede
Medellín.
1.1 Resumen
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la relación entre las características del
eyaculado pre congelación, las variables cinemáticas, estructurales y funcionales pos
descongelación con la criotolerancia de espermatozoides de burros criollos colombianos.
Se congelaron 18 eyaculados de reproductores asnales con fertilidad comprobada, se
evaluó el estatus oxidativo del eyaculado pre congelación por medio de las metodologías
TEAC, FRAP y TBARS y se utilizó la metodología de componentes principales (CP) con
base en los resultados de las 11 características cinemáticas (%mov, %prog, VAP, VSL,
VCL, ALH, BCF, STR, LIN, E, A) y 5 variables estructurales y funcionales (HOST, IMP,
PMM, RA, SCSA) pos descongelación, para establecer un parámetro de selección entre
buenos criotolerantes (BC) y malos criotolerantes (MC). Se comparó el estatus oxidativo
del eyaculado de ambos grupos y las características cinemáticas, estructurales y
funcionales de los espermatozoides pos descongelación para los BC y MC. Sumado a
esto, se identificaron mediante la metodología SD-PAGE, las proteínas del plasma
seminal de burros criollos colombianos. Los resultados de CP permitieron establecer que
velocidad progresiva (VSL) pos descongelación, es un parámetro adecuado para hacer la
selección de BC y MC, encontrando que todas las variables cinemáticas, estructurales y
funcionales pos descongelación fueron significativamente diferentes (p < 0,001) entre
estos dos grupos, siendo los clasificados como BC los que mejor desempeño mostraron.
No se encontró diferencia estadística (p > 0,05) para los resultados del estatus oxidativo
del eyaculado pre congelación, no obstante los promedios encontrados sugieren que
tanto el plasma seminal como los espermatozoides de los reproductores buenos
congeladores (BC) tienen una mayor capacidad antioxidante y menor peroxidación
6 Criotolerancia espermática y efecto de los antioxidantes y el sistema de
criopreservado
lipídica, lo cual se refleja en los mayores valores de porcentaje de inhibición del radical
DPPH, en los mayores valores FRAP y en los menores valores de µM de equivalentes
MDA. Se identificaron 5 familias de proteínas (KLK1E2, CRISP3, BSP, HSP-1 y HYOU1)
presentes en el plasma seminal, La VSL es un buen parámetro de selección de
reproductores asnales BC y MC, ya que permitió dilucidar claramente las diferencias en
las características cinemáticas, estructurales y funcionales pos descongelación entre
estos dos grupos. El estatus oxidativo del eyaculado pre congelación puede ser una
variable interesante para estudiar en futuros trabajos en esta especie, utilizando
metodologías más sensibles que permitan dilucidar más claramente las diferencias en
este parámetro entre los BC y MC. De otro lado, las proteínas de la familia HSP pueden
estar jugando un papel importante en la explicación a la variabilidad de la criotolerancia
de espermatozoides de burros, por lo cual se sugiere seguir ahondando en el estudio de
esta variable y potencialmente ser usada como marcador de fertilidad o selección por
criotolerancia.
Palabras clave: estrés oxidativo, características seminales, proteínas, plasma seminal.
1.2 Introducción
La FAO ha reportado que muchas poblaciones de razas asnales se encuentran en serio
peligro de extinción, debido a las bajas poblaciones y al alto nivel de la endogamia (4–8).
Sumado a esto, el creciente interés de la producción de híbridos producto del
apareamiento de un burro (Equus asinus) y una yegua (Equus caballus) para la
obtención de individuos mulares con gran fuerza física y excelentes características de
monta para actividades recreativas, ha despertado el interés de optimizar la reproducción
de los burros alrededor del mundo (2,11).
El uso de semen congelado en inseminación artificial representa la principal herramienta

para la conservación y mejora genética de animales domésticos, pero los resultados de
criopreservación de semen asnal, obtenidos de diferentes protocolos son muy variables,
caracterizándose por la existencia de al menos dos subpoblaciones, una de
reproductores cuyos espermatozoides no toleran los procesos de criopreservación, a los
cuales se les denomina malos criotolerantes (MC), y otra subpoblación que lo toleran
mejor, denominados los buenos criotolerantes (BC) (58–62,79). Este fenómeno, limita el
empleo efectivo de una amplia proporción de reproductores en programas de IA basados
en semen congelado, por lo cual, algunos autores han sugerido diversas causas que
podrían explicar dicha variabilidad, con base en resultados obtenidos en otras especies.
Entre las hipótesis más relevantes, se encuentran las relacionadas con las características
del plasma seminal (33,64,80–82), la composición lipídica de la membrana plasmática de
los espermatozoides (65,66), expresión diferencial de proteínas asociadas con
criotolerancia (67–73) y variaciones en las características estructurales y cinemáticas de
los mismos espermatozoides sometidos al proceso de criopreservación (58,67,74–78).
No obstante, en burros son muy pocos los trabajos de investigación que abordan este
fenómeno dado lo cual se desconoce si algunos de los modelos propuestos aplican para
esta especie.
Capítulo 1 7
Los espermatozoides de equinos son especialmente susceptibles al estrés oxidativo, lo

cual se ve reflejado en el detrimento de las características cinemáticas, estructurales y
funcionales (23,83,84). Actualmente se proponen tres fuentes importantes de radicales
libres en los espermatozoides de los mamíferos, la mitocondria, quien libera aniones
superóxido, el cual es transformado rápidamente a peróxido de hidrógeno (H2O2) de
manera espontánea o enzimáticamente, esta a su vez, debido a su baja reactividad y
corta vida media no es muy dañino, pero no está cargado y puede cruzar libremente las
membranas celulares, reaccionar con otras moléculas y producir especies más tóxicas
como los radicales Tiol (RS∙) y el radical hidroxilo (•OH) que son altamente reactivos. Las
otras dos fuentes importantes de radicales libres son la NADPH oxidasa como las NOX5
y la L-amino acido oxidasa (25,26). Sumado a esto, la membrana plasmática de los
espermatozoides de los mamíferos es rica en ácidos grasos poli-insaturados, los cuales
son muy susceptibles al ataque de las ERO, además, durante los últimos estados de la
espermatogénesis los espermatozoides han descartado la mayoría de su citoplasma
perdiendo gran parte del conjunto de defensas enzimáticas que los protegen del daño
peroxidativo (27,85,86).
Por esta razón, en el presente estudio se evaluó la relación entre los resultados de las
variables cinemáticas, estructurales y funcionales pos descongelación y la criotolerancia
espermática que permitiera proponer una metodología para caracterizar los BC de los
MC. Además, se evaluó la relación entre el estatus oxidativo del eyaculado pre
congelación, las características espermáticas pos descongelación de los BC y MC y
finalmente se hizo una identificación de las proteínas del plasma seminal que pueda
aportar desde la proteómica a la explicación del fenómeno y puedan ser utilizadas como
marcadores de criotolerancia o, inclusive, de potencial fertilidad en burros, como se ha
descrito previamente en toros, caballos, búfalos y porcinos (69–72).
1.3 Metodología
1.3.1 Animales
El semen fue obtenido de diferentes criaderos pertenecientes a los departamentos de

Antioquia, Atlántico, Bolívar, Valle del Cauca, Risaralda, Quindío y Caldas. Se colectaron
18 reproductores asnales entre 2 y 6 años de edad y 350 – 420 kg en peso, con fertilidad
comprobada y usados rutinariamente en inseminación artificial. Los reproductores
donantes se encontraban semi-estabulados y mantenidos con una dieta basada en
forrajes (pasto fresco y heno) suplementado con cantidades variables de concentrado,
sal mineralizada, y agua a libre disposición.
1.3.2 Recolección de la muestra seminal

Se colectó un eyaculado por reproductor, con vagina artificial y en algunos casos en
presencia una burra o yegua con celo inducido. La vagina artificial fue precalentada de
35ºC – 45ºC y equipada con un filtro en línea que permitía la recolección de semen libre
de gel. Inmediatamente después de la recolección, los eyaculados fueron sometidos a
análisis estándar de volumen, mediante probeta volumétrica y el pH, utilizando cintas
estándar de pH. La movilidad espermática fue evaluada bajo microscopía (400X) en 5
criopreservado
campos visuales, en porta objetos precalentados a 37ºC sobre una platina térmica y por
un evaluador entrenado. La concentración espermática fue calculada con un
hemocitómetro (cámara de neubauer) y las evaluaciones de viabilidad y morfología
fueron determinadas utilizando la tinción eosina-nigrosina. Solo las muestras de semen
que mostraron un mínimo de 80% en movilidad progresiva y un 80% de espermatozoides
con morfología normal fueron transportadas hacia el laboratorio bajo refrigeración y
procesadas para los diferentes análisis (19) (Anexo 1. PCR-001).
1.3.3 Preparación de muestras seminales

De cada eyaculado, se tomó una muestra y se dividió en dos alícuotas de 2 ml cada una.
La primera alícuota se utilizó para la evaluación del estatus oxidativo del semen pre
congelación. Esta, se centrifugó a 700 x g 10 min y se separó el sobrenadante (plasma
seminal) del precipitado (espermatozoides) y se procesaron ambas muestras por
separado para los diferentes análisis. La segunda alícuota, se utilizó para el análisis de
proteínas, la cual se suplementó con 20 µl de mix inhibidor de proteasas y transportada
bajo refrigeración hasta el laboratorio, donde se centrifugó a 700 x g, 10 min, se tomó el
sobrenadante y se sometió a una segunda centrifugación a 5000 g x durante una hora, a
4ºC, para eliminar potenciales células remanentes. La cuantificación de proteínas en el
plasma seminal se hizo por el método Bradford (87).
1.3.4 Capacidad antioxidante equivalente al Trolox (TEAC)

La capacidad antioxidante tanto del plasma seminal como de los espermatozoides del
eyaculado pre congelación, se evaluó mediante la cuantificación del porcentaje de
inhibición del radical estable 1,1-difenil-2-picril-hidracilo (DPPH) debido a su capacidad
de donar hidrógenos. Para el procedimiento, las muestras de semen se centrifugan a
660g durante 8 minutos, se toman 200 µl del sobrenadante y se agregaron a 4 ml de la
solución radical DPPH (6,09 x 10-5 mol/L metanol). La mezcla se incubó a temperatura
ambiente durante 10 minutos, para estabilizar la reacción de color y se leyó en un
espectrofotómetro a 515 nm contra un blanco de metanol. La muestra se leyó
nuevamente una hora después de la lectura inicial y se hizo un promedio de las
absorbancias. Se utilizó una solución control de ácido ascórbico (0,25 mg de ácido
ascórbico/1 ml de agua destilada).
1.3.5 Poder reductor férrico/antioxidante (FRAP)

Este ensayo se llevó a cabo tanto en el plasma seminal como en los espermatozoides del
eyaculado pre congelación, en un buffer ácido acético-acetato de sodio (pH 3.4), que
contenía TPTZ y FeCl3. Se utilizó 900 µL de ésta solución, 50 µL de muestra y 50 µL de
agua destilada. Luego de 30 minutos de reacción, se determinó la absorbancia a una
longitud de onda de 593 nm. Para cada muestra se tuvo en cuenta la lectura de la
absorbancia del blanco sin cromóforo. La curva de referencia se construyó usando ácido
ascórbico como patrón primario. Las actividades de las muestras en estudio se
expresaron como valor FRAP (µmol ácido ascórbico (AA)/ µmol de compuesto).
Capítulo 1 9
1.3.6 Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS)

Los peróxidos lipídicos tanto de las muestras de plasma seminal como de los
espermatozoides del eyaculado pre congelación, se midieron después de la adición de
2mM de ácido tiobarbitúrico - ácido tricloroacético (15%, w/v TCA; 0.375%, w/v TBA and
0.25N HCl) a 1 ml de cada muestra. La mezcla se llevó a un recipiente con agua en
ebullición por 15 min. Inmediatamente después de enfriarse, la suspensión fue
centrifugada a 1500 x g por 10 min. El sobrenadante fue separado y la absorbancia
medida a 535 nm. Los µM de equivalentes MDA de la muestra de espermatozoides
fueron ajustados por el número de espermatozoides presentes en la muestra.
1.3.7 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

La electroforesis en gel SDS-PAGE se utilizó para la identificación de las proteínas del
plasma seminal del eyaculado pre congelación, se llevó a cabo en geles de poliacrilamida
15%. Una cantidad de 50 μg de proteína fue mezclada con buffer de carga (0.125 M Tris-
Cl, 4% SDS, 20% v/v glicerol, 0.2 M DTT, 0.02% azul de bromofenol). Se montaron en
geles de 0,75mm y 15 cm de largo, previamente sumergido en buffer de electroforesis
(Tris 259 mM, Glicina 1,92M, SDS 1%(w/v) en agua destilada y des ionizada), se corrió
una electroforesis unidimensional a 0,03 A, 4ºC durante 10 horas. Después de la
electroforesis, los geles fueron teñidos con una solución de azul de comassie (azul
brillante de comassie 0,025%, metanol 40%, ácido acético 7%, en agua destilada y des
ionizada), las bandas fueron identificadas mediante un análisis de densitometría usando
el software ImageJ (88) y con base en los estándares de peso molecular de la fosforilasa
(9 kDA), la albúmina bovina (66 kDa), la ovoalbúmina (45 kDa), la anhidrasa carbónica
(30.0 kDa), el inhibidor de tripsina (20.1 kDa) y la lisozima (14 kDa) (89).
1.3.8 Criopreservación de las muestras seminales
Las muestras seminales fueron diluidas en una proporción 1:1 en diluyente Kenny
modificado (KM) (leche descremada 2,4 g, glucosa 4,9 g, gentamicina sulfato 0,1 mg,
NaHCO3 (7,5%) 2 ml, Agua destilada 92 ml) y transportada al laboratorio en condiciones
de refrigeración entre 10ºC y 15ºC. Una vez en el laboratorio, la muestra fue centrifugada
a 660 x g por 15 min a 20ºC. El sobrenadante fue eliminado y el pellet resuspendido en 2
ml del segundo diluyente (KM 20 ml + yema de huevo 600 µl). Luego de esta dilución los
porcentajes de viabilidad, concentración espermática, número total de espermatozoides y
movilidad fueron re-evaluados. Solo las muestras de semen que mostraron un mínimo de
70% en movilidad progresiva y un 80% de espermatozoides con morfología normal
fueron procesadas. Seguidamente, se adicionó el tercer diluyente (diluyente KM 20 ml +
yema de huevo 600 µl + glicerol a una concentración final de 5%) en una proporción tal
que llevara la muestra a una concentración final 2 x 108 espermatozoides viables/ml.
Finalmente fue empacado en dos sistemas de empaque: pajillas de 0.5 ml, luego de lo
cual se procedió al proceso de congelación en tres pasos. Paso uno: enfriamiento de
20ºC a 5ºC a una tasa de enfriamiento de 0.26ºC/min. Paso dos: descenso de
temperatura de 5ºC a -90ºC a una tasa de 4.75ºC/min. Paso tres: descenso a
temperaturas criogénicas, de -90ºC a -120ºC a una tasa de enfriamiento de 11.11ºC/min.
Una vez las muestras alcanzaron los -120ºC, fueron sumergidas en nitrógeno líquido (-
196ºC) hasta su evaluación. La descongelación se hizo al momento de cada análisis en
criopreservado
un baño maría a 37°C por al menos 20 segundos. El protocolo de criopreservación de

semen asnal se documentó y se codificó en el protocolo PCR-007 (Anexo 1).
1.3.9 Evaluación de la movilidad
Las evaluaciones de movilidad pos-descongelación se hicieron objetivamente bajo

microscopia de contraste de fases utilizando el sistema IVOS 12.3 (Hamilton-Thorne
Bioscience, Beverly, MA, USA). Se hicieron tres réplicas por tratamiento en una micro
célula leja (20 µm, 4 pozos); para cada réplica se capturaron 5 campos. Cada evaluación
se hizo en un video de 40 cuadros/seg y se determinan 11 parámetros relacionados con
movilidad, progresión y calidad del desplazamiento: porcentaje espermatozoides móviles
(%mov), porcentaje espermatozoides con movimiento progresivos (%prog), velocidad de
la trayectoria (VAP) µm/s, velocidad progresiva (VSL) µm/s, velocidad curvilínea (VCL)
µm/s, amplitud lateral de la cabeza (ALH) µm, frecuencia de batido de la cola (BCF) Hz,
índice de rectitud (STR), índice de linealidad (LIN), índice de elongación (E), tamaño
promedio de las cabezas de los espermatozoides (A) µm2. Al conjunto de estas variables
de movilidad se les denominó variables cinemáticas (Anexo 1 – PCR-012).
1.3.10 Funcionalidad de la membrana plasmática (HOST)
Para la determinación de la funcionalidad de la membrana plasmática se utilizó el test

HOST (hypo-osmotic swelling test). Se mezclaron 50 µl de semen con 1 ml de la solución
hipoosmótica (0.49 g citrato de sodio 2H2O y 0.9 g de fructosa en 100 ml de agua ultra
pura), y luego llevada a incubación a 37ºC por 50-60 min. Después de este proceso una
gota es transferida a un portaobjetos cubierto con un cubreobjetos y analizada en un
microscopio de contraste de fase. Los espermatozoides que tuvieron la cola doblada o
enrollada fueron considerados como positivos (Anexo 1 – PCR-003).
1.3.11 Integridad de la membrana plasmática (IMP)
La tinción eosina/nigrosina permite evaluar la integridad de la membrana plasmática por

medio de la exclusión del colorante vital, esta metodología permite dilucidar la diferencia
entre los espermatozoides vivos de los muertos de acuerdo a la coloración. La cabeza de
los espermatozoides muertos se tiñe de violeta, en comparación con los
espermatozoides vivos que no permiten el ingreso del colorante y permanecen sin
coloración. Se depositó una gota (10 µl aproximadamente) solución acuosa de
eosina/nigrosina (1%) sobre un portaobjetos y contiguo a esta, se depositó 10 µl de
semen y se mezclaron cuidadosamente sobre una platina térmica a 37°C, transcurrido un
minuto, se hizo un extendido y bajo un microscopio de campo claro, se determinó el
porcentaje de viabilidad, realizando un conteo de 200 espermatozoides. El protocolo de
evaluación del porcentaje de viabilidad de semen asnal se documentó y se codificó en el
protocolo PCR-006 (Anexo 1).
Capítulo 1 11
1.3.12 Potencial de membrana mitocondrial (PMM)
Se mezclaron 10 µl de la muestra seminal con 10 µl de la solución de IP stock (500 μg/ml

en PBS) y 2 µl de la solución de DIOC-6 (20 nM), se dejó en incubación durante 3
minutos a 37°C y finalmente se evaluaron 20.000 espermatozoides para cada muestra,
mediante citometría de flujo (EPICS XL Coul-ter, Hialeah, FL, USA) utilizando un detector
FL1 para cuantificar la fluorescencia del DIOC-6, y un detector FL3 para cuantificar la
fluorescencia emitida por el IP y analizados mediante el software FACSDiva Versión
6.1.3., donde se dividieron las subpoblaciones en cuadrantes, se cuantificó la frecuencia
de las poblaciones de espermatozoides vivos con alto y bajo potencial de membrana
mitocondrial y los espermatozoides muertos. De la población de espermatozoides vivos
se estimó el porcentaje de espermatozoides con alto potencial de membrana mitocondrial
(Anexo 1 PCR-008).
1.3.13 Reacción acrosómica (RA)
Se mezclaron 10 µl de la muestra seminal, con la solución de FITC-PNA (concentración

final de 2.5 mg/ml) y la solución de IP (concentración final de 10 mM), incubada a 37°C
durante 3 minutos. Se evaluaron 20.000 espermatozoides por muestra mediante
citometría de flujo (EPICS XL Coul-ter, Hialeah, FL, USA). La fluorescencia del FITC-PNA
fue cuantificada usando un detector FL1 y la fluorescencia del IP se cuantificó con un
detector FL3 y analizados mediante el software FACSDiva Versión 6.1.3., donde se
dividieron las subpoblaciones en cuadrantes y se cuantificó la frecuencia de las
poblaciones de espermatozoides vivos que incorporaron FITC-PNA (reaccionados) y
aquellos que no incorporaron la FITC-PNA (no reaccionados) y los espermatozoides
muertos. De la población de espermatozoides vivos, se estimó el porcentaje de
espermatozoides con reaccionados (Anexo 1 PCR-010).
1.3.14 Daño en ADN (SCSA)
Para medir la integridad de ADN espermático se usó la metodología SCSA (Sperm

Chromatin Structure Assay) descrita por Evenson et al. (90). Se mezcló 10 µl de la
muestra seminal, con 400 µl la solución desnaturalizadora (H2Od 100 ml, HCl 0,08M,
NaCl 0,15 M, Tritón X-100 0,1%), luego se adicionó 10 µl de la solución de naranja de
acridina (NA) 6x10-5 µg/ml en buffer de tinción (H2Od 100 ml, Na2HPO4 0,126 M, EDTA
0,0011 M, NaCl 0,15 M) y luego se incubó por 15 minutos. Se evaluó 20.000
espermatozoides por muestra mediante citometría de flujo (EPICS XL Coul-ter, Hialeah,
FL, USA). La fluorescencia del NA monomérico fue detectada usando el FL1 y la
fluorescencia del NA agregado fue detectada con un detector FL3 y analizados mediante
el software FACSDiva Versión 6.1.3., donde se dividieron las subpoblaciones en
cuadrantes y se cuantificó la frecuencia de las poblaciones de espermatozoides con daño
en ADN (NA agregado) y las poblaciones de espermatozoides sin daño en ADN (NA
monomérico) con lo cual se calculó el porcentaje de espermatozoides con daño en ADN
(Anexo 1 PCR-009).
criopreservado
1.3.15 Análisis Estadístico

Para la selección de los reproductores buenos criotolerantes (BC) y malos criotolerantes
(MC), se realizó un análisis de componentes principales, con el propósito de determinar
las variables que influían en mayor proporción a la variabilidad del conjunto de datos y
con base en esa información se seleccionaron ambos grupos. Este análisis incluyó 11
variables cinemáticas (%mov, %prog, VAP, VSL, VCL, ALH, BCF, STR, LIN, E, A) y 5
variables estructurales y funcionales (HOS, IMP, PMM, RA, SCSA); para la evaluación
del efecto de los reproductores (BC y MC) sobre las diferentes variables del estatus
oxidativo (TEAC, FRAP y TBARS), cinemáticas, estructurales y funcionales, se realizó
una prueba t-student. Los valores obtenidos de las 16 variables evaluadas (cinemáticas,
estructurales y funcionales) fueron expresadas como medias ± error estándar de la media
(medias ± EEM), para las variables del estatus oxidativo las 3 variables fueron
expresadas como medias ± desviación estándar (medias ± DE).
1.4 Resultados
1.4.1 Selección de buenos criotolerantes y malos criotolerantes

El resultado de los componentes principales mostró que la primera componente explica
en un 36,2 % la variabilidad del conjunto de datos y de esta primera componente la que
variable que más aporta es la VSL (36,9%), por lo cual se utilizó como el criterio de
selección entre reproductores BC y MC (Tabla 1-1). Aquellos reproductores que se
encontraban por encima del percentil 25 (VSL > 45 µm/s), fueron seleccionados como BC
(10 reproductores) y aquellos que estaban por debajo de este valor, se clasificaron como
MC (8 reproductores).
Tabla 1-1: Análisis de componentes principales y la participación de cada variable dentro de cada
componente CP.
Variables CP1 CP2 CP3

%mov 0,24 0,167 -0,416
%prog 0,279 0,064 -0,365
VAP (µm/s) 0,367 -0,13 -0,107
VSL (µm/s) 0,369 -0,115 -0,041
VCL (µm/s) 0,34 -0,217 -0,184
ALH (µm) 0,206 -0,099 -0,141
BCF (Hz) 0,17 -0,295 0,064
STR (%) 0,315 0,153 0,281
LIN (%) 0,307 0,238 0,282
Capítulo 1 13

E (%) 0,189 0,388 0,172
A (µ m 2 ) 0,207 -0,331 -0,089
SCSA (%) -0,096 0,371 -0,117
RA (%) -0,095 -0,22 0,108
PMM (%) -0,009 0,223 -0,258
IMP (%) 0,024 -0,387 0,378
HOST (%) 0,002 0,053 0,186
1.4.2 Estatus oxidativo

No se encontró diferencia estadísticamente significativa (p > 0,05), para ninguno de los
parámetros del estatus oxidativo (TEAC, FRAP y TBARS) del plasma seminal ni de los
espermatozoides, tampoco se encontró diferencias entre el estatus oxidativo del plasma
seminal de los reproductores BC y MC. No obstante, vale la pena resaltar que los
plasmas seminales de los BC mostraron un promedio mayor del porcentaje de inhibición
del radical DPPH que los MC, igualmente se puede observar un promedio mayor de
FRAP y un promedio menor de µM de equivalentes MDA en la prueba TBARS (Figura 1-
1).
criopreservado
Figura 1-1: Estatus oxidativo (media ± DE) del plasma seminal pre congelación mediante las variables
A. TAC, B. FRAP, C. TBARS de 12 reproductores, 6 BC y 6 MC
A B
Igualmente, no se encontró diferencia estadísticamente significativa (p > 0,05), para

ninguno de los parámetros del estatus oxidativo de los espermatozoides de los
reproductores BC y MC pre congelación. Los espermatozoides de los BC mostraron un
promedio ligeramente menor del porcentaje de inhibición del radical DPPH que los MC,
pero se puede observar un promedio mayor de FRAP y un promedio menor de µM de
equivalentes MDA en la prueba TBARS (Figura 1-2 C). Estos resultados están
relacionados con lo encontrado en el plasma seminal, donde además se puede observar
un incremento sustancial en los µM equivalentes MDA lo cual estaría directamente
relacionado con la peroxidación de membranas plasmáticas de los espermatozoides en
los MC (Figura 1-2).
Capítulo 1 15
Figura 1-2: Resultados del estatus oxidativo (media ± DE) de los espermatozoides pre congelación,
mediante las variables A. TAC, B. FRAP, C. TBARS de 12 reproductores, 6 BC y 6 MC.
A B
1.4.3 Perfil proteico del plasma seminal SDS-PAGE

El análisis SDS-PAGE reveló un patrón de bandas que se encontraban en el rango de
peso molecular entre 5-25 kDa, correspondiente al reportado por Druart et al. (89) en
caballos, donde se observa unas altas cantidades de KLK1E2, CRISP3, BSP, HSP-1 y
HYOU1 respectivamente (Figura 1-3)
criopreservado
Figura 1-3: Proteínas de plasma seminal asnal separadas en gel de poliacrilamida

15% y teñidas con azul de comassie y nombres de las proteínas predominantes en
cada banda según Drurart et al. (89)
L
66 kDa
45 kDa
30 kDa
1 KLK1E2
2 CRISP3
3 BSP1
1
2
20 kDa 4 HSP-1
5 HYOU1
3 6 KLK1E2
14 kDa 7 KLK1E2
4 8 BSP3
5
6
7 9 kDa
1.4.4 Movilidad espermática podescongelación de buenos y

malos congeladores
Se encontró diferencias estadísticamente significativas (p < 0,01) en todas las variables
cinemáticas evaluadas entre los reproductores BC y los MC, teniendo los primeros un
mejor comportamiento pos descongelación en todas ellas. Se encontró un 10% más de
%mov y casi el doble de %prog en los BC respecto a las MC. Igualmente, los
reproductores BC mostraron un incremento del 20%, 19% y 30% para las variables de
velocidad VAP, VSL y VCL respectivamente sobre los resultados de los reproductores
MC. Los índices STR y LIN de los BC mostraron un incremento significativo (p < 0,01)
respecto a su contraparte MC. Las variables BCF, E y A fueron las que mostraron un
menor incremento comparado con las variables anteriormente mencionadas, no obstante,
los resultados para estas variables de los reproductores BC fueron significativamente
diferentes (p < 0,01) a los obtenidos de los MC (Tabla 1-2).
Capítulo 1 17
Tabla 1-2. Comparación de los resultados de 11 variables cinemáticas pos descongelación (media ±
EEM) de 18 reproductores, 10 clasificados como BC y 8 clasificados como MC y valor p para cada una
de las variables
Variable BC MC valor p
media ± EEM
a b
%mov 30,46 ± 1,22 20,72 ± 1,54 2,555e-6
a b
%prog 16,65 ± 0,68 9,06 ± 0,86 4,802e-12
a b
VAP (µm/s) 70,08 ± 1,41 50,63 ± 1,78 8,66e-14
a b
VSL (µm/s) 59,23 ± 1,30 40,10 ± 1,63 6,518e-16
a b
VCL (µm/s) 126,64 ± 2,40 93,22 ± 3,02 4,872e-14
a b
ALH (µm) 6,98 ± 0,29 4,37 ± 0,37 1,393e-8
a b
BCF (Hz) 32,61 ± 0,71 27,83 ± 0,89 0,00031
a b
STR (%) 76,88 ± 1,21 59,05 ± 1,52 1,004e-13
a b
LIN (%) 43,81 ± 0,82 33,56 ±1,03 8,562e-11
a b
E (%) 71,59 ± 1,24 62,17 ± 1,56 6,546e-5
A (µ m 2 )
a b
2,67 ± 0,06 2,25 ± 0,07 0,00018
a, b,
Letras diferentes en el superíndice denotan diferencia estadística significativa (p < 0,05).
1.4.5 Variables estructurales y funcionales posdescongelación

de buenos y malos criotolerantes
Se encontró diferencia altamente significativa (p < 0,01) entre los resultados pos
descongelación de las variables estructurales y funcionales, entre los reproductores BC y
los MC (Tabla 1-3). Los BC mostraron mejor promedio de IMP y HOST (40,81% y
13,13%) respecto a los MC (33,45% y 10,51%). El PMM de los BC tuvieron un promedio
de 15,12% espermatozoides con alto PMM, mientas que los MC tuvieron un 9,75% de
espermatozoides con alto PMM. Los espermatozoides de los reproductores BC
experimentaron un menor promedio de espermatozoides RA (0,57%), mientras que los
MC mostraron un mayor promedio (3,29). Los espermatozoides de los BC mostraron un
promedio menor de espermatozoides con daño en ADN (65,99%) que los MC (77,41).
criopreservado
Tabla 1-3. Comparación de los resultados (media ± EEM) de la funcionalidad de la membrana

plasmática (HOST), integridad de la membrana plasmática (IMP), potencial de la membrana
mitocondrial (PMM), reacción acrosómica (RA), daño en ADN (SCSA), entre 10 BC y 8 MC (n= 18), y
valor p para cada una de las variables.
Variable BC MC
Media ± EEM
valor p
a b
HOST (%) 13,13 ± 0,47 10,51 ± 0,56 0.0002
a a
IMP (%) 40,81 ± 1,77 33,45 ± 2,00 0,003
a b
PMM (%) 15,12 ± 0,99 9,78 ± 1,15 0,0003
a b
RA (%) 0,57 ± 0,55 3,29 ± 0,64 0,007
a b
SCSA (%) 65,99 ± 1,86 77,41 ± 2,15 5,866e-5
a, b,
1.5 Discusión
Uno de los efectos más contundentes sobre las características espermáticas pos-
descongelación, es la variabilidad individual a la criotolerancia, tal como se ha reportado
en caballos y cerdos, la cual se manifiesta con la existencia de una población de
reproductores MC, mientras que otra proporción de la población son BC (58–62). Este
fenómeno limita el empleo de una proporción importante de los reproductores asnales
como donantes en un programa de IA basado en semen congelado (59,82). Por lo tanto,
uno de los grandes retos a nivel investigativo y comercial, es la identificación de dichas
poblaciones para establecer programas de selección genética, no solo por características
fenotípicas de importancia comercial, sino también por su criotolerancia espermática, o
establecer estrategias biotecnológicas que permitan mejorar esta condición, lo cual
facilitaría la creación de bancos genéticos y programas de IA con semen congelado tal
como funcionan en otras especies (12).
En el presente trabajo de investigación se usó la metodología de componentes

principales con el propósito de reducir la dimensionalidad del conjunto de datos y para
identificar las variables espermáticas que más influían en la variabilidad del fenómeno de
criotolerancia. La componente 1 (CP1) fue la que mayor aportó a la variabilidad de los
datos con un 36.7% y dentro de la misma, la variable espermática que más aportó a la
explicación de variabilidad de los datos fue VSL con 36,9%, por lo cual se escogió los
reproductores que se encontraban por encima del percentil 25 en esta variable (VSL > 45
µm/s) como parámetro de selección entre los BC y aquellos que estaban por debajo de
este valor se clasificaron como MC. Esta estrategia de selección, permitió la
conformación de dos grupos de reproductores BC (10 reproductores) y MC (8
reproductores) que mostraron un comportamiento diferencial de la respuesta pos
descongelación de las 11 variables cinemáticas y las 5 variables estructurales y
funcionales, siendo los BC quienes tuvieron un mejor desempeño pos descongelación en
todas las variables cinemáticas respecto a los MC (Tabla 1-2). Los MC mostraron
porcentaje de daño en ADN significativamente mayor (p < 0,01) que los BC, un mayor
porcentaje de espermatozoides con daño en las membranas plasmáticas y acrosomales
y un menor porcentaje de espermatozoides con alto potencial de membrana mitocondrial
(Tabla 1-3). Muchos trabajos de investigación, han catalogado los parámetros de
Capítulo 1 19
movilidad como los marcadores confiables de calidad espermática y de fertilidad en

humanos (91–94) y en animales domésticos incluidos los burros (95–98). En este mismo
sentido, se han venido utilizando parámetros de progresividad como estrategia de
selección entre buenos y malos criotolerantes en cerdos (67,99,100) y caballos
(59,67,79,101), lo cual demuestra la utilidad de las variables cinemáticas como estrategia
de selección para criotolerancia espermática. Nuestros resultados, demuestran que
utilizar el parámetro VSL por encima del percentil 25, es buen parámetro de selección de
reproductores de burros criollos colombianos por su criotolerancia espermática BC y MC.
Una de las hipótesis que puede explicar esta variación a la criotolerancia entre grupos de
reproductores asnales, está relacionada con las características del eyaculado pre
congelación. Particularmente uno de los fenómenos que ha sido reportado ampliamente
en equinos es la susceptibilidad de los espermatozoides al estrés oxidativo, por lo cual se
convierte en una variable clave en el estudio de la criotolerancia espermática (20–
24,27,83,84,86). Aunque bajo las condiciones experimentales del presente estudio no se
encontraron diferencias significativas (p > 0,05) entre las diferentes variables del estatus
oxidativo del eyaculado pre congelación, tanto en el plasma seminal como en los
espermatozoides, los resultados del presente trabajo de investigación, sugieren que los
reproductores BC tienen un estatus oxidativo mejor que los MC, lo cual se ve reflejado en
el plasma seminal; con un promedio ligeramente mayor del porcentaje de inhibición del
radical DPPH, unos mayores valores FRAP y menores valores µM de equivalentes MDA
en la prueba TBARS (Figura 1-1).
Igualmente, en los datos obtenidos de las muestras de los espermatozoides, de los BC

mostraron un mejor comportamiento promedio, reflejado en un promedio mayor de
valores FRAP y un promedio menor de µM de equivalentes MDA el cual evidencia un
menor daño en membranas por efectos del estrés oxidativo en los espermatozoides de
este grupo Estos resultados pueden estar relacionados con la presencia variable de
sustancias antioxidantes no proteicos como compuestos fenólicos, vitamina E, ácido
ascórbico, taurina e hipotauriana y proteicos como catalasa, super oxido dismutasa
(SOD) y glutatión peroxidasa (GPX) al igual que cantidades variables de fuentes de
radicales libres como en el eyaculado como la presencia de neutrófilos y enzimas como
la NADPH oxidasa en la forma Nox5, y la L-amino acido oxidasa (21–27,81,102).
La evaluación de la capacidad antioxidante mediante la técnica TEAC se basa en la
capacidad del plasma seminal en reducir el radical DPPH, mientras que la técnica FRAP
se basa en la capacidad de reducir el Fe+3 a Fe+2. Ambas técnicas son complementarias
en la explicación del fenómeno antioxidante. De otro lado, la técnica TBARS está
relacionada con la cuantificación de subproductos de la peroxidación lipídica; en conjunto
estas tres técnicas, son una excelente herramienta para la evaluación del estatus
oxidativo del eyaculado previo al procedimiento de criopreservación. No obstante, las
variaciones entre reproductores BC y MC fue muy grande por lo que se deberían usar
para futuros estudios técnicas más sensibles para la determinación de este parámetro.
Otra hipótesis que trata de explicar la variabilidad a la criotolerancia, está relacionada con
la composición proteica del plasma seminal, pues es el medio que rodea las células
espermática después de la eyaculación y está compuesto por secreciones del epidídimo
y las glándulas accesorias sexuales, además de algunas de las proteínas que se han
desprendido de los propios espermatozoides durante la maduración espermática a través
de diferentes porciones del tracto reproductivo (80). Estas proteínas están relacionadas
con diferentes aspectos reproductivos en cada especie; en algunos casos facultan los
espermatozoides para penetrar el oocito, a través de la modulación de la capacitación
espermática, reacción acrosómica y la interacción con el oocito directamente. Además,
criopreservado
se han reportado que puede estar directamente relacionados con la modulación de la

ovulación entre otras funciones (103,104). Por otro lado, la acción del plasma seminal
asnal, sobre la movilidad espermática, las características funcionales y estructurales del
espermatozoides pos descongelación aún permanece controvertida (21,62,81,105,106).
Aun son muy pocos los trabajos de investigación, que utilizan herramientas de la
proteómica en espermatozoides, pero ya se ha reportado que el incremento de la
expresión de algunas de las proteínas de choque térmico (HSP; por sus siglas en inglés);
mejora el comportamiento de los espermatozoides pos-descongelación (67,68).
Particularmente las HSP, son inducidas en células expuestas a cambios de temperatura,
drogas, infecciones virales y estrés oxidativo; estas, actúan ejerciendo un efecto
protector, manteniendo la homeostasis de las proteínas y el bloqueo de las caspasas
dependientes de apoptosis; sumado a esto, juegan un papel importante en el
mantenimiento de la cromatina espermática (68,73,107,108). En el presente trabajo de
investigación se logró identificar un conjunto de bandas mediante la técnica SDS-PAGE
relacionadas al proteoma de plasma seminal de caballos donde se describen 8 bandas
correspondientes a 5 grandes grupos de familias de proteínas KLK1E2, CRISP3, BSP,
HSP-1 y HYOU1 respectivamente (Figura 3-3). La KLK1E2 es una kallikreina derivada de
la próstata, miembro de la familia de proteasas de serina, posiblemente involucrada en la
disolución del coagulo seminal, el cual comparte una homología de una extensa
secuencia con el antígeno humano de prostático específico el cual es usado también
para el diagnóstico de cáncer de próstata en humanos (109). CRISP3 (cysteine-rich
secretory proteins) es una proteína expresada en diferentes tejidos de mamíferos y en
equinos es sintetizada en grandes cantidades en las glándulas accesorias, el ámpula y
vesículas seminales la cual juega un papel importante en la fertilización y la cual se ha
propuesto como un marcador de calidad seminal y fertilidad en equinos (110,111). Las
proteínas pertenecientes a la familia BSP (binder of sperm proteins), las cuales fueron
descritas inicialmente en bovinos pero que ya se han encontrado en el plasma seminal
de diferentes especies y se le relaciona con los procesos de capacitación espermática
(112,113).
La proteína HSP-1, es una de las proteínas más abundantes en el plasma seminal

equino, la cual tiene funciones de chaperona y protege una amplia variedad de proteínas
contra el choque térmico y condiciones de estrés oxidativo (108,114). HYOU1 (Hypoxia
up-regulated protein 1), es una familia de proteínas HSP, a las cuales se les atribuye
propiedades citoprotectoras en condiciones hipóxicas y reguladora de la apoptosis.
Particularmente la presencia de proteínas de la familia HSP en el plasma seminal de
espermatozoides asnales, puede explicar en parte el fenómeno de criotolerancia, pues
este grupo de proteínas tiene propiedades de chaperona bajo condiciones de estrés
oxidativo protegiendo otras proteínas como, la alcohol deshidrogenasa y glucosa 6-
fosfato deshidrogenasa, y previniendo la peroxidación lipídica por los radicales hiroxilo
(108). Sumado a esto se ha reportado que se unen a fosfolípidos de colina en la
membrana espermática liderando el eflujo de colesterol durante la capacitación
espermática previo a la fertilización (115,116), por lo cual se debe prestar especial
atención a este grupo de proteínas y su relación con la criotolerancia espermática en
futuros estudios.
Los procedimientos utilizados para el congelamiento de semen de asnos implican el

examen andrológico (117,118), la colecta de semen, la evaluación seminal, la dilución de
las muestras, su centrifugación, resuspensión con diluyente de congelamiento, envasado,
Capítulo 1 21
refrigeración, estabilización del semen, congelamiento y evaluación seminal post

descongelado (4,20,21,45,60,62) como muchos protocolos de criopreservación seminal
de otras especies. No obstante, el fenómeno de la variabilidad individual a la
criotolerancia espermática de los reproductores asnales, es un fenómeno ha sido poco
documentado y no permite evidenciar claramente los efectos de las diferentes
variaciones en los protocolos de criopreservación, por lo cual, hasta el momento no
existe un protocolo de criopreservación unificado para cada una de estas etapas y por
ende mucha variación entre los resultados experimentales y los procedimientos rutinarios
de campo (45,60,62).
El camino hacia la optimización de protocolos de criopreservación en especies con baja

criotolerancia debe ser abordado con un enfoque multidisciplinario, ya que históricamente
se ha comprobado que este tipo de variables obedecen a variaciones tanto intrínsecas
como extrínsecas al reproductor. Por esta razón, ampliar el conocimiento sobre el estatus
oxidativo de eyaculado antes de la criopreservación, la relación de diferentes proteínas,
particularmente las pertenecientes a las familias HSP del plasma seminal de
reproductores asnales es un paso importante hacia el abordaje holística el fenómeno de
la criotolerancia espermática en esta especie.
2. Capitulo 2. Efecto de la vitamina E y el
tamaño de la pajilla sobre espermatozoides
asnales buenos criotolerantes y malos
criotolerantes
1
Biología CES – EIA; Universidad CES, 2 Grupo de Inmunología Celular e
Inmunogenética; Universidad de Antioquia, 3. Fisiología de la Reproducción; Universidad
Federal de Ceará, 4 Biotecnología Animal; Universidad Nacional de Colombia – sede
Medellín.
2.1 Resumen
La variabilidad a la criotolerancia es un fenómeno que limita la optimización de los
protocolos de criopreservación de semen asnal; por esta razón en este trabajo de
investigación el objetivo fue establecer un criterio de selección de reproductores asnales
BC y MC con base en los diferentes parámetros espermáticos pos descongelación y
determinar los efectos de la adición de vitamina E (20µM, 200µM y 200µM) al diluyente
de congelación y el sistema de empaque en pajillas de 0.25 ml y 0.5 ml sobre 11
variables cinemáticas (%mov, %prog, VAP, VSL, VCL, ALH, BCF, STR, LIN, E, A) y 5
variables estructurales y funcionales (HOST, IMP, PMM, RA, SCSA) de estos dos grupos
de reproductores. Los resultados del presente estudio permitieron establecer los grupos
de reproductores Buenos criotolerantes (BC) y malos criotolerantes (MC), los cuales
mostraron significancia (p < 0,05) para todas las variables evaluadas, lo cual ratifica la
variabilidad que existe entre estos dos grupos de reproductores. De otro lado, se
encontró que los BC tuvieron una diferencia estadísticamente significativa (p = 0,12) para
HOST debido a la adición vitamina E. Los MC mostraron diferencias estadísticas
significativas (p < 0,05) para las variables A, viab y HOST debido a la concentración del
antioxidante. Sumado a esto el tamaño de la pajilla influenció estadísticamente (p < 0,05)
las variables %mov, %prog, VAP, VSL y VCL, siendo los espermatozoides de los MC
empacados en pajillas de 0,25 ml los que tuvieron mejor desempeño. La selección de BC
y MC es una estrategia que permite evaluar respuestas diferenciales a las variaciones de
los protocolos de criopreservación de semen asnal como lo es la adición de antioxidantes
a los diluyentes de congelación o diferentes sistemas de empaque. La adición de
vitamina E no mejoró las características espermáticas pos descongelación y por lo
Capítulo 2 23
contrario afectó la membrana plasmática de los espermatozoides posiblemente por

alteración de la osmolaridad de los espermatozoides y generando estrés oxidativo. Lo
cual abre nuevo interrogantes sobre otros mecanismo que podría estar liderando la
vitamina E en esta especie y debería ser tratado en futuros estudios. El empaque en del
semen en pajillas de 0,25ml mejoró ligeramente los parámetros cinemáticos pos
descongelación de los MC lo cual puede ser una alternativa para mejorar la baja
criotolerancia de estos reproductores.
Palabras clave: criotolerancia, semen asnal, antioxidantes, osmolaridad, estrés

oxidativo, recursos zoogenéticos.
2.2 Introducción
La encuesta Nacional Agropecuaria estimó que para el 2009, el inventario total de
equinos, asnos y mulas varió con relación al de 2008, observándose que los caballos y
mulares registraron incrementos en la población 3,5 y 0,7% respectivamente y la
población de asnos por su parte disminuyó en un 1,4% (119). Estos datos coinciden con
reportes de la FAO de que muchas poblaciones de razas asnales, se encuentran en serio
peligro de endogamia por sus bajas poblaciones (4,10), por lo cual se hace
imprescindible establecer programas de repoblamiento y de criopreservación de semen
como herramientas indispensable para la consolidación de bancos de germoplasma ex
situ para la conservación de recursos zoogenéticos (9,10).
Cabe anotar que los resultados obtenidos en la evaluación de diferentes protocolos de

criopreservación de semen de asnos son muy variables y se caracterizan por la
existencia de una elevada población de reproductores cuyos espermatozoides muestran
pobre criotolerancia o también denominados malos criotolerantes (MC) (58–62), mientras
que una proporción más pequeña de la población muestran buena criotolerancia o
también conocidos como buenos criotolerantes (BC); esto es denominado “variabilidad
individual a la criotolerancia” y limita el empleo efectivo de un grupo importante de
reproductores en un programa de IA basado en semen congelado.
Durante los procesos de criopreservación los espermatozoides están sometidos a estrés

oxidativo, osmótico y fenómenos relacionados con la apoptosis, los cuales el cual están
relacionado con daño en los lípidos de membrana, proteínas, la cromatina y el
metabolismo celular en general. Estos tres procesos pueden estar interrelacionados y
pueden impactar varias organelas celulares por mecanismos similares y que pueden ser
claves en la optimización de protocolos de criopreservación (120–122).
De otro lado, las técnicas utilizadas para congelar semen asnal, deben ser lo
suficientemente eficientes para conservar material seminal funcional, para que en el
futuro las muestras conservadas, puedan ser utilizadas efectivamente para recuperar o
aumentar la variabilidad genética de una población. Por esta razón, el objetivo de este
trabajo de investigación fue establecer un criterio de selección de reproductores asnales
BC y MC con base en los diferentes parámetros espermáticos pos-descongelación y
determinar el efecto que tienen la adición de vitamina E y el sistema de empaque en
pajillas de 0.25 ml y 0.5 ml sobre las características espermáticas cinemáticas,
estructurales y funcionales pos-descongelación de los reproductores asnales
colombianos BC y MC.
criopreservado
2.3 Materiales y métodos
2.3.1 Animales

comprobada y usados rutinariamente en inseminación artificial. Las condiciones bajo las
cuales fueron mantenidos los reproductores donantes eran las propias de cada criadero,
en general, semi-estabulados y mantenidos con una dieta basada en forrajes (pasto
fresco y heno) suplementado con cantidades variables de concentrado, sal mineralizada,
y agua a libre disposición.

Las muestras seminales fueron diluidas en una proporción 1:1 en diluyente Kenney
Capítulo 2 25
que llevara la muestra a una concentración final 2 x 108 espermatozoides viables/ml. Tras
la última dilución, la muestra fue dividida en 4 partes: una sirvió como control (sin
antioxidante) y las tres restantes fueron suplementadas con Vitamina E a
concentraciones de 20 µM, 200 µM y 2000 µM, respectivamente. A su vez, cada uno de
los 4 tratamientos fue empacado en dos sistemas de empaque: pajillas de 0.25 ml o
pajillas de 0.5 ml, luego de lo cual se procedió al proceso de congelación en tres pasos.
Paso uno: enfriamiento de 20ºC a 5ºC a una tasa de enfriamiento de 0.26ºC/min. Paso
dos: descenso de temperatura de 5ºC a -90ºC a una tasa de 4.75ºC/min. Paso tres:
descenso a temperaturas criogénicas, de -90ºC a -120ºC a una tasa de enfriamiento de
11.11ºC/min. Una vez las muestras alcanzaron los -120ºC, fueron sumergidas en
nitrógeno líquido (-196ºC) hasta su evaluación. La descongelación se hizo al momento de
cada análisis en un baño maría a 37°C por al menos 20 segundos. El protocolo de
criopreservación de semen asnal se documentó y se codificó en el protocolo PCR-007
(Anexo 1).

Bioscience, Beverly, MA, USA). Se hicieron tres réplicas por tratamiento en una micro
célula leja (20 µm, 4 pozos); para cada réplica se capturaron 5 campos. Cada evaluación
se hizo en un video de 40 cuadros/seg y se determinan 11 parámetros relacionados con
movilidad, progresión y calidad del desplazamiento: porcentaje espermatozoides móviles
(%mov), porcentaje espermatozoides con movimiento progresivos (%prog), velocidad de
la trayectoria (VAP) µm/s, velocidad progresiva (VSL) µm/s, velocidad curvilínea (VCL)
µm/s, amplitud lateral de la cabeza (ALH) µm, frecuencia de batido de la cola (BCF) Hz,
índice de rectitud (STR), índice de linealidad (LIN), índice de elongación (E), tamaño
promedio de las cabezas de los espermatozoides (A) µm2. Al conjunto de estas variables
de movilidad se les denominó variables cinemáticas (Anexo 1 – PCR-012).


criopreservado


(Anexo 1 PCR-008).


Capítulo 2 27

FL, USA). La fluorescencia del NA monomérico se detectó usando el FL1 y la
fluorescencia del NA agregado se detectó con un detector FL3 y analizados mediante el
software FACSDiva Versión 6.1.3., donde se dividieron las subpoblaciones en cuadrantes
y se cuantificó la frecuencia de las poblaciones de espermatozoides con daño en ADN
(NA agregado) y las poblaciones de espermatozoides sin daño en ADN (NA monomérico)
con lo cual se calculó el porcentaje de espermatozoides con daño en ADN (Anexo 1
PCR-009).

con base en esa información se seleccionaron ambos grupos, usando los controles (sin
antioxidante). Este análisis incluyó 11 variables cinemáticas (%mov, %prog, VAP, VSL,
PMM, RA, SCSA); para la evaluación del efecto de los reproductores (BC y MC) sobre
las diferentes variables se realizó una prueba t-student. Los valores obtenidos de las 16
variables evaluadas (cinemáticas, estructurales y funcionales) fueron expresadas como
los medias ± error estándar de la media (medias ± EEM). De otro lado, para la
determinación del efecto del reproductor, la adición del antioxidante vitamina E y el
tamaño de la pajilla (0,25 ml y 0,5 ml) en cada grupo (BC y MC) sobre las 16 variables
espermáticas evaluadas se hizo una MANOVA y comprobación de significancia de
factores mediante las pruebas de Pillai, Wilks y Hotteling-Lawley. Se utilizó un modelo
lineal de efectos mixtos, tomando al reproductor como un efecto aleatorio y las
concentraciones del antioxidante y el tamaño de la pajilla como efectos fijos (se usó el
paquete estadístico lme4). Para la determinación del efecto de cada una de las variables
evaluadas se realizó un ANOVA y su respectivo análisis de comparación de medias. Para
la evaluación de los supuestos de normalidad de los datos, se utilizó la prueba de
Shapiro-Wilks. Todos los análisis se hicieron con ayuda del software R (123)
2.4 Resultados

Con base en los resultados de los componentes principales se encontró que la primera
componente explica en un 36,7 % la variabilidad del conjunto de datos y de esta primera
componente las variables que más aportan son la VSL (36,4%) y VAP (36,4%). Se
escogió la variable VSL como el criterio de selección entre reproductores BC y MC ya
que es la variable que más aporto a la explicación de la variabilidad del conjunto de datos
(Tabla 3-1). Aquellos reproductores que se encontraban por encima del percentil 25 (VSL
> 45%) en el tratamiento “control negativo” en esta variable, fueron seleccionados como
BC (10 reproductores) y aquellos que estaban por debajo de este valor se clasificaron
como MC (8 reproductores).
criopreservado
Tabla 2-1: Análisis de componentes principales y la participación de cada variable dentro de cada
componente CP.

%mov 0,267 -0,187 0,222
%prog 0,289 -0,094 0,108
VAP 0,364 -0,117 0,047
VSL 0,364 0,099 -0,059
VCL 0,339 0,186 0,177
ALH 0,177 -0,113 0,108
BCF 0,148 0,407 0,288
STR 0,339 -102 -0,098
LIN 0,327 -0,175 -0,189
E 0,234 -0,302 -0,02
A 0,174 0,36 0,381
SCSA 0,252 -0,283 0,328
FITC-PNA 0,162 0,224 -0,142
DIOC-6 -0,003 -0,287 0,413
viab 0,052 0,433 -0,28
HOS 0,047 0,102 0,02
Todas las variables cinemáticas mostraron diferencia estadística significativa (p < 0,05)
por efecto de los reproductores (BC y MC), donde claramente se puede observar que los
reproductores clasificados como BC presentan un mejor desempeño pos descongelación
que los reproductores MC (Figura 2-3).
Tabla 2-2. Comparación de resultados (media ± EEM) de 11 variables cinematicas posdescongelación

de 18 reproductores asnales, 10 clasificados como BC y 8 clasificados como MC y valor p para cada
una de las variables.
media ± EEM
a b
%mov 29,44 ± 1,67 20,56 ± 2,13 0,001
a b
%prog 15,78 ± 0,93 9,23 ± 1,18 1,124e-5
a b
VAP (µm/s) 69,61 ± 2,01 50,54 ± 2,56 2,104e-7
a b
VSL (µm/s) 58,71 ± 1,83 39,62 ± 2,35 1,212e-8
a b
VCL (µm/s) 123.12 ± 3,47 93,27 ± 4,40 1,81e-6
a b
ALH (µm) 6,86 ± 0,41 4,45 ± 0,53 0,0002
a b
BCF (Hz) 31,45 ± 1,01 27,61 ± 1,28 0,0403
Capítulo 2 29
media ± EEM
a b
STR (%) 75,59 ± 1,71 59,14 ± 2,17 6,883e-9
a b
LIN (%) 43,84 ± 1,15 31,68 ± 1,46 3,443e-8
a b
E (%) 71,17 ± 1,77 59,86 ± 2,26 0,0007
a b
A (µm2) 2,52 ± 0,08 2,19 ± 0,10 0,0287
a, b,
De igual manera los reproductores BC mostraron un mejor desempeño respecto a los MC

en las variables estructurales (SCSA, RA, IMP) y funcionales (RA, HOST) encontrando
diferencia estadística significativa (p < 0,05) para las variables SCSA, RA, HOST y para
las variables RA y IMP, aunque no se encontró diferencia estadística significativa, se
observó un promedio mayor de espermatozoides con daño sobre la membrana
acrosomal y plasmática respectivamente. Vale la pena resaltar aspectos como el daño en
ADN que tienen los MC y la baja funcionalidad de la membrana plasmática pueden ser
las características que más afecten la fertilidad del semen congelado de dichos
reproductores (Figura 1-2).
Tabla 2-3. Comparación de resultados (media ± EEM) de la funcionalidad de la membrana plasmática

(HOST), integridad de membrana plasmatica (IMP), potencial de la membrana mitocondrial (PMM),
reacción acrosómica (RA), daño en ADN (SCSA), entre 10 BC y 8 MC (n=18)
Variable BC MC
media ± EEM valor p
a b
HOST (%) 15,67 ± 1,37 9,97 ± 1,63 0.005
a a
IMP (%) 39,62 ± 2,30 33,58 ± 2,80 0,079
a b
PMM (%) 15,67 ± 1,37 9,97 ± 1,63 0,005
a b
RA (%) 0,50 ± 0,09 0,88 ± 0,12 0,035
a b
SCSA (%) 65,66 ± 2,41 79,62 ± 2,86 4,532e-5
a, b,
2.4.2 Resultados reproductores buenos criotolerantes (BC)

En el análisis de MANOVA para los reproductores BC se encontró diferencia estadística
altamente significativa (p < 0,001) para el efecto del reproductor mediante las tres
pruebas (Pillai, Wilks y Hotteling-Lawley) lo cual evidencia la variabilidad innata que
existe entre reproductores para las diferentes variables evaluadas. De otro lado, no se
encontró diferencia estadística significativa (p > 0,05) para los factores tamaño de pajilla
y concentración de vitamina E.
No obstante, en el ANOVA de las variables evaluadas, se encontró diferencia

estadísticamente significativa (p = 0,012) para la funcionalidad de la membrana
plasmática “HOST” debido a la concentración del antioxidante. Siendo el control negativo,
criopreservado
el que mayor porcentaje de espermatozoides reaccionados tuvo como se puede

visualizar en la Tabla 3-4.
Tabla 2-4: efecto de la concentración de vitamina E sobre la funcionalidad de la membrana plasmática

(media ± EEM) mediante la técnica HOST para 10 reproductores BC (n=10)
HOST
Concentración de Antioxidante
media ± EEM
Control negativo (C-) 18,17 ± 2,81a
Vitamina E 20 μM 14,75 ± 2,8b
Vitamina E 200 μM 15,34 ± 2,81ab
Vitamina E 2000 μM 13,44 ± 2,8b
a, b,
Letras diferentes denotan diferencia estadística significativa (p < 0,05).
Para las otras variables evaluadas no se encontró un efecto estadísticamente

significativo (p > 0,05) debido al sistema de empaque o la concentración de antioxidante.
2.4.3 Resultados de reproductores malos criotolerantes (MC)

El análisis de MANOVA para los reproductores MC se encontró diferencia estadística
pruebas (Pillai, Wilks y Hotteling-Lawley) lo cual evidencia la variabilidad que existe entre
reproductores para las diferentes variables evaluadas. Para el factor “tamaño de la
pajilla”, se encontró diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) en las tres
pruebas. Para el factor concentración de vitamina E, se encontró diferencia estadística
significativa (p < 0,05) en la prueba de Pillai y altamente significativa (p < 0,001) para las
pruebas Wilks y Hotteling-Lawley.
Las variables A (p = 0,02), IMP (p = 0,006), HOST (p = 0,003), mostraron una diferencia
estadísticamente significativa debido a la concentración de la vitamina E como se puede
observar en la Tabla 3-5. Se observa un incremento sustancial en el área que recorren
los espermatozoides a medida que incrementa la concentración del antioxidante. Por otro
lado, se observa que la adición de vitamina E, a las diferentes concentraciones afecta
negativamente el porcentaje de espermatozoides viables y reaccionados en la técnica
HOST.
Tabla 2-5: Efecto de la concentración de Vitamina E en los reproductores MC sobre las variables
tamaño promedio de las cabezas de los espermatozoides (A), integridad de membrana plasmática
(IMP) y funcionalidad de la membrana plasmática (HOST) para 8 reproductores MC (n=8)
Concentración de
A IMP HOST
Antioxidante
(media ± EEM)
a
Control negativo (C-) 1,35 ± 0,5 66,17 ± 9,12a 19,23 ± 3,41a
Capítulo 2 31
Vitamina E 20 μM 2,53 ± 0,37b 30,57 ± 4,67b

10,37 ± 2,07b
Vitamina E 200 μM 14,35 ±
2,57 ± 0,37b 34,41 ± 4,56b
2,04ab
Vitamina E 2000 μM 2,63 ± 0,37b 33,59 ± 4,56b 9,08 ± 2,04c
a, b, c,
En los análisis lineales ANOVA se encontró diferencia estadísticamente significativa para
las variables %mov (p = 0,01), %prog (p = 0,007), VAP (p = 0,044), VSL (p = 0,042), VCL
(p = 0,024), debido al tamaño de la pajilla. En la Tabla 4-1 se puede observar que los
espermatozoides empacados en pajillas de 0,25 ml mostraron una mejor respuesta pos-
descongelación para las variables anteriormente mencionadas.
Tabla 2-6 : Efecto del tamaño de la pajilla (0,25ml y 0,5ml) sobre las variables de porcentaje de
espermatozoides móviles (%mov), porcentaje de espermatozoides prograsivos (%prog), velocidad de
la trayectoria (VAP), velocidad progresiva (VSL) y velocidad curivilinea (VCL) para 8 reproductores
MC (n=8).
VAP
Tamaño de %mov %prog VSL µm/s VCL µm/s
µm/s
la Pajilla
(media ± EEM)
a a a a a
0,25 ml 28,83 ± 9,03 13,31 ± 4,26 63,55 ± 8,86 51,43 ± 7,5 114,81 ± 14,54
b b b b b
0,5 ml 23,15 ± 9,02 10,41 ± 4,25 54,74 ± 8,8 41,61 ± 7,4 97,83 ± 14,44
a, b,
2.5 Discusión
La presencia de subpoblaciones de reproductores anales buenos criotolerantes y malos
criotolerantes, limita el empleo de una proporción importante de los reproductores
asnales como donantes en un programa de IA basado en semen congelado (59,82). Por
lo tanto, uno de los grandes retos a nivel investigativo y comercial, para establecer
estrategias biotecnológicas que permitan mejorar esta condición, lo cual facilitaría la
creación de bancos genéticos y programas de IA con semen congelado tal como
funcionan en otras especies (12,58).

principales con el propósito de reducir la dimensionalidad del conjunto de datos y para
datos con un 36.7% y dentro de la misma, la variable espermática que más aportó a la
explicación de variabilidad de los datos fue VSL con 36,4%, por lo cual se escogió los
reproductores que se encontraban por encima del percentil 25 en esta variable (VSL > 45
µm/s) como parámetro de selección entre los BC y aquellos que estaban por debajo de
este valor se clasificaron como MC. Esta estrategia de selección, permitió la
conformación de dos grupos de reproductores BC (10 reproductores) y MC (8
reproductores) que mostraron un comportamiento diferencial de la respuesta pos
descongelación de las 11 variables cinemáticas y 4 variables estructurales y funcionales,
siendo los BC quienes tuvieron un mejor desempeño pos descongelación en todas las
variables cinemáticas respecto a los MC. No se encontró diferencia estadística (p > 0,05)
criopreservado
para la variable IMP (Tabla 3-2). Los MC mostraron porcentaje de daño en ADN
significativamente mayor (p < 0,01), al igual que un mayor porcentaje de
espermatozoides con daño en las membranas acrosomales y un menor porcentaje de
espermatozoides con alto potencial de membrana mitocondrial que los BC (Tabla 3-3).
Muchos trabajos de investigación, han catalogado los parámetros de movilidad como los
marcadores confiables de calidad espermática y de fertilidad en humanos (91–94) y en
animales domésticos incluidos los burros (95–98). En este mismo sentido, se han venido
utilizando parámetros de progresividad como estrategia de selección entre buenos y
malos criotolerantes en cerdos (67,99,100) y caballos (59,67,79,101), lo cual demuestra
la utilidad de las variables cinemáticas como estrategia de selección para criotolerancia
espermática. Nuestros resultados, demuestran que utilizar el parámetro VSL por encima
del percentil 25, es buen parámetro de selección de reproductores de burros criollos
colombianos por su criotolerancia espermática BC y MC.
Los procedimientos utilizados para la congelación de semen de asnos implican el

examen andrológico (117,118), la colecta de semen, la evaluación seminal, la dilución de
las muestras, su centrifugación, resuspensión con diluyente de congelamiento, envasado,
refrigeración, estabilización del semen, congelamiento y evaluación seminal post
descongelado (4,20,21,45,60,62) como muchos protocolos de criopreservación seminal
de otras especies. En los últimos años se han venido modificando los protocolos de
criopreservación de semen, tanto en equinos como en otras especies que presentan
dificultades para la criopreservación. Se han adaptado y desarrollado diferentes sistemas
de empaque: pajillas de 0.5 ml y 0.25 ml (19–22), Flatpacks (23), Mini-Flatpacks (24) y
algunos sistemas abiertos (25). Se ha ensayado también con las tasas de enfriamiento y
una variedad amplia de diluyentes y crioprotectores (16,21,22,26–32). En este último
sentido se ha demostrado la necesidad obligada de suplementar los diluyentes de
congelación con antioxidantes (33–42), a fin de evitar o reducir daños como la
peroxidación lipídica, el daño en ADN y demás organelas que afectan el óptimo
comportamiento espermático pos-descongelación (34–37,40).
Los resultados obtenidos demuestran que la respuesta de los reproductores BC o MC a

dichas variaciones en el protocolo de criopreservación, como la adición del antioxidante
vitamina E y el tamaño de la pajilla (0,25ml o 0,5 ml) es sustancialmente diferente.
Particularmente para los reproductores BC la adición de vitamina E o el sistema de
empaque no tuvieron un efecto muy marcado sobre las 16 variables espermáticas
evaluadas pos descongelación, aunque se encontró significancia (p = 0,012) sobre la
funcionalidad de la membrana plasmática HOST debido a la adición del antioxidante,
encontrando una leve reducción del porcentaje de espermatozoides reaccionados pos
descongelación debido a los tratamientos con el antioxidante. Igualmente, los
reproductores MC mostraron un efecto significativo (p < 0,05) para las variables A, IMP y
HOST. Para la variable A se observó que los tratamientos con el antioxidante duplicaban
el tamaño de la cabeza de los espermatozoides, además alteraban claramente las
variables IMP y HOST donde se evidenció un claro deterioro en las membranas
plasmáticas debido a los tratamientos con la vitamina E. Estos resultados contrastan con
los reportes de algunos autores sobre los efectos protectores en las membranas de este
antioxidante (52,124–129) ya que los tratamientos con vitamina E afectaron
notablemente el porcentaje de espermatozoides con membranas íntegras y funcionales,
al igual que el %mov y %prog a las concentraciones de 200 µM y 2000µM.
Capítulo 2 33
Estos hallazgos pueden ser explicados por mecanismos no relacionados con la

capacidad antioxidante de la vitamina E, donde la molécula se incorpora dentro de la
membrana plasmática y altera la función de proteínas asociadas e integradas a la
membrana, afectando incluso la transducción de señales y potencialmente fomentando
los procesos de capacitación espermática (130). Esta condición, puede estar afectando la
osmolaridad de la célula a través de la alteración de la permeabilidad de la membrana
plasmática de los espermatozoides asnales, particularmente los MC, lo cual se ve
reflejado en el incremento del tamaño de la cabeza de los espermatozoides al
incrementar la concentración del antioxidante (2,53 μm – 2,63 μm) sumado a los
resultados de la variable E, que está relacionada con la morfología de los
espermatozoides, los MC tuvieron valores promedio de 59,86 mientras que los BC
tuvieron un valor de 71,17, lo que significa que los espermatozoides de los MC tiene una
morfología más alargada. Estas alteraciones generan un estrés osmótico en los
espermatozoides, promoviendo la liberación de aniones superóxido e induciéndolos a
estrés oxidativo y alterando las características estructurales y funcionales del
espermatozoide asnal (120–122). Este mismo fenómeno puede actuar de manera aditiva
en le prueba HOST, donde se exponen los espermatozoides a condiciones
hipoosmoticas agravando mucho más dicha condición (122).
El tamaño de la pajilla también mostró un efecto significativo (p < 0,05) sobre las
variables %mov, %prog, VAP, VSL y VCL, encontrando mayores valores para los
espermatozoides empacados en pajillas de 0,25 ml; lo que permite comprobar que el
sistema de empaque tiene un efecto importante sobre los parámetros de movilidad
espermática que explican la trayectoria del espermatozoide siendo un mejor sistema de
empaque las pajillas de 0.25 ml, que las pajillas de 0.5 ml para conservar las
características que explican la trayectoria espermática como se puede observar en la
Tabla 1-4. Esto se debe a que las pajillas de 0.25 ml permiten una mejor transferencia de
la temperatura durante el proceso de criopreservación y disminuye los daños
ocasionados por los cristales a nivel intracelular, pero limita el volumen de semen que
puede ser empacado en ellas, por lo cual se deben usar varias pajillas para alcanzar una
dosis inseminante (35–38).
La respuesta diferencial a variaciones en el protocolo entre los reproductores BC y MC

abre nuevas perspectivas en la investigación de variables que permitan optimizar los
protocolos de criopreservación de esta especie. Con la estrategia de selección de
reproductores mediante modelos estadísticos multivariados como el de componentes
principales se puede ampliar el espectro de pruebas que permitan predecir con mayor
grado de precisión poblaciones de reproductores que respondan de una manera
diferencial a los procedimientos de criopreservación de semen y de esta manera
establecer bancos de germoplasma con base en reproductores BC para instaurar
programas de IA con semen congelado que pueda ser utilizadas efectivamente para
recuperar o aumentar la variabilidad genética de una población. Sumado a esto, como los
reproductores asnales no son seleccionados por su criotolerancia sino por sus
características fenotípicas, es importante seguir investigando sobre estrategias que
permitan optimizar las características seminales posdescongelación de los reproductores
MC bien sea a través de estrategias de manejo zootécnico y/o veterinario o mediante
herramientas biotecnológicas y experimentales en los diferentes pasos durante el
protocolo de criopreservación de semen.
3. Capítulo 3: Efecto de la quercetina y el
tamaño de la pajilla sobre la criotolerancia
de espermatozoides asnales
1
Biología CES – EIA; Universidad CES, 2: Grupo de Inmunología Celular e
Inmunogenética; Universidad de Antioquia, 3.Fisiología de la Reproducción; Universidad
Federal de Ceará 4Biotencología Animal; Universidad Nacional de Colombia – sede
Medellín.
3.1 Resumen
El objetivo de este trabajo de investigación fue establecer un criterio de selección de
reproductores asnales BC y MC con base en los diferentes parámetros espermáticos pos
descongelación y determinar el efecto que tiene la adición de quercetina a los diluyentes
de criopreservación y el sistema de empaque en pajillas de 0.25 ml y 0.5 ml, sobre las
características espermáticas estructurales y funcionales pos-descongelación de los
burros criollos colombianos BC y MC. Los resultados del presente estudio permitieron
establecer los grupos de reproductores BC y MC, los cuales mostraron significancia (p <
0,05) para la mayoría de variables espermáticas evaluadas, lo cual ratifica la variabilidad
que existe entre estos dos grupos de reproductores. Los BC mostraron una diferencia
estadísticamente significativa (p < 0,05) para las variables cinemáticas VCL, BCF, A y
LIN, debido a la adición de quercetina, encontrando que los espermatozoides
aumentaban los patrones de movilidad, pero su trayectoria no era lineal. Igualmente se
encontró significancia en HOST, debido a la adición de quercetina. El tamaño de pajilla
solo mostro un efecto significativo (p = 0,03) sobre la variable A. El sistema de selección
de los reproductores entre BC y MC mediante componentes principales fue una
estrategia adecuada para evaluar el efecto diferencial de la adición de quercetina y el
sistema de empaque sobre estos dos grupos de reproductores. De otro lado, la adición
de quercetina mejoró ostensiblemente los parámetros espermáticos pos-descongelación
principalmente en los MC y el sistema de empaque no tuvo un efecto contundente sobre
las características espermáticas pos-descongelación de los dos grupos de reproductores
BC y MC.
Palabras clave: criorresistencia, semen asnal, antioxidantes, recursos zoogenéticos,

sistemas de empaque de semen, características cinemáticas, quercetina.
criopreservado
3.2 Introducción
Los burros se encuentran distribuidos alrededor del mundo y se estima que hay unos 52
millones de individuos entre asnales y sus híbridos mulares. Aunque los burros siempre
han jugado un papel preponderante en la historia del hombre, por su capacidad de
trabajo y resistencia a condiciones ambientales adversas, en los últimos años se ha
venido incrementando el interés en su uso como reproductores para la obtención de
mulares, que son empleados por su fuerza de trabajo en las granjas y por la novedosa
práctica de usar estos mulares para la monta recreativa y de exposición de paso fino (1–
3,10).
Las biotecnologías reproductivas como la inseminación artificial (IA), la congelación de

semen y la transferencia de embriones, son herramientas de gran importancia al servicio
de la equinocultura mundial, siendo un instrumento directo de mejoramiento genético.
Las ventajas que ofrece IA son tan vastas, que tal vez sea la biotecnología con mayor
impacto en la producción equina, pues un reproductor puede dejar centenares de
descendientes a lo largo de su vida reproductiva y aun después de ella (131,132).
En términos generales las biotecnologías reproductivas (particularmente la IA, la

congelación de semen, la transferencia de embriones y la fertilización in vitro) son una
herramienta clave para la construcción de bancos genéticos y el rango de beneficios van
desde la mayor eficiencia para la distribución de genes y evitar los efectos adversos de la
endogamia, hasta la posibilidad de preservar y asegurar gametos para potenciar la
diversidad genética en situaciones futuras. Particularmente, se ha determinado que las
técnicas de criopreservación de semen, son una herramienta indispensable para la
consolidación de bancos de germoplasma ex situ para la conservación de recursos
zoogenéticos como los burros criollos colombianos que se encuentran en serio peligro de
extinción por su bajo número poblacional. Cabe anotar que los resultados obtenidos en la
evaluación de diferentes protocolos de criopreservación de semen de asnos son muy
variables y se caracterizan por la existencia de una elevada población de reproductores
cuyos espermatozoides muestran pobre criotolerancia o también denominados malos
criotolerantes (MC) (58–62), mientras que una proporción más pequeña de la población
muestran buena criotolerancia o también conocidos como buenos criotolerantes (BC);
esto es denominado “variabilidad individual a la criotolerancia” y limita su empleo efectivo
en cualquier programa de IA basado en semen congelado. Sin embargo, dichas técnicas
deben ser lo suficientemente eficientes para conservar material seminal funcional, para
que en un futuro dichas muestras conservadas, puedan ser utilizadas efectivamente para
recuperar o aumentar la variabilidad genética de una población (21). Por esta razón, el
objetivo de este trabajo de investigación fue establecer un criterio de selección de
reproductores asnales BC y MC con base en los diferentes parámetros espermáticos pos
descongelación y determinar el efecto que tienen la adición del antioxidante quercetina y
el sistema de empaque en pajillas de 0.25 ml y 0.5 ml, sobre las características
espermáticas estructurales y funcionales pos-descongelación de los burros criollos
colombianos BC y MC.
Capitulo 3 37
3.3 Metodología
3.3.1 Animales

comprobada y usados rutinariamente en inseminación artificial. Las condiciones bajo las
cuales fueron mantenidos los reproductores donantes eran las propias de cada criadero,
en general, semi-estabulados y mantenidos con una dieta basada en forrajes (pasto
fresco y heno) suplementado con cantidades variables de concentrado, sal mineralizada,
y agua a libre disposición.

Las muestras seminales fueron diluidas en una proporción 1:1 en diluyente Kenny
que llevara la muestra a una concentración final 2 x 108 espermatozoides viables/ml. Tras
la última dilución, la muestra fue dividida en 4 partes: una sirvió como control (sin
antioxidante) y las tres restantes fueron suplementadas con quercetina 2.5 µM, 25 µM y
250 µM, respectivamente. A su vez, cada uno de los 4 tratamientos fue empacado en dos
criopreservado
sistemas de empaque: pajillas de 0.25 ml o pajillas de 0.5 ml, luego de lo cual se

procedió al proceso de congelación en tres pasos. Paso uno: enfriamiento de 20ºC a 5ºC
a una tasa de enfriamiento de 0.26ºC/min. Paso dos: descenso de temperatura de 5ºC a -
90ºC a una tasa de 4.75ºC/min. Paso tres: descenso a temperaturas criogénicas, de -
90ºC a -120ºC a una tasa de enfriamiento de 11.11ºC/min. Una vez las muestras
alcanzaron los -120ºC, fueron sumergidas en nitrógeno líquido (-196ºC) hasta su
evaluación. La descongelación se hizo al momento de cada análisis en un baño maría a
37°C por al menos 20 segundos. El protocolo de criopreservación de semen asnal se
documentó y se codificó en el protocolo PCR-007 (Anexo 1).

Bioscience, Beverly, MA, USA). Se hicieron tres réplicas por tratamiento en una
microcélula leja (20 µm, 4 pozos); para cada réplica se capturaron 5 a 10 campos. Cada
evaluación se hizo en un video de 40 cuadros/seg y se determinan 11 parámetros
relacionados con movilidad, progresión y calidad del desplazamiento: porcentaje
espermatozoides móviles (%mov), porcentaje espermatozoides con movimiento
progresivos (%prog), velocidad de la trayectoria (VAP) µm/s, velocidad progresiva (VSL)
µm/s, velocidad curvilínea (VCL) µm/s, amplitud lateral de la cabeza (ALH) µm,
frecuencia de batido de la cola (BCF), índice de rectitud (STR), índice de linealidad (LIN),
índice de elongación (E), tamaño promedio de las cabezas de los espermatozoides (A)
µm2. Al conjunto de estas variables de movilidad se les denominó variables cinemáticas
(Anexo 1 – PCR-012).


Capitulo 3 39


(Anexo 1 PCR-008).


FL, USA). La fluorescencia del NA monomérico se detectó usando el FL1 y la
fluorescencia del NA agregado se detectó con un detector FL3 y analizados mediante el
criopreservado
software FACSDiva Versión 6.1.3., donde se dividieron las subpoblaciones en cuadrantes

y se cuantificó la frecuencia de las poblaciones de espermatozoides con daño en ADN
(NA agregado) y las poblaciones de espermatozoides sin daño en ADN (NA monomérico)
con lo cual se calculó el porcentaje de espermatozoides con daño en ADN (Anexo 1
PCR-009).

con base en esa información se seleccionaron ambos grupos, usando los controles (sin
antioxidante). Este análisis incluyó 11 variables cinemáticas (%mov, %prog, VAP, VSL,
PMM, RA, SCSA); para la evaluación del efecto de los reproductores (BC y MC) sobre
las diferentes variables se realizó una prueba t-student. Los valores obtenidos de las 16
variables evaluadas (cinemáticas, estructurales y funcionales) fueron expresadas como
los medias ± error estándar de la media (medias ± EEM). De otro lado, para la
determinación de los efectos de las diferentes concentraciones del antioxidante
quercetina y el tamaño de la pajilla en cada grupo (BC y MC) sobre las 16 variables
espermáticas evaluadas se hizo una MANOVA y comprobación de significancia de
factores mediante las pruebas de Pillai, Wilks y Hotteling-Lawley. Se utilizó un modelo
lineal de efectos mixtos, tomando al reproductor como un efecto aleatorio y las
concentraciones del antioxidante y el tamaño de la pajilla como efectos fijos (se usó el
paquete estadístico lme4). Para la determinación del efecto de cada una de las variables
evaluadas se realizó un ANOVA y su respectivo análisis de comparación de medias. Para
la evaluación de los supuestos de normalidad de los datos, se utilizó la prueba de
Shapiro-Wilks. Todos los análisis se hicieron con ayuda del software R (123).
3.4 Resultados

El resultado de los componentes principales se encontró que la primera componente
explica en un 36,2 % la variabilidad del conjunto de datos y de esta primera componente
la que variable que más aporta es la VSL (36,9%) y VAP (36,7%). Se escogió la variable
VSL como el criterio de selección entre reproductores BC y MC ya que es la variable que
más aporto a la explicación de la variabilidad del conjunto de datos (Tabla 3-1). Aquellos
reproductores que se encontraban por encima del percentil 25 (VSL > 45%) en el
tratamiento “control negativo” en esta variable fueron seleccionados como BC (10
reproductores) y aquellos que estaban por debajo de este valor se clasificaron como MC
(8 reproductores).
Tabla 3-1: Análisis de componentes principales y la participación de cada variable

en dentro de cada componente CP.
Capitulo 3 41

%mov 0,24 0,167 -0,416
%prog 0,279 0,064 -0,365
VAP 0,367 -0,13 -0,107
VSL 0,369 -0,115 -0,041
VCL 0,34 -0,217 -0,184
ALH 0,206 -0,099 -0,141
BCF 0,17 -0,295 0,064
STR 0,315 0,153 0,281
LIN 0,307 0,238 0,282
E 0,189 0,388 0,172
A 0,207 -0,331 -0,089
SCSA -0,096 0,371 -0,117
FITC-PNA -0,095 -0,22 0,108
DIOC-6 -0,009 0,223 -0,258
viab 0,024 -0,387 0,378
HOST 0,002 0,053 0,186
Las variables cinemáticas que mostraron diferencia estadística significativa (p < 0,05) por
efecto de los reproductores (BC y MC) fueron %mov, %prog, VAP, VSL, VCL, ALH, STR
y LIN, donde claramente se puede observar que los reproductores clasificados como BC
mostraron un mejor desempeño pos descongelación que los reproductores MC. Las
variables BCF, E y A no mostraron diferencia estadística significativa entre ambos
grupos.
Tabla 3-2. Comparación de resultados (media ± EEM) de 11 variables cinemáticas posdescongelación

de 18 reproductores asnales, 10 clasificados como BC y 8 clasificados como MC y valor p para cada
una de las variables.
media ± EEM
a b
%mov 31,14 ± 1,22 24,87 ± 1,67 0,0044
a b
%prog 17,02 ± 0,69 10,94 ± 0,95 1,954e-7
a b
VAP (µm/s) 71,63 ± 1,13 61,12 ± 1,55 7,649e-7
a b
VSL (µm/s) 60,55 ± 1,13 48,41 ± 1,55 1,03e-8
a b
VCL (µm/s) 127,45 ± 1,80 112,53 ± 2,46 3,156e-7
a b
ALH (µm) 7,13 ± 0,30 5,28 ± 0,41 9,439e-5
a b
BCF (Hz) 33,33 ± 0,54 33,60 ± 0,74 0,806
a b
STR (%) 78,59 ± 0,62 71,28 ± 0,85 3,417-8
a b
LIN (%) 44,79 ± 0,58 40,51 ± 0,80 0,0003
criopreservado
media ± EEM
a a
E (%) 73,18 ± 0,63 75,05 ± 0,86 0,1229
a a
A (µm2) 2,73 ± 0,04 2,72 ± 0,06 0,916
a, b,
Se encontró diferencia estadística significativa (p < 0,05) para las variables SCSA (p =
0,021), PMM (p = 0,002), IMP (p = 0,046) y HOST (p = 0,03) y para la variable RA,
aunque no se encontró diferencia estadística significativa (p > 0,05). Vale la pena resaltar
aspectos como el alto daño en ADN, la baja funcionalidad de la membrana plasmática y
bajo potencial de membrana mitocondrial que tienen los MC (Tabla 4-3).
Tabla 3-3. Comparación de los resultados (media ± EEM) de la funcionalidad de la membrana

plasmática (HOST), integridad de la membrana plasmática (IMP, potencial de la membrana
mitocondiral (PMM), reacción acrosómica (RA), daño en ADN (SCSA), entre 10 BC y 8 MC (n = 18), y
valor p para cada una de las variables.
Variable BC MC
Media ± EEM valor p
a b
HOST (%) 12,67 ± 0,63 10,75 ± 0,75 0.038
a a
IMP (%) 41,71 ± 2,23 33,15 ± 2,72 0,009
a b
PMM (%) 15,20 ± 1,27 9,59 ± 1,49 0,002
a b
RA (%) 0,60 ± 0,55 0,73 ± 0,64 0,331
a b
SCSA (%) 65,80 ± 2,58 77,15 ± 3,06 0,021
a, b,
3.4.2 Resultados reproductores buenos criotolerantes (BC)

En el análisis de MANOVA para los reproductores BC se encontró diferencia estadística
altamente significativa (p < 0,001) para el efecto del reproductor y concentración de
quercetina mediante las tres pruebas (Pillai, Wilks y Hotteling-Lawley) lo cual evidencia la
diferencia significativa en al menos una de las concentraciones del antioxidante. De otro
lado, no se encontró diferencia estadística significativa (p > 0,05) para el tamaño de
pajilla.
En el ANOVA de las variables evaluadas, se encontró diferencia estadísticamente

significativa para VCL (p = 0,03), BCF (p = 0,01), A (p = 0,008), LIN (p = 0,01), y HOST (p
< 0,001), debido a la concentración del antioxidante quercetina. Para las variables VCL,
BCF, y A, se observó un incremento para los diferentes tratamientos con quercetina
respecto al control, contrariamente la variable LIN que hace referencia a la trayectoria del
desplazamiento de los espermatozoides se observó una disminución en los tratamientos
con quercetina respecto al control, por lo cual se puede interpretar que, aunque los
Capitulo 3 43
espermatozoides tenían unos patrones de movilidad mayor, su trayectoria no era lineal.

Por otro lado, se encontró que la membrana plasmática tuvo mayor funcionalidad en el
control que en los diferentes tratamientos con quercetina como se puede visualizar en la
Tabla 3-4.
Tabla 3-4: Comparación de los resultados de la concentración de quercetina (media ± EEM) para las
variables de velocidad curvilínea (VC), frecuencia de batido de la cola (BCF) tamaño promedio de la
cabeza de los espermatozoides A, índice de linealidad (LIN) y funcionalidad de la membrana
plasmática (HOST) para reproductores BC (n =10)
Concentración de VCL µm/s BCF Hz A µm2 LIN % HOST %

Antioxidante media ± EEM
a a a a
Control negativo (C-) 117,78± 8,75 31,35 ± 2,12 2,58 ± 0,19 58,07 ± 3,99 18,13 ± 2,68
a
ab b b b
Quercentina 2,5 μM 128,76 ± 8,7 34,93 ± 2,11 2,97 ± 0,19 45,88 ± 3,92 10,57 ± 2,67
b
ab b b b
Quercentina 25 μM 130,32 ± 8,7 34,82 ± 2,11 2,81 ± 0,19 46,25 ± 3,92 12,64 ± 2,67
ab c
b b b c
Quercentina 250 μM 132,68 ± 8,7 34,90 ± 2,11 2,77 ± 0,19 45,93 ± 3,92 14,53 ± 2,67
ab
a, b, c,
3.4.3 Resultados reproductores malos criotolerantes (MC)

El análisis de MANOVA para los reproductores MC se encontró diferencia estadística
pruebas (Pillai, Wilks y Hotteling-Lawley). Para el factor tamaño de la pajilla, se encontró
diferencia estadísticamente significativa (p < 0,01) en las tres pruebas y para el factor
concentración de quercetina se encontró diferencia estadística altamente significativa (p
< 0,001) en las tres pruebas.
En el ANOVA de los reproductores BC se encontró diferencia estadísticamente

significativa para las variables A (p = 0,021), RA (p = 0,005), PMM (p = 0,007), IMP (p <
0,001) y HOST (p < 0,001) debido a la adición de quercetina. Para la variable A se
encontró un incremento del doble del promedio del tamaño de la cabeza de los
espermatozoides de los reproductores MC respecto al control. sumado a esto, se
observó un mayor porcentaje de espermatozoides con acrosomas deteriorados en el
control respecto a las diferentes concentraciones del antioxidante. También, se observa
un incremento en el potencial de membrana mitocondrial (RA) a las diferentes
concentraciones de quercetina, especialmente a las concentraciones de 2,5 μM y 25 μM.
Por otro lado, se observa un menor porcentaje de espermatozoides con membranas
integras (IMP) en los tratamientos con el antioxidante y funcionales (HOST) en los
tratamientos con quercetina donde se observa claramente un efecto de dosis respuesta
(Tabla 4-5).
criopreservado
Tabla 3-5: Comparación de los resultados de la concentración de quercetina (media ± EEM) para las
variables de tamaño promedio de la cabeza de los espermatozoides (A), reacción acrosómica (RA),
integridad de la membrana mitocondrial (PMM) y funcionalidad de la membrana plasmática (HOST)
para reproductores MC (n = 8).
Concentración de A µm2 RA % PMM % IMP % HOST %

Antioxidante Media ± Error Estándar
a a a a a
Control negativo (C-) 1,25 ± 0,49 17,95 ± 4,28 3,56 ± 4,2 69,44 ± 8,25 18,22 ± 2,62
b b b b
Quercentina 2,5 μM 2,46 ± 0,33 1,85 ± 2,22 11,56 ± 2,81 33,16 ± 5,41 8,05 ±1,67
b
b b b b bc
Quercentina 25 μM 2,68 ± 0,34 2,26 ± 2,32 9,55 ± 2,88 32,38 ± 5,54 11,48 ± 1,72
b b c b c
Quercentina 250 μM 2,48 ± 0,33 2,76 ± 2,2 5,16 ± 2,81 34,08 ±5,41 12,26 ± 1,67
a, b, c,
El tamaño de la pajilla solo mostró significancia (p = 0,03) para la variable A, encontrando

un mejor un incremento en el tamaño de la cabeza de los espermatozoides empacados
en pajillas de 0,25 ml (2,46 ± 0,33 µm2) respecto a los empacados en pajillas de 0,5 ml
(2,02 ± 0,33 µm2).
3.5 Discusión
principales con el propósito de reducir la dimensionalidad del conjunto de datos e
datos con un 36.2% y dentro de la misma las variables espermáticas que más aportaron
fueron las variables cinemáticas VSL y VAP con 36,9% y 36,7% respectivamente (Tabla
3-1), por lo cual se escogió los reproductores que se encontraban por encima del
percentil 25 en la variable VSL (VSL > 45 µm/s) como parámetro de selección entre los
BC y aquellos que estaban por debajo de este valor se clasificaron como MC. Esta
estrategia de selección, permitió la conformación de dos grupos de reproductores, los BC
(10 reproductores) y MC (8 reproductores) que mostraron un comportamiento diferencial
de la respuesta pos descongelación de 8 variables cinemáticas relacionadas con la
movilidad y 4 variables estructurales y funcionales (HOST, IMP, PMM y SCSA), pero no
se encontró diferencia en RA entre ambos grupos. Los reproductores BC tuvieron un
mejor desempeño en todas las variables cinemáticas que los reproductores MC, salvo en
BCF, E y A, donde los MC mostraron una alta variabilidad, lo cual no permitió evidenciar
el efecto del reproductor para dichas variables (Tabla 3-2). Los reproductores MC
mostraron porcentaje de daño en ADN significativamente mayor (p < 0,05) que los BC,
un mayor porcentaje de espermatozoides con daño en las membranas plasmáticas,
membranas acrosomales y un menor porcentaje de espermatozoides con alto potencial
de membrana mitocondrial (Tabla 3-3). En este mismo sentido, se han venido utilizando
parámetros de progresividad como estrategia de selección entre buenos y malos
criotolerantes en cerdos (67,99,100) y caballos (59,67,79,101), lo cual demuestra la
utilidad de las variables cinemáticas como estrategia de selección para criotolerancia
Capitulo 3 45
espermática. Nuestros resultados, demuestran que utilizar el parámetro VSL por encima
del percentil 25, es buen parámetro de selección de reproductores de burros criollos
colombianos por su criotolerancia espermática BC y MC.
Nuestros resultados demuestran que los reproductores BC y MC responden de manera

sustancialmente diferente a variaciones en el protocolo de criopreservación, como la
adición del antioxidante quercetina (2,5 μM, 25 μM y 250 μM) y el tamaño de la pajilla
(0,25ml o 0,5 ml). Particularmente para los reproductores BC la adición de quercetina
afecto significativamente (p < 0,05) las variables cinemáticas VCL, BCF, A donde se
puede observar un claro incremento en los tratamientos con el antioxidante respecto al
control y una reducción en LIN, lo cual demuestra que, aunque la quercetina aumenta los
patrones de movilidad, el índice de linealidad disminuye. De otro lado, se observó un
cambio en la morfología de los espermatozoides aumentando el tamaño de la cabeza
con respecto al control. La funcionalidad de la membrana plasmática también se vio
afectada por la adición del antioxidante, mostrando una reducción altamente significativa
(p < 0,001) en los espermatozoides reaccionados a condiciones hipo-osmóticas. De otro
lado, el sistema de empaque no tuvo efecto sobre las 16 variables espermáticas
evaluadas pos descongelación.
Los reproductores MC mostraron un efecto significativo (p = 0,021) sobre el A debido los

tratamientos con el antioxidante, lo que indica un incremento en el tamaño de la cabeza
de los espermatozoides, respecto al control. Uno de los efectos más contundentes fue
sobre la integridad acrosomal y el potencial de membrana mitocondrial. Se observó un
aumento significativo (p = 0,005) en la capacidad protectora de la membrana acrosomal
en los tratamientos con los antioxidantes el cual se ve reflejado en una reducción de los
espermatozoides que RA, de la misma forma se observó un incremento significativo
sobre el potencial de membrana mitocondrial (p = 0,007) lo cual puede estar relacionado
con el incremento en los patrones de movilidad en las diferentes variables cinemáticas.
Los tratamientos con quercetina mostraron un porcentaje de espermatozoides con
membranas integras y funcionales significativamente menor (p < 0,05) que el control.
Estos resultados contrastan con lo reportado por algunos autores donde reportan efectos
protectores de membranas por la adición de antioxidantes (52,124–129).
La quercetina es poderoso antioxidante polifenólico que se reduce el estrés oxidativo en

diferentes sistemas celulares a través de la supresión del anión superoxido, quelante de
iones e inhibidor de la formación de peróxidos lipídicos (133). No obstante en
espermatozoides equino ha tenido un comportamiento controvertido, pues aunque
durante los procesos de criopreservación esta antioxidante ejerce un efecto protector,
después de periodos de incubación de 1 a 3 horas los tratamientos con quercetina
ejercen un efecto deletéreo sobre las membranas plasmáticas disminuyendo la IMP y las
HOST, posiblemente por procesos prooxidantes liderados por este compuesto
(57,134,135) incluso a concentraciones menores a las evaluadas en el presente trabajo.
Por otro lado, se ha reportado que la quercetina, ejerce su efecto protector sobre
espermatozoides a través de la inhibición de la glicólisis, disminuyendo la acidificación de
los medios, y aumentando la actividad mitocondrial, al igual que en los resultados el
presente trabajo, lo cual beneficia en cortos periodos de tiempo las características de
movilidad espermática (135).
Los espermatozoides empacados en pajillas de 0,5 ml experimentaron un cambio en la

morfología espermática (p = 0,03) comparado con los empacados en pajillas de 0,25 ml,
criopreservado
esto se debe posiblemente a que las pajillas de 0.25 ml permiten una mejor transferencia
de la temperatura durante el proceso de criopreservación y disminuye los daños
ocasionados por los cristales a nivel intracelular. La desventaja del uso de pajillas de
0,25ml es que el semen que puede ser empacado en ellas es limitado y se deben usar
varias pajillas para alcanzar una dosis inseminante (35–38), lo cual podría aumentar la
variabilidad en campo y afectar los resultados finales de fertilidad.
Con la estrategia de selección de reproductores mediante modelos estadísticos

multivariados como el de componentes principales se puede ampliarse el espectro de
pruebas que permitan predecir con mayor grado de precisión poblaciones de
reproductores que respondan de una manera diferencial a los procedimientos de
criopreservación de semen. Sumado a esto, la respuesta diferencial a variaciones en el
protocolo entre los reproductores BC y MC abre nuevas perspectivas en la investigación
de variables que permitan optimizar los protocolos de criopreservación de esta especie y
el desarrollo de protocolos personalizados para grupos de reproductores con diferente
grado de criotolerancia. De otro lado, se pueden establecer bancos de germoplasma con
base en reproductores BC para instaurar programas de IA con semen congelado que
pueda ser utilizadas efectivamente para recuperar o aumentar la variabilidad genética de
una población. Sumado a esto, como los reproductores asnales no son seleccionados
por su criotolerancia sino por sus características fenotípicas, es importante seguir
investigando sobre estrategias que permitan optimizar las características seminales
posdescongelación de los reproductores MC bien sea a través de estrategias de manejo
zootécnico y/o veterinario o mediante herramientas biotecnológicas y experimentales en
los diferentes pasos durante el protocolo de criopreservación de semen.
Conclusiones y recomendaciones 47
4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Conclusiones
En este trabajo de investigación se logró establecer una metodología para la
selección de reproductores BC y MC mediante el análisis multivariado de
componentes principales, con base en 19 variables espermáticas pos
descongelación y con lo cual se concluye que hay una respuesta diferencial entre
ambos grupos para las características cinemáticas, estructurales y funcionales
pos descongelación, siendo los BC quienes mostraron evidentemente mejor
respuesta. Sumado a esto, se determinó el efecto que tiene la adición de los
antioxidantes Vitamina E y quercetina al diluyente de criopreservación y el efecto
del sistema de empaque en pajillas de 0.5 ml y 0.25 ml sobre las características
espermáticas pos-descongelación. Se concluyó entonces, que aunque no se
encontraron diferencia estadísticas significativas, entre las diferentes
concentraciones de cada antioxidantes, la adición de estos cambia
ostensiblemente las características cinemáticas de los reproductores MC, no
obstante, se encontró que la adición de antioxidantes tanto vitamina E como
quercetina afectaban negativamente las membranas plasmáticas lo cual contrasta
con lo reportado por otros autores donde resaltan los atributos de dichos
antioxidantes en la protección de las mismas (52,124–129).
De igual manera, aunque se observaron ligeros incrementos en algunos

parámetros pos descongelación de los espermatozoides asnales, es importante
explorar otros sistemas de empaque que posiblemente puedan mejorar el
comportamiento pos descongelación de los MC.
Ahora bien, uno de los propósitos que se tiene en el establecimiento de un

sistema de selección es que sea un mecanismo que permita predecir con un buen
nivel de confianza el comportamiento pos-descongelación, por lo cual se realizó la
evaluación de la capacidad antioxidante y peroxidación lipídica del plasma
seminal y de los espermatozoides pre-congelación y no se encontró una relación
estadísticamente significativa entre dichas variables y su comportamiento
después del proceso de criopreservación, pero la interpretación biológica de los
promedios de las variables del estatus oxidativo sugieren que los reprodcutores
BC tienen un mejor estatus oxidativo que los MC lo cual respalda la hipótesis de
que dichas propiedades pueden proteger los espermatozoides de los daños
criopreservado
oxidativos en membranas y en otras organelas como se evidencia en estos

resultados. De otro lado, la variabilidad de los datos puede estar relacionada
también, a la presencia de subgrupos de reproductores dentro de la clasificación
de criotolerancia espermática, lo cual podría ser una alternativa para futuros
estudios, ya que los reproductores asnales no son seleccionados por sus
propiedades de criorresistencia sino por características fenotípicas de importancia
comercial y se hace imprescindible optimizar los protocolos de criopreservación
para los individuos MC
La evaluación del efecto de diferentes componentes proteicos del plasma seminal

es una labor ardua y dispendiosa que conlleva en primera instancia a una
caracterización del mismo, para poder determinar si hay alguna relación entre
componentes proteicos del plasma seminal y la respuesta a la criopreservación.
En este trabajo de investigación se avanzó enormemente en dicha tarea y se
logró relacionar 8 bandas correspondientes a 5 grandes grupos de familias de
proteínas KLK1E2, CRISP3, BSP, HSP-1 y HYOU1 respectivamente (Figura 3-3)
con proteínas del plasma seminal equino y caracterizar el proteoma del plasma
seminal a nivel de la discriminación de manchas (spots) a través de electroforesis
bidimensional y correspondencia entre reproductores como se puede visualizar
en la Figura 3-5 y Tabla 3-1 respectivamente.
4.2 Recomendaciones
1. Utilizar la metodología de componentes principales propuesta en el presente

trabajo de investigación, para hacer una clasificación con base en la criotolerancia
espermática en al menos 5 grupos y evaluar los efectos de otras variantes en el
protocolo de criopreservación como tasas de enfriamiento, la adición de diferentes
crioprotectores y suplementos a los diluyentes de criopreservación.
2. Seguir ahondando en el estudio de la evaluación de las proteínas y diferentes
compuestos en el plasma seminal para evaluar su relación con la criotolerancia
espermática.
3. Se debe seguir desarrollando trabajos de investigación que permitan
optimizar los protocolos de criopreservación de semen asnal y vincular la
participación de una asociación de criaderos, que faciliten las muestras
seminales para desarrollarlos.
4. Desarrollar trabajos de investigación para confrontar los resultados
obtenidos en el laboratorio con pruebas en campo que permitan evaluar
efectivamente los protocolos de criopreservación de semen asnal a través
de variables como las tasa de preñez y nacidos vivos.
Conclusiones y recomendaciones 49
Anexos 51
4.3 Anexo 1: Protocolos de experimentación
4.3.1 COLECTA DE SEMEN ASNAL Y EVALUACIÓN EN CAMPO

(PCR-001)
!
! ! )
Colecta!de!Semen!Asnal!y! PCR@)001)
Evaluacion!en!Campo!
!! Versión:02)
Programa!de!Biología!CES<EIA.!
!
Página)) 1!de!3!
)
COLECTA)DE)SEMEN)ASNAL)Y)EVALUACION)EN)CAMPO)
!
Principio:)!!Descripción!del!!proceso!toma!la!muestra!de!semen!asnal!y!evaluación!
seminal!en!campo.!
Materiales) Reactivos) Equipos)
Papel!Absorbente! Kenny!modificado! Electrodo!
Funda!plástica! Solución!de!vitalidad!(Eosina!–! Vagina!Artificial!

Nigrosina)!
Bolsa!con!filtro! Solución!HOS! Microscopio!de!campo!

claro!
Tubos!de!50!ml! ! Nevera!de!transporte!4ºC!!
y!20ºC!
Tubos!de!15!ml! ! !
Viales!de!1.5!ml! ! !
Pipetas!Pastuer!de! ! !
plástico!
Laminas!porta!objetos! ! !
Láminas!cubre!objetos! ! !
Frascos!de!vidrio!tapa! ! !
azul!
Criovial!3!ml! ! !
!
Elaboró:))Valentina)Vélez)Henao! Revisó:)Andrés)Pareja)López) Aprobó:)Andrés)Pareja)López)
Firma:)) Firma:)) Firma:))
Fecha):)) Fecha):) Fecha):)
Laboratorio Biotecnología en Salud CES-EIA. Carrera 43# 52 sur-99 3053500 ext: 2243
criopreservado
!
! ! )
!! Versión:02)
!
Página)) 2!de!3!
1. Procedimiento:)Toma)de)la)muestra)
1.1. !Calentar! agua! entre! 40ºC! y! 50ºC! aproximadamente! (dependiendo! de! las!
preferencias!del!reproductor)!)
1.2. Llenar! al! máximo! la! vagina! artificial,! con! el! agua! previamente! calentada! de!
manera! que! a! la! hora! de! tomar! la! muestra,! la! vagina! se! encuentre! a! 37ºC!
aproximadamente.!)
1.3. La!vagina!debe!estar!equipada!con!una!funda!plástica!y!una!bolsa!con!filtro!al!
final!para!separar!la!fracción!gel!y!la!fracción!liquida!de!la!muestra!seminal.)
1.4. Se! procede! a! la! limpieza! del! pene! con! agua! y! se! seca! con! una! toalla!
absorbente.)
1.5. Una!vez!el!reproductor!se!encuentre!preparado!para!la!toma!de!la!muestra,!el!
operario! se! acerca! e! introduce! el! pene! en! la! vagina! artificial! sujetándola! con!!
firmeza.)
1.6. Luego!se!retira!la!funda!de!la!vagina!artificial,!y!se!espera!a!que!se!filtre!el!total!
de!la!fracción!liquida!en!la!bolsa!del!extremo.)
1.7. Se! vierte! el! total! de! la! muestra! liquida! a! un! recipiente! volumétrico! y! se!
determina!el!volumen!liquido!total.!)
2. Procedimiento:)Evaluación)de)la)muestra)en)campo)
2.1. La!muestra!pura!es!analizada!y!se!determina!el!porcentaje!de!espermatozoides!
móviles! y! el! porcentaje! de! espermatozoides! normales,! en! un! microscopio! de!
campo!claro.)
2.2. La! muestra! debe! de! cumplir! con! 80%! de! espermatozoides! móviles! y! 80%! de!
espermatozoides!normales!para!continuar!con!su!procesamiento.)

Anexos 53
!
! ! )
!! Versión:02)
!
Página)) 3!de!3!
2.3. Se! diligencia! el! formato! de! registro! de! evaluación! seminal! ! (RGR) –) 01),! en!
donde! quedan! consignados! los! datos! de! las! características! macroscópicas! y!
microscópicas!de!la!muestra.)
2.4. La!prueba!de!!vitalidad!espermática!se!realiza!!por!medio!de!la!exclusión!del!
colorante!vital!Eosina<Nigrosina!con!semen!puro,!!siguiendo!el!protocolo!PCR@)
006.)
2.5. El! test! hipo<osmótico! permite! determinar! la! funcionalidad! de! la! membrana!
plasmática,!siguiendo!el!protocolo!PCR@)003.)
2.6. Para!el!análisis!proteico!se!mezcla!en!un!críovial!20µl!de!inhibidor!de!proteasas!
y!2!ml!de!semen!puro!!(este!inhibidor!se!utiliza!en!proporción!de!10µl!por!cada!
mililitro! de! muestra),! y! se! lleva! directamente! a! una! nevera! refrigerada! hasta!
transportar!al!laboratorio.)
2.7. Luego!de!realizar!el!montaje!de!las!3!pruebas!anteriores!con!semen!puro.!Se!
procede!a!realizar!una!dilución!1:1!(semen:!diluyente!comercial).!Ver)anexo)1)
2.8. Posterior! a! esto! las! muestras! son! llevadas! a! una! nevera! refrigerada! 20ºC! y!
transportados!!hasta!el!!laboratorio!para!continuar!con!su!procesamiento.!)
Anexo)1)
Diluyente)comercial)
Orden) Reactivo) Cantidad)
1) Kenny!modificado! 100!g!
2) Agua!destilada! 100!ml!
Mezclar! los! reactivos! en! platina! térmica! con! agitación! magnética! hasta! que! se! hayan! diluido! por!
completo.!

criopreservado
4.3.2 PRUEBA HIPOOSMÓTICA (HOS) (PCR-003)
! !
! )
Protocolo!!
PCRB)003)
!
Prueba!HOS!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Versión:)002)
Programa!de!Biología!CES7EIA.!
!
Página))1)de)2)
PRUEBA)HIPOOSMÓTICA)(HOS))
Principio:! La! prueba! Hipoosmótica! HOS! permite! determinar! la! funcionalidad! de! la!
membrana! plasmática! mediante! la! capacidad! de! la! membrana! plasmática! de! los!
espermatozoides!de!responder!a!un!cambio!en!la!osmolaridad!del!medio.!
Placas!portaobjetos! Citrato!de!Sodio!!! Micropipetas!20!µl,!y!1000!µl!
Placas!cubreobjetos!22!x!22! Fructosa!! Platina!térmica!
Puntas!de!20!µl,!200!µl!y!1000!
Agua!destilada!!! Microscopio!de!Contraste!de!Fases!
µl!
Viales!de!1.5!ml! ! Platina!térmica!!de!agitación!magnética!!
Magnetos!! ! Balanza!analítica!!
Papel!absorbente! ! !
! ! !
1. Procedimientos:)
1.1. Preparar!la!solución!Hipoosmótica.!(Anexo!1))
1.2. En!un!vial!con!500!μl!de!la!solución!hipoosmótica!se!le!adicionan!60!μl!de!semen.)
1.3. Disponer!10!μl!de!la!solución!anterior,!sobre!una!lámina!porta!objetos!y!cubrir!con!una!
lámina!cubre!objetos.)
1.4. !Bajo! microscopio! de! campo! claro! se! hace! un! conteo! de! 200! espermatozoides! y! se!
determina! aquellos! que! experimentaron! reacción! a! la! solución! hipoosmótica! y!
aquellos!que!no!reaccionaron!(Anexo!2)!

Anexos 55
! !
! )
Protocolo!!
!
PCRB)003)
Prueba!HOS!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Versión:)002)
Programa!de!Biología!CES7EIA.!
!
Página))2)de)2)
Anexo)1))
Solución)HipoB)osmótica:)
Orden) Reactivo) Cantidad)50)ml) Cantidad)100)ml)
1) Citrato!de!Sodio! 0.24!g! 0.48!g!
2) Fructosa! 0.45!g! 0.9!g!
3) Agua!Destilada! 50!ml! 100!ml!
completo.!
Anexo)2)
Morfología)de)espermatozoides)reaccionados:)
A:!No!reaccionados!
B:!Reaccionados!!
A! B!

criopreservado
4.3.3 EVALUACIÓN DE MOVILIDAD (% DE ESPERMATOZOIDES

MOVILES Y CALIDAD DE MOVIMIENTO) (PCR-004)
!
! Protocolo! )
! PCRB)004)
Movilidad!!
(%!de!espermatozoides!móviles!! Versión:)001)
y!!Calidad!de!movimiento)!
!
!Programa!de!Biología!CES>EIA.! Página))
1)de)3)
!
)
EVALUACIÓN)DE)MOVILIDAD))
(%)DE)ESPERMATOZOIDES)MÓVILES))Y))CALIDAD)DE)MOVIMIENTO))
)
Principio:! La! prueba! consiste! en! determinar! la! movilidad! espermática! con! base! en! el!
porcentaje!de!espermatozoides!móviles!y!la!calidad!de!su!movimiento.!
Diluyente! Micropipetas!20!µl,!200!µl!y!
Placas!portaobjetos! Kenny! 1000!µl!
modificado!
Placas!cubreobjetos!22!x!22! PBS! Platina!térmica!
Puntas!de!20!µl,!200!µl!y! Microscopio!de!Contraste!de!
!
1000!µl! Fase!
Platina!de!calentamiento!con!
Viales!de!1.5!ml! !
agitación!magnética!!
Tijeras! ! Microondas!!
Pinzas! ! Termómetro!
Magnetos!! ! Balanza!analítica!!
Papel!absorbente! ! !
Recipiente!plastico!para! !
!
descongelación!!
! ! !
Elaboró:))Valentina)Vélez)Henao! Revisó:)Andrés)Pareja)López)) Aprobó:))

Anexos 57
!
! Protocolo! )
! PCRB)004)
Movilidad!!
!
2)de)3)
!
1. Procedimientos)
1.1. Preparar!el!diluyente!Kenny!Modificado!(Anexo!1))
1.2. Para!evaluación!en!campo!se!debe!proceder!al!paso!3)
2. Descongelación)de)la)muestra)de)semen.)
2.1. Calentar!en!un!recipiente!plastico!500!ml!de!agua!a!37ºC.)
2.2. Sacar!la!pajilla!del!termo,!sumergirla!rápidamente!y!por!completo!en!el!agua!a!37ºC!
durante!20!segundos!como!mínimo!y!máximo!por!1!minuto.)
2.3. Sacar!y!secar!con!papel!absorbente!la!pajilla.)
2.4. Cortar!un!extremo!de!la!pajilla!e!introducirlo!en!el!vial!de!1.5!ml,!luego!cortar!el!otro!
extremo!con!el!propósito!de!vertir!la!muestra!de!semen!en!él.!)
3. Evaluacion)de)la)movilidad.))
3.1. En!un!vial!de!1.5!ml!adicionar!500!µl!del!diluyente!kenny!modificado!y!60!µl!de!semen!
previamente!descongelado.!)
3.2. Disponer!!10!µl!de!la!solución!anterior,!sobre!un!portaobjetos!precalentado!sobre!la!
platina!térmica!a!37!ºC,!cubrir!con!un!cubre!objetos!y!analizar!en!el!microscopio!de!
contraste!de!fases!con!porta!muestras!con!platina!térmica.!)
3.3. Porcentaje)de)Espermatozoides))Móviles)
3.3.1. Se!evaluan!al!menos!5!campos!visuales!en!10!X!y!40!X,!y!se!determina!el!
porcentaje!de!espermatozoides!que!tienen!movimiento!flagelar,!por!promedio!
de!la!observacion!de!dichos!campos.)
3.4. Calidad)del)Movimiento)
3.4.1. El!análisis!se!realiza!para!la!calidad!de!movimiento!de!acuerdo!a!la!escala!de!
Holy!de!1!a!5!(tabla!1):)

criopreservado
!
! Protocolo! )
! PCRB)004)
Movilidad!!
!
3)de)3)
!
Tabla!1.!Escala!de!HOLY!
Calificación) Observación)
1) No!se!mueve)
2) Vibratorio)
3) Vibratorio!Progresivo!,!circular)
4) Progresivo!circular,!rectilíneo)
5) Progresivo!rectilineo)
Anexo)1))
Anexo)1)
Diluyente)comercial)
1) Kenny!modificado! 100!g!
2) Agua!destilada! 100!ml!
completo.!

Anexos 59
4.3.4 VIABILIDAD MEDIANTE EXCULSIÓN DE COLORANTE

VITAL EOSINA-NIGROSINA (PCR-006)
! !
! )
Protocolo!!
!
PCR@)006)
Viabilidad!!Eosina!–!Nigrosina! Versión:)002)
!
!Programa!de!Biología!CES;EIA.!
Página))) 1!de!3!
)
VIABILIDAD)MEDIANTE)EXCULSIÓN)DE)COLORANTE)VITAL))EOSINA@NIGROSINA)
)
Principio:!Determinar!la!viabilidad!espermática!mediante!la!evaluación!de!la!integridad!
de!la!membrana!plasmática!por!medio!de!la!técnica!exclusión!de!colorante!vital,!Eosina!
;!Nigrosina.!
!
)
!Portaobjetos! Eosina!! Micropipetas!20!µl,!10µl!
Cubreobjetos!22!x!22! Nigrosina! Platina!térmica!
Puntas!de!10µl!;!20µl! ! Microscopio!de!campo!claro!
Viales!de!1.5!ml! ! !
Papel!absorbente!! ! !
Guantes!!nitrilo!! ! !
Vidriería!!!! ! !
!
!
1. Preparación)de)la)Muestra!
!
1.1. Tomar!4!µl!de!la!muestra!(semen),!4!µl!!del!colorante!eosina;nigrosina!y!ambas!
se!depositan!sobre!un!portaobjetos.!!!
1.2. Se! mezclan! suavemente! y! se! deja! reposar! por! 1! minuto! sobre! la! platina!
térmica!o!superficie!de!trabajo.!!
1.3. !Realizar!un!extendido!de!la!mezcla!anterior!a!lo!largo!del!portaobjetos!(figura!
1))
Elaboró:))Valentina)Vélez)Henao! Revisó:)Andrés)Pareja)López) Aprobó:))

criopreservado
! !
! )
Protocolo!!
PCR@)006)
!
!
Página))) 2!de!3!
1.4. Hacer!la!evaluación!bajo!microscopio!de!campo!claro!según!criterio!de!la!figura!
2.!!)
2. Extendido:!
B.#Adicionar#4#µl#de#semen#
A.#Adicionar#4#µl#d#EosinaBNigrosina###
C.#Con#la#punta#de#la#micropipeta# D.#Colocar#lamina#porta#objetos#extensora#
#mezclar#ambas#gotas# Y#desplazarla#en#la#dirección#de#la#flecha#
E.#Dejar#que#se#ex-enda#la#gota#
F.#Deslizar#uniformemente#en## G.#Dejar#secar#a#temperatura#ambiente,#rotular##
dirección#de#la#flecha## y#almacenar#y/o#evaluar#
!
Figura!1.!Extendido!para!determinar!la!viabilidad.!
!
Anexos 61
! !
! )
Protocolo!!
!
PCR@)006)
!
Página))) 3!de!3!
3. Criterio)de)evaluación)de)viabilidad)
Se! cuentan! 200! células! y! se! determina! el! porcentaje! de! espermatozoides! que! no!
incorporaron!el!colorante!sobre!el!total!de!espermatozoides!contados.!!
! !
A.!Membrana!plasmática!Integra!(Vivos)! B.!Membrana!plasmática!dañada!(Muertos)!
Figura!2.!Criterio!de!evaluación!de!la!viabilidad!

criopreservado
4.3.5 PROTOCOLO CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN ASNAL

(PCR-007)
! !
! )
Protocolo!!
!
PCRB)007)
Criopreservación!de!Semen! Versión:01)
Asnal!
!
!Programa!de!Biología!CES9EIA.! Página)) 1)de)4)
!
)
PROTOCOLO)CRIOPRESERVACIÓN)DE)SEMEN)ASNAL)
!
Principio:)Congelar!semen!asnal!tiene!como!objetivo!preservar!las!características!espermáticas!
y!genéticas!!de!un!reproductor!asnal!en!particular.!
!Portaobjetos! Yema!de!huevo! Nevera!4!C!!
Cubreobjetos!22!x!22! Glicerol!! Centrifuga!refrigerada!
Puntas!de!10µl!9!200µl!91000µl!9! Diluyente!Kenny!modificado!! Micropipetas!

5000µl!!
Frascos!de!vidrio!1000!ml!! Nitrógeno!Liquido! Autoclave!
Papel!absorbente!! ! Balanza!analítica!
Guantes!!nitrilo!! ! Platina!agitadora!
Tubos!plásticos!50!ml! ! Centrifuga!refrigerada!
Pajillas!0.25!ml! ! !
Termómetro! ! !
Geles!térmicos! ! !
Pipetas!pasteur! ! !
1. Procedimientos)de)laboratorio!!
1.1. !Una! vez! alcanzado! 15°C! se! procede! a! centrifugar! el! eyaculado! a! 660! x! g! durante! 10!
minutos*.!
1.2. !Descartar!sobrenadante!y!homogenizar!el!!botón!con!el!vortex,!unir!todas!los!pellets!
en!un!solo!tubo.!

Anexos 63
! !
! )
Protocolo!!
!
PCRB)007)
Asnal!
!
!
1.3. !Realice! la! primera! dilución! con! el! diluyente! 1! preparado! según! el! anexo! 1! en! una!
proporción!1:1!(semen:diluyente).!
1.4. !Llevar!a!una!concentración!a!200!x!106!spm/ml,!con!el!mismo!diluyente!1.!
1.5. !Realizar! la! segunda! dilución! con! el! diluyente! 2! (Anexo2)! en! una! proporción! 2:1!
(semen:!diluyente!2).!
*Nota:)La)centrifuga)debe)programarse)previamente)a)una)temperatura)de)15°C.)
2. Empaque!
2.1. !Proceda!a!empacar!en!las!pajillas!de!0.25!ml!o!0.5!ml.!con!una!micropipeta!de!1000!μl!
dispuesta!con!una!punta!de!1000!ul!acoplada!a!otra!punta!de!10!μl.)
2.2. !Introduzca!la!punta!de!la!micropipeta!por!el!lado!de!la!pajilla!donde!se!encuentra!el!
tapón!y!asegúrese!de!llenarla!por!completo.)
2.3. !Con! una! punta! de! 10! μl! introdúzcala! en! el! extremo! opuesto! al! tapón! y! retire! una!
pequeña!cantidad!del!contenido!de!la!pajilla.)
2.4. )Introduzca!el!balín!y!presiónelo!suavemente!hasta!que!haya!entrado!por!completo!a!la!
pajilla,!con!mucho!cuidado!de!no!desplazar!el!tapón!de!la!pajilla!en!esta!operación.)
3. Descenso)de)temperatura)
3.1. !Inicie! el! proceso! de! descenso! de! temperatura! en! la! centrifuga! refrigerada! a! 15°C!
durante!30!min.!
3.2. !Una! vez! transcurrido! este! proceso! programe! nuevamente! la! temperatura! de! la!
centrifuga!refrigerada!a!5°C!por!1!hora.!
4. Congelación)
4.1. !Disponga!las!pajillas!en!una!gradilla!previamente!refrigerada,!cuidando!que!no!queden!
sobrepuestas.!
criopreservado
! !
! )
Protocolo!!
PCRB)007)
!
Asnal!
!
!
4.2. !llévelas!a!la!nevera!de!4ºC!y!déjelas!por!3!minutos.!
4.3. !Luego!lleve!la!gradilla!a!una!nevera!de!icopor!con!nitrógeno!líquido!(3!cm),!y!dejarlas!
por!otros!10!minutos!expuestas!a!los!vapores.!
4.4. !Deposite!las!pajillas!directamente!al!nitrógeno!líquido,!procurando!que!la!totalidad!de!
la!pajilla!entre!en!contacto!con!el!nitrógeno!líquido!al!mismo!tiempo.!
4.5. !Organice!las!pajillas!dentro!de!los!tubos!donde!serán!almacenadas!y!asegúrese!que!los!
tubos!estén!bien!marcados!con!el!nombre!del!reproductor!y!la!fecha!en!que!fueron!
congeladas.!
4.6. !Lleve! a! una! canastilla! en! un! termo! de! nitrógeno! líquido! y! almacene! hasta! su!
evaluación.!
5. Descongelación)
5.1. !Calentar!agua!a!37ºC.!
5.2. !Retire!la!pajilla!del!termo!de!almacenamiento.!
5.3. Lleve!la!pajilla!directamente!al!agua!previamente!calentada.!
5.4. !Déjela!sumergida!por!lo!menos!20!segundos.!
5.5. !Deposite! el! contenido! de! la! pajilla! dentro! de! un! vial! y! manténgalo! sobre! la! platina!
térmica!hasta!su!evaluación.!
!
Anexos 65
! !
! )
Protocolo!!
!
PCRB)007)
Asnal!
!
!
Anexo)1)
Diluyente)de)congelación)1)(20)ml)))
1) Kenny!modificado! 20!ml!
2) Yema!de!huevo*! 600!μl!
completo!
*Rompa!el!huevo!y!descarte!toda!la!clara!posible!sin!que!la!yema!se!rompa,!ponga!la!yema!sola!
sobre!una!toalla!de!papel!y!ruédela!suavemente!para!quitar!el!exceso!de!clara.!Cuando!la!yema!
este!seca!!haga!un!orificio!!en!su!membrana!con!una!aguja,!por!el!mismo!introduzca!la!jeringa!y!
extraiga!el!contenido,!cuidando!siempre!de!no!traer!con!la!jeringa!!partes!de!la!membrana!o!de!
clara.!!!
Anexo)2)
Diluyente)de)congelación)2)(10)ml))
1) Diluyente!de!congelación!1! 10!ml!
2) Glicerol! 450!μl!
) Antioxidante!(a!la!concentración!deseada)! 100!μl!

criopreservado
4.3.6 PRUEBA DE FUNCIONALIDAD DE MEMBRANA

MITOCONDRIAL (DIO6) (PCR-008)
! !
! )
Protocolo!!
PCR@)008)
!
Prueba!DIOC6! Versión:002)
!
Página)) 1!de!2!
)
PRUEBA)DE)FUNCIONALIDAD)DE)LA)MEMBRANA)MITOCONDRIAL))
(DIOC6))
!
Principio:!La!prueba!de!funcionalidad!de!la!membrana!mitocondrial!con!DIOC6,!
permite!detectar!el!potencial!de!membrana!mitocondrial!del!espermatozoide.!!
Puntas!!1000µl! Reactivo!DIOC6! Micropipetas!20!µl,!y!1000!µl!
Puntas!de!10µl! PBS! Microscopio!de!Fluorescencia!
Diluyente!Kenny!!
Puntas!de!200µl! Platina!!de!agitación!magnética!
!
Yoduro!de!propidio!(IP;!500!
Cubreobjetos! Balanza!analítica!
μg/ml!en!PBS)!
Portaobjetos! ! Citómetro!
Viales!1.5!ml!! ! Incubadora!
Guantes!Nitrilo! ! Software!FlowJo!
1. Procedimientos:))
1.1. Preparar!solución!Stock!yoduro!de!propidio!(IP)!500!μg/ml!en!PBS)
1.2. Descongelar!pajilla!en!agua!precalentada!a!37ºC.)

Anexos 67
! !
! )
Protocolo!!
PCR@)008)
!
Prueba!DIOC6! Versión:002)
!
Página)) 2!de!2!
1.3. En!1000!µl!de!PBS!agregué!!10µl!!de!la!solución!stock!!yoduro!de!propidio!(IP),!2!µl!!de!
DIOC!6!!y!10!µl!de!la!muestra!seminal.)
1.4. Incubar!por!al!menos!3!minutos.)
1.5. Someter!!la!alícuota!anterior!a!lectura!por!medio!del!citómetro!(10.000!
espermatozoides!aprox).)

criopreservado
4.3.7 PRUEBA ESTRUCTURA DE CROMATINA ESPERMÁTICA

(SCSA-AO) (PCR-009)
! !
! )
Protocolo!!
PCR@)009)
!
Prueba!SCSA2AO! Versión:002)
!Programa!de!Biología!CES2EIA.!
!
Página)) 1!de!2!
)
PRUEBA)ESTRUCTURA)DE)CROMATINA)DE)ESPERMÁTICA))
(SCSA@AO))
!
Principio:!La!prueba!“Estructura!de!cromatina!espermática!!(SCSA))–)Naranja!de!
acridina!(AO)”!permite!establecer!la!integridad!del!DNA!en!espermatozoides.!!
Reactivo!Naranja!
Puntas!!1000µl! Micropipetas!20!µl,!y!1000!µl!
de!Acridina!(AO)!
Puntas!de!200µl! Diluyente!Kenny! Platina!de!agitación!magnética!
Cubreobjetos! ! Balanza!analítica!
Viales!1.5!ml! ! Incubadora!
Guantes!Nitrilo! ! Software!flowJo!
1. Procedimientos)
1.1. Preparar!solución!AO!!Stock!!6*1025!µg/ml!en!!el!buffer!1.!(Anexo)1).!)
1.2. Descongelar!pajilla!en!agua!a!37ºC.)
1.3. Hacer!una!solución!de!desnaturalización!con!1000!µl!de!PBS,!400!µl!de!la!
solución!acido2detergente!(Anexo)2)!y!adicionar!10!µl!de!semen.)
1.4. Luego!teñir!con!!10µl!de!la!solución!stock!AO.)
1.5. Incubar!por!15!minutos.)

Anexos 69
! !
! )
Protocolo!!
PCR@)009)
!
Prueba!SCSA2AO! Versión:002)
!
Página)) 2!de!2!
Anexo)1)
Buffer)1)
1) Agua)Destilada) 100)ml)
2) Na2HPO4)))) 0.126)M)
3) EDTA)(di@sodium))))))) 0.0011)M)
4) NaCl))))) 0.15)M)
completo!y!ajustar!el!pH!a!6!
Anexo)2))
Buffer)2)
1) Agua)Destilada) 100)ml)
2) HCl))) 0.08)M)
3) NaCl) 0.15)M)
4) Triton)X@100)))))) 0.1%)
completo!y!ajustar!el!pH!a!1.2!

criopreservado
4.3.8 EVALUACIÓN DE INTEGRIDAD ACROSOMAL MEDIANTE

COLORACIÓN CON FITC-PNA (PCR-010)
! !
! )
Protocolo!!
PCR@)010)
!
Prueba!FITC3PNA! Versión:002)
!
!
Página)) 1!de!2!
)
EVALUACIÓN)DE)INTEGRIDAD)ACROSOMAL)MEDIANTE)COLORACIÓN)CON)FITC@PNA)
!
Principio:!La!prueba!!FITC3PNA!!permite!establecer!la!integridad!acrosomal!del!
espermatozoide.!!
Puntas!!1000µl! Reactivo!FITC3PNA!! Micropipetas!20!µl,!y!1000!µl!
Puntas!de!200µl! Diluyente!Kenny!! Platina!!de!agitación!magnética!
!Yoduro!de!
Cubreobjetos! propidio!(IP,!500! Balanza!analítica!
μg/ml!en!PBS)!
Viales!1.5!ml!! ! Incubadora!
Guantes!Nitrilo! ! Software!FlowJo!
1. Procedimientos:))
1.1. Preparar!solución!stock!FITC3PNA!100!µg/ml!en!PBS.)
1.2. Preparar!solución!stock!yoduro!de!propidio!(IP)!500!μg/ml!en!PBS.)
1.3. Descongelar!pajilla!en!agua!precalentada!a!37ºC.)
1.4. En!1000!µl!de!PBS!agregué!!20!µl!!de!la!solución!stock!FITC3PNA,!4!µl!!de!la!
solución!stock!IP!y!10!µl!de!la!muestra!seminal.)
Elaboró:))Valentina)Vélez)Henao! Revisó:)Andrés)Pareja)López)) Aprobó:)Andrés)Pareja)López)

Anexos 71
! !
! )
Protocolo!!
PCR@)010)
!
Prueba!FITC3PNA! Versión:002)
!
!
Página)) 2!de!2!
1.5. Incubar!por!3!minutos.)
Elaboró:))Valentina)Vélez)Henao! Revisó:)Andrés)Pareja)López)) Aprobó:)Andrés)Pareja)López)

criopreservado
4.3.9 ELECTROFORESIS 2D-PAGE DE PLASMA SEMINAL ASNAR

(PCR-011)
!
! )
! Protocolo!!
PCRB)011)
!
Electroforesis!2D/PAGE!de! Versión:01)
Plasma!Seminal!Asnar!
!
Programa!de!Biología!CES/EIA! Página) 1)de)13)
!
!
ELECTROFORESIS)2DBPAGE)DE)PLASMA)SEMINAL)ASNAR)
!
Principio:) ! Hacer! una! separación! de! proteínas! de! una! mezcla! de! compleja! (plasma!
seminal!de!asnos)!de!éstas,!basada!en!el!punto!isoeléctrico!(primera!dimensión)!y!su!
peso!molecular!(segunda!dimensión).!
MATERIALES) REACTIVOS) EQUIPOS)
Crioviales!de!3!ml! Inhibidor!de!proteasa! Nevera!de!transporte!a!4ºC!!
Acetona!(grado!
Pipetas!pasteur!de!plástico!! Centrifuga!refrigerada!
reactivo)!
Micropipetas!de!10!µl!/100!µl,!20!µl!–!
Puntas!de!10µl!/!200µl!/!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Urea/tiurea! 200!µl!y!100!µl!–!1000!µl!y!1000!µl!!–!
1000µl!/!5000µl!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
5000!µl!
Frascos!de!vidrio!1000!ml!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
IPG/Buffer! Nevera!/20ºC!
Tubos!de!ensayo!grandes!o!
Alcohol!70%! Purificador!de!Agua!(Mili!–!Q)!
probetas!de!100!ml!
Papel!absorbente!! DTT!(ditiotreitol)! Liofilizador!
Platina!térmica!con!agitación!
Guantes!!nitrilo!! CHAPS!
magnética!
Tubos!plásticos!50!ml! AZUL!DE!BROMOFEOL! Centrifuga!refrigerada!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
AMBERLITE!! Espectofotómetro!o!Nanodrop!
Kit!de!cuantificación!de!proteínas!
Tiras!de!18!cm!de!
Termómetro! Balanza!analítica!
focalización!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Aceite!mineral! Bandejas!de!hidratación!
Geles!térmicos!
Electrode!wicks! yodoacetamida! Vortex!
Erlenmeyer!diferentes!volúmenes! SDS! Equipo!de!focalización!
Beackers!diferentes!volúmenes! Tris/HCl!pH!8.8! Cámara!de!electroforesis!Vertical!

Anexos 73
!
! )
! Protocolo!!
PCRB)011)
!
!
!
MATERIALES) REACTIVOS) EQUIPOS)
Probetas!diferentes!volúmenes! Glicerol! Fuente!de!Poder!
! Urea! !
! Acrilamida! !
Bis!(N,N’/
! !
metilenbisacrilamida)!
! Amonio!Persulfato!(APS)! !
! TEMED! !
! Butanol! !
! Agarosa!(NA!o!M)! !
! Etanol!(30!%)! !
! Ácido!Fosfórico! !
! Sulfato!de!Amonio! !
! Metanol!! !
! Ácido!Acético! !
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
1. Toma)de)la)Muestras)de)Proteínas)del)Plasma)Seminal)
1.1. Una! vez! se! ha! tomado! la! muestra! seminal! de! acuerdo! al! protocolo! PCR/001!
(Toma! de! muestras! seminales)! se! toma! una! muestra! de! 2! ml! de! semen! y! se!
adiciona!con!20!μl!de!inhibidor!de!proteasas!(10!μl!por!cada!ml!de!muestra),!se!
agita!suavemente,!se!almacena!en!refrigeración!(4ºC)!!y!transportadas!hasta!el!
laboratorio!de!procesamiento!de!la!muestra.!!
1.2. La! muestra! seminal! con! el! inhibidor! de! proteasa! es! centrifugada! a! 800! X!
durante!15!min!a!4ºC.!

criopreservado
!
! )
! Protocolo!!
!
PCRB)011)
!
!
1.3. Separar!el!plasma!seminal!(PS)!de!las!células!espermáticas,!(sobrenadante!del!
pellet)!
1.4. Almacenar!el!pellet!correspondiente!a!las!células!espermáticas!a!/20ºC,!!
1.5. Centrifugar!el!plasma!seminal!a!5000!X!durante!1!hora!a!4ºC.!!
1.6. Separar! el! sobrenadante! y! almacenarlo! a! /20ºC! hasta! liofilización! o!

procesamiento.!!
Nota:!se!recomienda!hacer!liofilización!de!la!muestra!para!una!mejor!conservación.!!
2. Extracción)de)Proteínas)
Como!el!plasma!seminal!ya!es!una!mezcla!compleja!de!proteínas!no!requieren!de!un!
procedimiento!de!extracción!de!proteínas!que!se!utiliza!generalmente!cuando!éstas!se!
encuentran!inmersas!en!membranas!plasmáticas!o!en!compartimentos!intracelulares.)
3. Cuantificación)de)proteínas)
Si! la! muestra! de! PS! ha! sido! liofilizada,! se! debe! reconstituir! en! agua! Mili/Q! hasta!
alcanzar!el!volumen!inicial!de!la!muestra!antes!de!liofilizar.!De!lo!contrario,!se!puede!
dar!inicio!a!la!cuantificación!de!las!proteínas!mediante!el!método!Bradford.!
4. Precipitación)de)proteínas:)!
Después!de!la!cuantificación!de!las!proteínas!algunas!de!las!muestras!pueden!requerir!
un!volumen!muy!alto!para!alcanzar!una!cantidad!de!proteínas!de!400!μg!y!poder!ser!
utilizada! para! hidratar! las! tiras! en! el! procedimiento! de! iso! electro! enforque! (IEF.! por!
sus!siglas!e!ingles).!El!procedimiento!de!precipitación!ayuda!a!concentrar!las!muestras!
y!a!limpiarla!de!algunos!iones!que!pueden!interferir!en!la!evaluación!final.!!
4.1. Se! toma! el! volumen! de! la! muestra! de! PS! suficiente! para! alcanzar! 400! μg! de!
proteína.!!
Anexos 75
!
! )
! Protocolo!!
PCRB)011)
!
!
!
4.2. !Se! diluye! la! muestra! de! PS! en! un! volumen! igual! de! acetona! pura! y! se! deja!
incubar!por!1!hora!a!/20ºC,!luego!se!procede!a!centrifugar!la!muestra!a!10.000!
X!por!2!horas!a!4ºC.!!
4.3. Se!descarta!el!sobrenadante!y!se!deja!durante!la!noche!a!4ºC!con!tapa!abierta!
hasta! que! se! evapore! los! remanentes! de! acetona! (15! horas!
aproximadamente).!!!
5. Hidratación)de)las)tiras)de)IEF)
5.1. Se!prepara!una!solución!de!hidratación!de!acuerdo!a!la!tabla!1.!
Tabla!1.!Cantidades!reactivos!para!la!preparación!de!la!solución!de!hidratación.!!
Orden)
de) Reactivo) Concentración) Cantidad) Cantidad) Cantidad)
adición)
1) Urea/Tiourea!*! 9!M! 500!μl! 1000!μl! 1500!μl!
2) IPG!Buffer! 0.5!%! 5!μl! 10!μl! 15!μl!
3) DTT!(ditiotreitol)! 65!mM! 5!mg! 10!mg! 15!mg!
4) CHAPS! 0.5!%! 5!mg! 10!mg! 15!mg!
5) Azul!de!Bromofenol!! Trazas! Trazas! Trazas! Trazas!
*!Para!20!ml!de!urea/tioúrea!!9M!completar!con!agua!Mili/Q!(incubar!con!amberlite!en!
agitación!en!frio!durante!1!hora)!filtrar!con!miliporo!de!0.22!μm!y!almacenar!a!/20ºC.!
5.2. !Se! mezclan! los! reactivos! de! la! tabla! 1! de! acuerdo! al! orden! propuesto! y! se!
llevan!a!vortex!durante!1!min.!!
5.3. Se! adiciona! 340! μl! de! la! solución! de! hidratación,! por! muestra! en! los! viales!
donde!se!hizo!la!precipitación!de!proteínas!y!se!mezcla!vigorosamente.!!
5.4. Se! vierte! homogéneamente! esta! mezcla! sobre! las! cubetas! de! hidratación,!
previamente! niveladas! sobre! la! superficie! donde! se! llevará! a! cabo! el!
procedimiento!de!hidratación.!!
criopreservado
!
! )
! Protocolo!!
!
PCRB)011)
!
!
5.5. Se! procede! a! la! descongelación! de! una! tira! de! 18! cm! y! se! disponen! sobre! la!
muestra!de!manera!tal!que!el!gel!de!las!tiras!quede!en!contacto!con!la!mezcla!
de!las!proteínas!y!solución!de!hidratación.!
5.6. Se!dejan!en!hidratación!durante!12!/!16!horas!!
6. Focalización.)
Después! de! la! hidratación! de! las! tiras! se! debe! llevar! a! focalización! bajo! el! siguiente!
protocolo.!!
6.1. Se! disponen! las! tiras! hidratadas! sobre! las! bandejas! de! focalización! con! el! gel!
hacia!arriba!
6.2. !Se!ponen!los!wicks!en!los!extremos!de!las!tiras,!donde!irán!los!electrodos!de!
focalización.!
6.3. Se! llenan! de! aceite! mineral! los! canales! de! focalización! donde! van! las! tiras!
hidratadas.!
6.4. Se!ponen!los!electrodos!de!focalización!y!se!corre!bajo!el!protocolo!de!la!tabla!
2.!!
Tabla!2.!Programación!de!focalización!para!plasma!seminal!de!asnos!
Paso% Magnitud% Unidad%Voltios% Cantidad% Unidad%
1) Paso! 100! 03:00! Horas!
2) Paso! 250! 01:00! Horas!
3) Paso! 500! 01:00! Horas!
4) Paso! 1000! 01:00! Horas!
5) Gradiente! 6000! 04:00! Horas!
6) Paso! 6000! 18000! Vh!

Anexos 77
!
! )
! Protocolo!!
PCRB)011)
!
!
!
Paso% Magnitud% Unidad%Voltios% Cantidad% Unidad%
7) Paso! 100! 12:00! Paso!hold!
Nota:!es!muy!importante!estar!revisando!que!las!tiras!no!se!sequen!ni!que!este!ebullendo!en!algún!
punto!específico.!!
7. Equilibrio)de)las)tiras)de)focalización.)
Después!de!la!focalización!se!deben!llevar!las!tiras!a!un!proceso!de!equilibrio,!donde!
las!proteínas!forman!un!complejo!con!el!SDS,!reducidas!con!el!DTT!y!luego!alquiladas!
con! yodoacetamida! (anexo! 1,! 2! y! 3).! Esto! permite! que! se! forme! un! complejo! SDS/
Proteínas! consistente! con! la! carga! y! la! masa.! La! migración! a! través! del! gel! de!
poliacrilamida! con! una! movilidad! relacionada! logarítmicamente! a! la! masa! de! la!
proteína!lo!cual!permitirá!en!resumen!que!se!haga!una!separación!de!las!proteínas!de!
acuerdo!a!su!masa.!!
7.1. Se! toman! las! tiras! y! se! llevan! en! un! tubo! de! ensayo! o! probeta! lo!
suficientemente! grande! para! albergar! la! tira! de! 18! cm! con! la! solución! de!
equilibrio!1!(anexo!2)!
7.2. Se!dejan!en!agitación!en!la!solución!de!equilibrio!1!durante!20!min.!!
7.3. Luego!se!descarta!esta!solución!de!equilibrio!1!y!se!adiciona!una!solución!de!
equilibrio!2!(anexo!3).!!
7.4. Se!dejan!en!agitación!en!la!solución!de!equilibrio!2!durante!20!min.!!
8. Electroforesis)en)gel)de)poliacrilamida!
8.1. Se!deben!limpiar!muy!bien!los!vidrios!con!alcohol!al!70!%!y!hacer!el!molde!del!
gel! de! poliacrilamida! de! acuerdo! a! las! indicaciones! de! la! cámara! de!
electroforesis)
8.2. Se!debe!realizar!el!gel!de!poliacrilamida!de!acuerdo!a!los!anexos!4,!5!y!6)
8.3. )Rápidamente!se!debe!verter!sobre!el!molde!del!gel!de!electroforesis.!
criopreservado
!
! )
! Protocolo!!
!
PCRB)011)
!
!
8.4. Adicionar!agua/butanol!(anexo!7)!sobre!el!gel!y!esperar!hasta!que!termine!la!
polimerización!del!mismo.!
8.5. Una! vez! polimerizado! se! procede! a! poner! la! tira! después! del! equilibrio! en! la!
parte!superior!del!gel.!!
8.6. Se!adiciona!la!solución!de!sellado!con!agarosa!(Anexo!8)!en!la!parte!superior!
del!gel!para!generar!la!transición!al!gel!de!poliacrilamida!(casete)!
8.7. Se! lleva! el! casete! a! la! cámara! de! electroforesis! vertical! y! se! ajusta!
correctamente!a!la!misma.!
8.8. Adicionar!el!buffer!de!electroforesis!a!la!cámara!de!electroforesis!hasta!el!tope!
de!la!cámara.!!
8.9. Se!corre!la!electroforesis!vertical!a!20!V!y!20!mA/gel,!!durante!1!hora.!
8.10. Luego!se!corre!la!electroforesis!a!40!mA/gel.!Hasta!que!la!guía!(raya!de!
bromofenol)!salga!del!gel.!
8.11. Se!desarma!el!casete!y!se!lleva!el!gel!a!una!cubeta!para!el!procedimiento!
de!tinción!del!gel.!
9. Tinción)del)Gel)de)Poliacrilamida)
9.1. Con! extremo! cuidado! se! lleva! el! gel! a! una! solución! fijadora! (Anexo! 9).! En! la!
cual! deben! permanecer! como! mínimo! 2! horas! (No! obstante! se! recomienda!
dejarlo!durante!toda!la!noche!en!esta!solución)!en!agitación!leve.!!
9.2. Se! descarta! la! solución! fijadora! y! se! adiciona! solución! de! lavado! (Anexo! 10).!
Hasta!cubrir!la!totalidad!de!los!geles!se!deja!en!agitación!leve!por!20!min!(El!
procedimiento!se!repite!al!menos!3!veces).!
9.3. Luego! se! descarta! la! solución! de! lavado! y! se! lleva! a! una! solución! de!
protonación!de!proteínas!(Anexo!11).!
9.4. Dejar! en! esta! solución! durante! 20! min! y! luego! adicionar! 2! %! del! colorante!
(comasie!blue!G)!por!al!menos!48!horas.!
!
Anexos 79
!
! )
! Protocolo!!
PCRB)011)
!
!
!
10. Decoloración)del)Gel)
Una!vez!el!gel!ha!culminado!el!proceso!de!tinción!se!procede!a!la!decoloración!del!gel,!
con!el!propósito!de!obtener!una!máxima!resolución!y!descartar!exceso!de!colorante!en!
áreas!que!no!contienen!proteínas.!!
10.1. Se!descarta!la!solución!de!protonación!mas!el!colorante!y!se!hacen!tres!
lavados!con!agua!destilada!(20!min,!cada!lavado)!
10.2. Se! adiciona! la! solución! decolorante! 1! (Anexo! 12)! la! cual! se! deja! en!
agitación!leve!durante!30!min.!
10.3. Finalmente!se!lleva!a!una!solución!de!decolorante!2!(Anexo!13)!la!cual!
se!deja!en!agitación!leve!durante!30!min.!
11. Análisis)del)proteoma)mediante)PDBQuest)
11.1. Se! escanean! los! geles! en! un! escáner! y! se! guardan! las! imágenes! en!
formato!.TIF!
11.2. Luego!se!procede!a!un!procesamiento!de!las!imágenes,!establecido!por!
el! software! (tutorial.! http://youtu.be/QOTS209DAgk).! Con! el! propósito! de!
eliminar!pequeños!artefactos!que!no!correspondan!a!proteínas,!ni!a!errores!en!
el!proceso!2D/PAGE.!
!
criopreservado
!
! )
! Protocolo!!
!
PCRB)011)
!
!
Anexo)1)
Solución)de)equilibrio)Stock)
Orden)) Reactivo) Cantidad))
1) TrisBHCl)pH)8.8) 6.7)ml)
2) Glicerol)) 69)ml)
3) SDS) 4)g)
4) Agua)destilada)) 200)ml)
5) Urea) 72.07)g)
6) Azul)de)Bromofenol) Trazas))
Anexo)2)
Solución)de)equilibrio)1.))
1) Solución)de)equilibrio)Stock) 20)ml)
2) DTT) 0.20)g)
Anexo)3)
Solución)de)equilibrio)2)
1) Solución)de)equilibrio)stock) 20)ml)
2) iodoacetamida) 0.5)g)

Anexos 81
!
! )
! Protocolo!!
PCRB)011)
!
!
!
Anexo)4)
Solución)A)
orden) Reactivo) Concentración)final) Cantidad)
1) Agua)destilada) B) 1000)ml)
2) Acrilamida)(MW)71.08)*) 30)%) 300)g)
3) Bis)(N,N’Bmetilenbisacrilamida))*)(MW) 0.8)%) 8)g)

154,17))
*!Debe!pesar!estos!reactivos!con!extremo!cuidado!ya!que!son!tóxicos!por!inhalación.!!
Anexo)5)
Solución)B)
orden) Reactivo) Concentración) Cantidad) Cantidad)

final)
1) Tris)(MW)121.14)) 1.5)M) 545)g) 90.83)g)
2) 6)M)HCl)a)un)pH)8.8) B) 150)ml)aprox) 25)ml)aprox)
3) Agua)destilada) B) 3000)ml) 500)ml)
Nota:)ajuste)el)pH)a)8.8)y)almacene)a)4ºC))
Anexo)6)
Gel)de)poliacrilamida))
1) Solución)A)(acrilamida)–)bis)) 250)ml)) 375)ml))
2) Solución)B)(Tris)–)Cl))) 150)ml)) 225)ml))
3) Agua)MiliBQ) 187)ml) 280.5)ml)
4) SDS)10%) 6)ml) 9)ml)

criopreservado
!
! )
! Protocolo!!
!
PCRB)011)
!
!
5) APS)10%) 6)ml)) 9)ml))
6) TEMED)10%) 0.83)ml)) 1.25)ml))
Anexo)7))
Agua)saturada)con)butanol))
Orden) Reactivo) Cantidad) )
1) Butanol)) 50)ml) )
2) Agua)destilada)) 10)ml)) )
Nota:)mezclar)en)una)botella)y)almacene)a)temperatura)ambiente.))
Anexo)8))
Solución)de)sellado)con)agarosa)
Orden) Reactivo) Concentración)final) Cantidad)
1) 1X)SDS)Buffer)de)electroforesis)) B) 25)ml)
2) Agarosa)(NA)o)M)) B) 125)mg)
3) Azul)de)Bromofenol) Trazas) Trazas)
Nota:) combine) todos) los) ingredientes) en) un) Erlenmeyer) de) 250) ml) y) agite) en) agitador) magnético.)
Caliente)en)microondas)hasta)que)la)agarosa)este)completamente)fusionada)(diluida).)No)permita)que)
la)solución)ebulla.)Permita)que)la)agarosa)se)enfríe)antes)de)usar.)No)ajustar)el)pH.)

Anexos 83
!
! )
! Protocolo!!
PCRB)011)
!
!
!
Anexo)9)
Solución)Fijadora)
1) Etanol)(30)%)) B) 189,47)ml)
2) Ácido)Fosfórico) B) 14)ml)
3) Agua)destilada) B) 600)ml)
Anexo)10))
Solución)de)lavado))
1) Ácido)fosfórico) 2)%) 42)ml)
2) Agua)destilada)) B) 1800)ml)
Anexo)11)
Solución)de)protonación)
Orden) Reactivo) Concentración)final) Cantidad) Cantidad)
1) Sulfato)de)Amonio) B) 90))g) 150))g)
2) Etanol)) B) 108)ml) 180)ml)
3) Ácido)Fosfórico) B) 12)ml) 20)ml)
4) Agua)Destilada) B) 600)ml) 1000)ml)

criopreservado
!
! )
! Protocolo!!
!
PCRB)011)
!
!
Anexo)12)
Solución)decolorante)1.)
1) Metanol)) B) 200)ml) 150))g)
2) Ácido)Acético) B) 35)ml) 180)ml)
Anexo)13)
Solución)decolorante)2)
1) Metanol)) B) 200)ml) 150))g)
2) Ácido)Acético) B) 108)ml) 180)ml)

Anexos 85
4.3.10 EVALUACIÓN DE MOVILIDAD ESPERMÁTICA POR

CASA (PCR-012)
! !
! )
Protocolo!!
PCR@)012)
!
Evaluación!de!Movilidad! Versión:)001)
espermática!por!CASA!!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!!Programa!de!Biología!CES<EIA.! Página)1)de)2)
!
Evaluación)de)Movilidad)Espermática)por)CASA))
!
Principio:)Evaluación!seminal!por!medio!de!software!computarizado!CASA!(Computer!Assisted!
Semen!Analysis)!
Materiales! Reactivos! Cantidad! Equipos!

Reactivo!
Cámaras!Leja!! Diluyente!!!! ! Micropipetas!10!µl!
Placas!cubreobjetos!22!x!22! Agua!destilada!!! 100ml! Platina!térmica!
Puntas!de!10!µl! ! ! Computador!!
Viales!de!1.5!ml! ! ! Software!CASA!
Magnetos!! ! ! !
Papel!absorbente! ! ! !
Procedimientos:)
1. ! Ingresar al software con el icono del escritorio “HTR”
2. ! Ingresar usuario y contraseña
3. ! Seleccionar el botón “INFO”, seguidamente por medio del botón “NEXT”

busco la carpeta perteneciente a la especie a evaluar.
4. ! Ingresar los datos pertenecientes al espécimen a evaluar (ID y Número),

seguidamente seleccione el botón “ADD”
5. ! En los espacios indicados en “NOTES” se agregan las características de

la evaluación (tratamiento).

4.4 Anexo 2: CONGRESO CRYO 2015.
Se participó en el congreso internacional CRYO 2015, the Society for

Cryobiology’s anual conference. Ostrava, Czech Republic, July 26-29, 2015. con
el trabajo titulado: “Efecto de los antioxidantes y el sistema empaque sobre las
características estructurales y funcionales de espermatozoides asnales
criopreservados”, en modalidad de poster, el cual además se vincularon
elementos multimedia ligados con códigos QR (quick response) donde se ligaban
videos explicativos de cada una de las fases del protocolo experimental y de los
resultados de investigación.
Como productos quedo un reumen publucado en la prestigiosa revista
CRIOBIOLOGY con indice de impacto: 1.920 · Cryobiology, Volume 71, Issue 3,
December 2015, Page 566
88 Criotolerancia espermática y efecto de los antioxidantes y el sistema de empaque
sobre las características espermáticas de semen asnal criopreservado
Anexos 89
90 Criotolerancia espermática y efecto de los antioxidantes y el sistema de empaque
sobre las características espermáticas de semen asnal criopreservado
566 Abstracts / Cryobiology 71 (2015) 537e573
Elliott holds a Canada Research Chair in Thermodynamics. It is well known that non-cryogenic factors play a significant role affecting
Conflict of Interests: N/A the cryopreservation success of plant germplasm. One of the most
important factors affecting plant growth and development is light. Besides
P30. intensity, the composition of light spectra provides information for plants
EFFECT OF ANTIOXIDANTS AND PACKAGING SYSTEM ON STRUCTURAL that affect growth and morphogenesis. Therefore, we studied the effect of
FEATURES AND FUNCTIONAL DONKEY CRYOPRESERVED SPERM different light qualities on the cryopreservation success of five potato
cultivars. The light qualities studied, both pre and post-cryopreservation,
L.A. Pareja 1, R.O. Camargo 2. 1 Universidad CES, Colombia; 2
Universidad were: cool white fluorescent light (CW), warm white light (HQI), blue LEDs
Nacional de Colombia, Bogota, Colombia (B), red LEDs (R), red with 10% of blue (RB), RBF e red with 10% of blue
E-mail address: apareja@ces.edu.co including 20 % of far-red LEDs and white LEDs. The results show that both
pre and post-cryopreservation light spectra have a significant effect on
In Colombia, donkeys are used for their ability to drive and load, also in both survival and regeneration of potato shoot tips. Therefore, the modi-
breeding to obtain mules, which are employed for their work on farms and fication of light spectral quality may be a promising tool for increasing the
for recreational riding and exhibition. However, the small population of survival and regeneration into new plants after cryopreservation. The
certified breeders in our country has caused them to be in danger of present study emphasizes the importance of non-cryogenic factors,
inbreeding. Therefore, the objective of this research was to establish an especially the light spectral quality on cryopreservation success of plant
effective cryopreservation protocol as a strategy of conservation. While germplasm.
evaluating the effects of antioxidants quercetin and vitamin E in using the Funding: N/A
packing system of straws of 0.25ml and 0.5ml on the structural and Conflict of Interests: N/A
functional characteristics of post-thaw donkey sperm. It was found that
the system of packaging in straws of 0.25ml allows better results on the P33.
mobility, structural and functional donkey sperm traits, compared with CRYOPRESERVATION OF MESENCHYMAL STROMAL CELLS WITHIN
0.5ml straws and adding 0.25mm antioxidant quercetin or vitamin E SCAFFOLDS DERIVED FROM SKELETONS OF MARINE SPONGE
200um enhances this effect. On the other hand, it was found that there is a IANTHELLA BASTA
strong effect of the breeder on the sperm characteristics post-thaw, which
is independent of the cryopreservation protocol and such variability to V.V. Mutsenko, O.Yu. Rogulska, D.N. Tarusin, Yu.A. Petrenko, H.
cryotolerance is not related to the antioxidant capacity of seminal plasma, Ehrlih, A.Yu. Petrenko. Institute for Problems of Cryobiology and
explained by TEAC technique or the lipid peroxidation of plasma Cryomedicine of National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
membranes. E-mail address: v.v.muzenko@gmail.com
Funding: Cenired.
Conflict of Interests: N/A State-of-the-art in tissue engineering where mesenchymal stromal cells
are the most in demand cell component make actual cryopreservation
P31. of ready-to-use tissue-like scaffolds. In this approach, the time from the
MEMBRANE PERMEABILISATION FOR THE CRYOPRESERVATION OF clinical request to providing a necessary tissue-engineered implant is
MAMMALIAN CELLS significantly reduced. In the present work, chitin scaffolds were ob-
tained from skeletons of marine sponge Ianthella Basta and their
S.A. Mercado., N.K.H. Slater. Department of Chemical Engineering and biocompatibility with human mesenchymal stromal cells was shown for
Biotechnology, University of Cambridge, Cambridge, United Kingdom the first time. Cryopreservation of the cell-seeded scaffolds with
E-mail address: sm956@cam.ac.uk application of conventional protocol (slow cooling/rapid thawing, 10%
Me2SO and 20% FBS) demonstrated high cryosensitivity of the adherent
Cryopreservation techniques are essential for long-term maintenance of cells. Some cryobiological approaches such as ice seeding, sucrose
cell properties in medical applications, including fertility treatments and pretreatment, etc, were used to improve the efficiency of cryopreser-
cancer therapies. Currently, the state of the art in cryopreservation relies vation protocol. The combination of these approaches enabled to us to
on the usage of dimethyl sulfoxide and other toxic cryoprotectants that enhance viability rate and maintain multilineage differentiation po-
exhibit several disadvantages such as high toxicity. However, studies tential of MSCs after growth and cryopreservation within skeletons of
have also shown the use of disaccharides along with amphipathic bio- marine sponge Ianthella Basta.
polymers in improving the survival of cryopreserved mammalian cells in Funding: N/A
a non-toxic manner. In this work, a mechanism targeting the delivery of Conflict of Interests: N/A
trehalose into cells for improved cryopreservation has been studied. This
method involves the use of amphipathic pH-responsive biopolymer P34.
(PP50) that permeates plasma membranes. Additionally, the functional THE APPLICATION OF PERFUSION BIOREACTORS FOR THE
and structural effects of this polymer on an osteosarcoma cell line were DEVELOPMENT AND CRYOPRESERVATION OF MESENCHYMAL
analyzed. PP-50 was shown to mimic the membrane permeabilizing STROMAL CELLS (MSCS) BASED TISSUE-ENGINEERED CONSTRUCTS
activity of viral and bacterial peptides, improving the cryopreservation of
mammalian cells when transporting sugar across cell membranes. Y. Petrenko 1, D. Wendt 2, I.Martin 2. 1 Dept. of Biochemistry, Institute for
Finally, PP-50 showed no negative cellular effects on cell viability, Problems of Cryobiology and Cryomedicine NAS Ukraine, Kharkov, Ukraine;
2
membrane integrity and cell morphology, which is a critical character- Tissue Engineering Laboratory, Dept. of Biomedicine, University Hospital
istic of polymers towards use in cryopreservation and biomedical Basel, Basel, Switzerland
applications. E-mail address: yu.a.petrenko@gmail.com
Funding: N/A
Conflict of Interests: N/A The aim of the study was to assess the promise of bioreactor appli-
cation for the cryopreservation of MSCs within 3-D collagen-based
P32. scaffolds. Human adipose tissue MSCs seeded into 3-D porous
THE EFFECT OF LIGHT SPECTRAL QUALITY ON CRYOPRESERVATION collagen-based scaffolds (Optimaix, Matricel) were cryopreserved
SUCCESS OF POTATO (SOLANUM TUBEROSUM L.) SHOOT TIPS following 1-7 days of expansion in either conventional static condi-
tions or oscillating perfusion bioreactors. Cryopreservation was pre-
J. Edesi 1, 2, K. Kotkas 2, A.M. Pirttila
€ 1, H. Ha
€ggman 1. 1 University of Oulu, pared with 10% Me2SO and 20% FBS using the cooling rate 1! /min.
Genetic and Physiology, Oulu, Finland; 2 Estonian Crop Research Institute Viability, cell number and recovery rate of cells were assessed on day
(ECRI), Department of Plant Biotechnology EVIKA, Saku, Harjumaa, Estonia 0, day 1 and day 4 post-thaw. The application of perfusion bioreactors
E-mail address: Jaanika.Edesi@oulu.fi for 3-D cultures of MSCs prior to cryopreservation resulted in 40%
Anexos 91
4.5 Anexo 3: Nota de Prensa
Periódico – N.º 205 – Universidad Nacional de Colombia NOVIEMBRE 2016 | 15
Banco de esperma
Ciencia
salvaría al burro de su extinción
& Tecnología
KILLY ALEJANDRA GUTIÉRREZ GUZMÁN, Unimedios Medellín
Por medio de novedosas técnicas

de conservación que utilizan
temperaturas muy bajas, es posible
preservar durante varios años
la esperma de esta especie sin
alterar sus características genéticas.
Platero es pequeño, peludo, suave; tan blando por fuera,

que se diría todo de algodón, que no lleva huesos.
Sólo los espejos de azabache de sus ojos son duros
cual dos escarabajos de cristal negros.
Lo dejo suelto, y se va al prado, y acaricia tibiamente
con su hocico, rozándolas apenas, las florecillas rosas,
celestes y gualdas... Lo llamo dulcemente:
¿Platero?, y viene a mí con un trotecillo alegre
que parece que se ríe, en no sé qué cascabeleo ideal.
Juan Ramón Jiménez, 1914
QUIZÁS EL PREMIO NOBEL DE LITERATURA 1956

nunca imaginó que seis décadas después de recibir
FOTO: archivo particular
ese reconocimiento por su novela Platero y yo, el
burro se convertiría en una especie amenazada de EL ESPERMA DE LOS BURROS fue analizado con modernas técnicas de conservación.
manera crítica.
Según la organización benéfica británica
The Donkey Sanctuary, en el mundo quedan al- utilidad; tiene como objetivo inhibir o reducir la actividad usan para revolver café), con entre 0,5 y 0,25 ml. “Al ser más
rededor de 50 millones de ejemplares del Equus metabólica del semen garantizando su vitalidad y función pequeña, no solo se congela mejor, sino que su manipulación
africanus, especie originaria de África, domesticada a lo largo del tiempo y conservándolo indefinidamente. De es más fácil”, destaca la veterinaria Juliana Ramírez. Otros
por los egipcios y que jugó un importante papel en esta manera, este método se constituye en una herramienta sistemas tradicionales son los pellets (con forma de pastillas)
el desarrollo de América Latina. importante que mejora las tecnologías reproductivas en el y las maxipajuelas y criobiales (similares a tubos de ensayo
Sin embargo, la amenaza de su extinción es uno campo de la ciencia animal. pequeños).
de los efectos impensados de la tecnificación, parti- El profesor Ómar Camargo, del Departamento de Producción Otra innovación está relacionada con la capacidad de
cularmente agrícola. De ser usados como bestias de Animal, y el estudiante del doctorado en Biotecnología, Andrés tolerancia a las bajas temperaturas de los espermatozoides.
carga o transporte, han venido siendo reemplazados Pareja, adecuaron la tecnología necesaria para la congelación Precisamente la escasa fertilidad del semen criopreservado en
por maquinaria y vehículos modernos. de semen de burro a partir de 19 muestras de ejemplares, las equinos es una de las razones que ha limitado su utilización
En relación con el burro criollo colombiano, este cuales son un aporte para la creación futura de un banco de en procesos de inseminación artificial.
afronta un riesgo de endogamia, lo cual está provo- esperma para salvar la especie. Dentro de las razones de esta situación se encuentra el es-
cando la pérdida de su variabilidad genética en el “La reproducción tradicional de especies de explotación trés oxidativo (desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes)
país. Asimismo, durante varios años los ejemplares zootécnica como bovinos, cerdos y equinos se realiza a través del semen, provocado por los choques térmicos durante el
existentes se han cruzado con especies importadas de la monta natural, pero con inseminación artificial, para la proceso de preservación a bajas temperaturas.
como mamut o catalán español, que no están adap- cual es fundamental tener la esperma congelada”, explica el En un ambiente natural, el plasma seminal ofrece protección
tadas a las condiciones del trópico. docente, quien agrega que la importancia de la técnica radica antioxidante. Por eso, evaluar algunos de los componentes
En Colombia, la forma de contabilizar la pobla- en que de una sola eyaculación es posible tomar hasta 200 bioquímicos de esta sustancia puede ser útil en el mejora-
ción de burros es una de las razones por las que muestras e inseminar a varias hembras. miento de los procesos de suplementación del semen some-
no se conoce con certeza el número de ejemplares tido a crioconservación. En ese sentido, los investigadores
existentes, ya que las estadísticas engloban en una TÉCNICAS MEJORADAS constataron que la aplicación de los antioxidantes vitamina
misma cifra caballos, burros y mulas. Así, en 2009, E y quercetina en las muestras colectadas permitió que el
la Encuesta Nacional Agropecuaria del Ministerio El proceso planteado por los investigadores consiste en obtener material conservara las características idóneas al exponerse
de Agricultura y Desarrollo Rural estimó que de los la muestra de semen de un macho, evaluarla, y si cumple con al frío extremo.
2.505.579 equinos censados, 220.847 eran asnos y los criterios mínimos de calidad, procesarla, lo cual implica De esta manera, el trabajo realizado tras varios años de
432.977 mulas. llevarla de manera escalonada a una temperatura de -196 oC. investigación representa una oportunidad y un reto para que
Como una posibilidad de garantizar la existencia Para colectar la muestra –que oscila entre 50 y 80 mililitros entidades como el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA)
de la especie, a través de eventuales proyectos de (ml)– normalmente se utiliza una vagina artificial que imita generen los primeros bancos de semen dedicados a conser-
repoblación, investigadores de la Facultad de Cien- las condiciones de temperatura y presión del aparato genital var una de las especies animales más valiosa en la cultura
cias Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia natural. En el laboratorio, el material sufre un proceso de colombiana: el burro.
(UN) Sede Medellín y del programa de Biología de la centrifugado que separa el plasma seminal (medio líquido
Universidad CES proponen conservar el semen de del eyaculado encargado de mantener el medio nutritivo del
burro con técnicas de crioconservación, algo que ya espermatozoide) de las células espermáticas, es decir repro- PALABRAS CLAVE: tuberculosis,
se ha realizado de manera similar en la Institución ductoras de espermatozoides. Amazonia, comunidades indígenas,
con especies exóticas de cabras y conejos. Una de las novedades realizadas por los investigadores desnutrición. Consúltelas en
La crioconservación permite mantener las células fue el cambio de los métodos de empaque del semen por uno www.unperiodico.unal.edu.co
a baja temperatura sin que pierdan su viabilidad y más eficiente. Para ello utilizaron pajillas (como las que se
CIENCIA & TECNOLOGÍA

Apuesta por la conservación de razas nativas de burro en Colombia
El Sistema Nacional de Ciencia y Tecnología Agroindustrial del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y la cadena
productiva equina, asnal y mular están promoviendo tanto el estudio y mejoramiento de las técnicas de criopreservación de
material genético de asnos criollos colombianos, como la elaboración de un banco de germoplasma que permita preservar esta
raza nativa y diversificar las líneas familiares existentes. El propósito es que la comunidad agropecuaria acceda a ejemplares
valiosos para actividades de trabajo, servicio y entretenimiento.
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CRIOTOLERANCIA ESPERMÁTICA Y EFECTO DE LOS

ANTIOXIDANTES Y EL SISTEMA DE EMPAQUE SOBRE LAS

Andrés Pareja López

Universidad Nacional de Colombia

Andrés Pareja López

Universidad Nacional de Colombia

un procedimiento de criopreservación, obteniéndose los mejores resultados con las

Se hace necesario darle continuidad al presente proyecto de investigación, vinculando

Palabras clave: Burro, criopreservación, criorresistencia, antioxidantes, calidad

It is necessary to give continuity to this research project, linking the associations of

Keywords: Donkey, cryopreservation, cryotolerance, antioxidants, sperm quality,

2. Capitulo 2. Efecto de la vitamina E y el tamaño de la pajilla sobre espermatozoides

2.2 Introducción .............................................................................................................. 23

3. Capítulo 3: Efecto de la quercetina y el tamaño de la pajilla sobre la criotolerancia

4. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................... 47

4.2 Recomendaciones ..................................................................................................... 48

Tabla 1-1: Análisis de componentes principales y la participación de cada variable dentro

Tabla 3-2. Comparación de resultados (media ± EEM) de 11 variables cinemáticas

No obstante, la FAO ha reportado que muchas poblaciones de razas asnales se

En este sentido, las biotecnologías reproductivas como la inseminación artificial (IA), la

El uso de semen congelado para los procedimientos de IA puede resultar ventajoso en

La mayoría de protocolos para la criopreservación de semen asnal han sido adaptados

Buscando alterar al mínimo las calidades funcionales y estructurales de los

Los resultados obtenidos a partir de la evaluación de diferentes protocolos de

características fenotípicas de importancia comercial y no por su criotolerancia

Palabras clave: estrés oxidativo, características seminales, proteínas, plasma seminal.

El uso de semen congelado en inseminación artificial representa la principal herramienta

Los espermatozoides de equinos son especialmente susceptibles al estrés oxidativo, lo

El semen fue obtenido de diferentes criaderos pertenecientes a los departamentos de

1.3.2 Recolección de la muestra seminal

1.3.3 Preparación de muestras seminales

1.3.4 Capacidad antioxidante equivalente al Trolox (TEAC)

1.3.5 Poder reductor férrico/antioxidante (FRAP)

1.3.6 Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS)

1.3.7 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

1.3.8 Criopreservación de las muestras seminales

un baño maría a 37°C por al menos 20 segundos. El protocolo de criopreservación de

1.3.9 Evaluación de la movilidad

Las evaluaciones de movilidad pos-descongelación se hicieron objetivamente bajo

1.3.10 Funcionalidad de la membrana plasmática (HOST)

Para la determinación de la funcionalidad de la membrana plasmática se utilizó el test

1.3.11 Integridad de la membrana plasmática (IMP)

La tinción eosina/nigrosina permite evaluar la integridad de la membrana plasmática por

1.3.12 Potencial de membrana mitocondrial (PMM)

Se mezclaron 10 µl de la muestra seminal con 10 µl de la solución de IP stock (500 μg/ml

1.3.13 Reacción acrosómica (RA)

Se mezclaron 10 µl de la muestra seminal, con la solución de FITC-PNA (concentración

1.3.14 Daño en ADN (SCSA)

Para medir la integridad de ADN espermático se usó la metodología SCSA (Sperm

1.3.15 Análisis Estadístico

1.4.1 Selección de buenos criotolerantes y malos criotolerantes

Variables CP1 CP2 CP3

Variables CP1 CP2 CP3

1.4.2 Estatus oxidativo

Igualmente, no se encontró diferencia estadísticamente significativa (p > 0,05), para

1.4.3 Perfil proteico del plasma seminal SDS-PAGE

Figura 1-3: Proteínas de plasma seminal asnal separadas en gel de poliacrilamida

1.4.4 Movilidad espermática podescongelación de buenos y

1.4.5 Variables estructurales y funcionales posdescongelación

Tabla 1-3. Comparación de los resultados (media ± EEM) de la funcionalidad de la membrana

En el presente trabajo de investigación se usó la metodología de componentes

movilidad como los marcadores confiables de calidad espermática y de fertilidad en

Igualmente, en los datos obtenidos de las muestras de los espermatozoides, de los BC