Una breve historia de la proteína G Receptores acoplados

La idea de los receptores ha fascinado a los científicos durante más de un siglo y, desde luego, nos ha
fascinado a mí ya Brian en todas nuestras carreras de investigación. Hoy sabemos que los receptores
acoplados a la proteína G, también conocidos como siete receptores transmembrana, representan con mucho
el más grande, el más versátil y el más ubicuo de las varias familias de receptores de membrana plasmática.
Comprenden casi mil genes que regulan prácticamente todos los procesos fisiológicos conocidos en los
seres humanos, incluidas las modalidades sensoriales de la visión, el gusto y el olfato. Además, estos
receptores son los objetivos de los medicamentos que representan más de la mitad de todas las ventas de
medicamentos recetados en el mundo (1).

A pesar del papel central que desempeña el estudio de los receptores en la investigación biomédica actual,
es solo en los últimos treinta años que ha habido una aceptación general de que existan. Antes de ese
momento, la noción de receptores celulares era muy controvertida y se asociaba con un gran escepticismo.
Quizás la primera afirmación explícita sobre la existencia de receptores fue hecha por el farmacólogo
británico, J.N. Langley. En 1905 escribió lo siguiente: “Entonces, podemos suponer que en todas las células
se deben distinguir dos constituyentes, al menos. La sustancia principal que se refiere a la función principal
de la célula como la contracción y la secreción y las sustancias receptivas sobre las que actúa la sustancia
química. Cuerpos y en ciertos casos por estímulos nerviosos. La sustancia receptiva afecta o es capaz de
afectar el metabolismo de la sustancia principal” (2).

Por lo tanto, la declaración de Langley postula explícitamente las dos funciones interrelacionadas de estas
hipotéticas estructuras de receptores: primero, interactúan con químicos y estímulos, presumiblemente al
unirlos de una manera específica, y segundo, actúan sobre los efectores dentro de la célula para alterar su
función.

Sin embargo, la idea de Langley fue generalmente ignorada o ridiculizada. Un ejemplo de esto es la
siguiente declaración escrita unos cuarenta años después, irónicamente por su alumno Henry Dale, quien
ganó el Premio Nobel por sus estudios sobre la neurotransmisión colinérgica. Sin embargo, en 1943 tuvo
esto para decir sobre la idea del receptor de su mentor: "Es una mera afirmación de hecho decir que la
acción de la adrenalina capta ciertas células efectoras y deja otras no afectadas; es una simple deducción de
que las células afectadas tienen una afinidad especial de algún tipo por la adrenalina, pero dudo que la
atribución a tales células de "receptores de adrenalina" haga más que reafirmar esta deducción en otra forma
"(3).

Figura 1. Unión de radioligandos al receptor β2-adrenérgico de las membranas de eritrocitos de rana.

.
A. Ajuste de curva computarizada de los datos de unión del desplazamiento de [3H] dihidroalprenolol
por el antagonista (-) alprenolol. B. Desplazamiento por el agonista (-) isoproterenol en presencia
(□ - □) o ausencia (○ - ○) de 10–4 M GTP. C. El modelo complejo ternario. A y B se reproducen
con permiso de la referencia 11, C se reproduce de la referencia 12.

Quizás aún más irónico sea la próxima cita de Raymond Ahlquist. Fue un distinguido farmacólogo clásico
de mediados del siglo XX que ganó el Premio Lasker por su trabajo en 1948, afirmando que había dos tipos
de receptores para la adrenalina, a los que denominó α y β en función de las diferentes capacidades de los
diversos agentes adrenérgicos para Estimular varios procesos fisiológicos (4). No obstante, unos veinticinco
años más tarde escribió lo siguiente: "Esto sería cierto si fuera tan presuntuoso como para creer que los
receptores α y β realmente existían. Hay quienes lo piensan e incluso proponen describir su estructura
íntima. Para mí, son un concepto abstracto concebido para explicar las respuestas observadas de los tejidos
producidos por sustancias químicas de diversas estructuras ”(5).

Entonces, fue en este contexto de escepticismo que aquellos de nosotros que estábamos interesados en tratar
de darles vida a estos receptores míticos, empezamos el trabajo hace unos cuarenta años. De inmediato
quedó claro que si teníamos éxito, sería necesario desarrollar un conjunto completo de nuevas tecnologías
que no existían en ese momento y que el primero de ellos tendría que ser métodos de unión de radioligandos
para estudiar los receptores directamente. Y así, junto con el estudiante Rusty Williams y el postdoctor
Marc Caron, me propuse desarrollar tales métodos, inicialmente para el receptor β-adrenérgico (6) y luego
el receptor α-adrenérgico (7). Las técnicas de unión de radioligandos que desarrollamos a principios de los
años 70 nos permitieron estudiar la regulación de los receptores por numerosos factores (8), descubrir
subtipos de receptores previamente insospechados (9) y desarrollar teorías sobre los mecanismos de acción
del receptor.

Por ejemplo, encontramos que las curvas de competición de unión para antagonistas como el alprenolol,
antagonista adrenérgico β, son empinadas y monofásicas; mientras que los de los agonistas, como el
isoproterenol o la epinefrina, son superficiales (10) que muestran dos estados de unión distintos, uno de alta
y otro de baja afinidad (11) (Fig. 1A). Los dos estados podrían interconvertirse mediante la adición de
nucleótidos de guanina que conducen a una única población de receptores en el estado de baja afinidad
(Fig. 1B). Junto con Andre DeLean, desarrollamos el modelo complejo ternario para explicar este
comportamiento (Fig. 1C) (12). Postuló que la forma de baja afinidad del receptor, mostrada aquí como
AR, es un complejo del agonista con el receptor libre, mientras que la forma de alta afinidad es un complejo
ternario de agonista, receptor y algún otro componente de membrana. El papel modulador de los nucleótidos
en la afinidad del agonista por el receptor sugirió inmediatamente que el componente X en el esquema era,
en ese momento, la proteína reguladora de nucleótidos de guanina (proteína G) recientemente descubierta.
La capacidad de un agonista para dirigir la interacción del receptor con la proteína reguladora del nucleótido
guanina para formar el complejo ternario es esencialmente una medida de su eficacia para estimular la
adenilato ciclasa. Se puede aproximar simplemente por la relación de afinidades del agonista para las
formas de afinidad baja (binaria) y alta (ternaria) del receptor que se pueden obtener fácilmente a partir de
estas curvas de competición. Estos hallazgos representan quizás la demostración directa más temprana de
las interacciones alostéricas del receptor con los agonistas y las proteínas efectoras G, la unión de cada uno
al receptor mejora de manera alostérica la afinidad de unión del otro. Este enfoque para analizar dichos
datos de unión de ligandos ha sido universalmente aplicable a la gran familia de GPCR.

Sin lugar a dudas, una de las aplicaciones más importantes de nuestras técnicas de unión de ligandos fue
ayudarnos a etiquetar las supuestas moléculas receptoras a través de varias etapas de purificación, para que
podamos aislarlas. Purificar el receptor β-adrenérgico y otros receptores adrenérgicos fue verdaderamente
una tarea desalentadora. Las moléculas son prácticamente contaminantes de las membranas plasmáticas y
requieren una purificación de 100.000 veces. Además, primero tuvimos que descubrir cómo solubilizarlas
de las membranas antes de que pudiéramos comenzar el trabajo de purificación. En última instancia, la
clave de nuestro éxito fue nuestro desarrollo de matrices de cromatografía de afinidad en las que pudimos
acoplar varios antagonistas β adrenérgicos y luego α-adrenérgicos a soportes sólidos (13–15) (Fig. 2A). La
adsorción y elución bioespecífica de dichas columnas con ligandos adrenérgicos seguidas de otras etapas
cromatográficas más convencionales condujeron finalmente a nuestro aislamiento de preparaciones
homogéneas de cada uno de los cuatro receptores adrenérgicos conocidos entonces, α1, α2, β1 y β2
(revisado en 16). En este gel de poliacrilamida SDS se muestran tales preparaciones para tres de esos cuatro
receptores adrenérgicos (Fig. 2B). Esta cifra representa aproximadamente una década de trabajo de varios
estudiantes devotos y postdoctorados, entre los que destacan Marc Caron y Jeff Benovic, entre otros. Cada
una de las moléculas receptoras putativas aisladas es una glicoproteína de aproximadamente 60,000 a
65,000 daltons de peso molecular que se unía a ligandos adrenérgicos alfa y β específicos con la
especificidad y la estereoespecificidad apropiadas que coinciden con lo que se esperaría de los experimentos
farmacológicos clásicos (16).

Figura 2. Aislamiento de los receptores adrenérgicos mediante cromatografía de afinidad.

Sin embargo, el escepticismo persistió en cuanto a si estas moléculas aisladas también podrían realizar la
función compañera de un receptor, es decir, la capacidad de activar procesos biológicos específicos. Que
este fue, de hecho, el caso fue demostrado por un talentoso postdoctorado, Rick Cerione. Inicialmente,
reconstituyó nuestras proteínas de receptor β purificadas en vesículas de fosfolípidos y luego las fusionó
con eritrocitos de Xenopus laevis, el sapo de garras africanas (17). Estas células, aunque poseían el sistema
enzimático adenilato ciclasa y otros GPCR como el receptor de prostaglandina, no contenían receptores β
y, por lo tanto, los agonistas adrenérgicos β no estimulaban la actividad del adenilato ciclasa. Una vez que
las vesículas que contenían el receptor se fusionaron con las células, llevando así los receptores a la
membrana celular, el adenilato ciclasa adquirió capacidad de respuesta a los fármacos β-adrenérgicos. En
el transcurso de un año, y en colaboración con Lutz Birnbaumer y la difunta Eva Neer, pudimos lograr una
reconstitución completa de un adenilato ciclasa sensible a catecolamina a partir de tres proteínas, el receptor
β-adrenérgico purificado, la proteína reguladora del nucleótido guanina (Gs) y La unidad catalítica del
adenilato ciclasa (18). Estos resultados demostraron de manera concluyente que las proteínas aisladas eran
en realidad el receptor β-adrenérgico y eran capaces de llevar a cabo ambas funciones de un receptor
verdadero.

Con las proteínas receptoras validadas y altamente purificadas en la mano, pudimos obtener tramos cortos
de secuencia de aminoácidos a partir de fragmentos de bromuro de cianógeno del receptor β2-adrenérgico
y usarlos para diseñar sondas de oligonucleótidos para clonar el ADNc y el gen para el receptor β2-
adrenérgico (19). Este exitoso esfuerzo se realizó en colaboración con un equipo de Merck y mi laboratorio,
y representó el primer esfuerzo de investigación exitoso de un joven cardiólogo que había estado trabajando
en mi laboratorio durante varios años. Su nombre era Brian Kobilka. En esta primera secuencia clonada de
un GPCR de unión a ligando podríamos observar todas las características que ahora se consideran canónicas
para la familia (Fig. 3): siete dominios hidrofóbicos que abarcan transmembrana aparentes, sitios para la
fosforilación reguladora en dominios citoplásmicos y secuencias de consenso para glicosilación en el
término amino. En lo que en ese momento era una sorprendente sorpresa, observamos una homología de
secuencia, que se muestra aquí en azul (Fig. 3), con la proteína de detección de luz visual rodopsina. Hoy,
veinticinco años después, a las personas les resulta difícil entender por qué esto sería una sorpresa. Esto se
debió a que la rodopsina, cuya secuencia se había determinado un par de años antes por la secuenciación
de proteínas convencional (20,21), y la bacteriorrodopsina (22), una bomba de protones sensible a la luz de
archebacteria, eran en ese momento las únicas dos proteínas de extensión de membrana. conocido. Y, dado
que ambas eran proteínas sensibles a la luz, se había especulado que siete tramos de membrana deben ser
una característica distintiva de las moléculas sensibles a la luz (20,21). Solo con la clonación del receptor
β2-adrenérgico comenzó a surgir que era, en cambio, la característica distintiva de los receptores acoplados
a la proteína G. En un año habíamos clonado el receptor α2-adrenérgico altamente homólogo (23) y en
varios años un total de ocho receptores adrenérgicos (24), tres de los cuales se basaban en la secuenciación
de proteínas de las moléculas aisladas (19,23,25) y Un receptor de serotonina (26). Todos mostraron la
conservada organización 7TM.

Figura 3. Clonación del receptor β2-adrenérgico. Los residuos sombreados en azul son homólogos a la
rodopsina; naranja son sitios de fosforilación de PKA de consenso; rojo, sitios de fosforilación de GRK;
Sitios de consenso verdes para la glicosilación ligada a N. Reproducido con permiso de la referencia 65.

Así que para 1987 estábamos bastante convencidos de que todos los receptores acoplados a la proteína G
conocidos en ese momento serían probablemente miembros de la superfamilia de siete receptores
transmembrana (27). Durante los siguientes años, la familia creció rápidamente a medida que muchos
laboratorios clonaban GPCRs casi invariablemente mediante técnicas de homología, como el cribado de
baja rigurosidad y luego la PCR. De hecho, posteriormente casi ningún otro GPCR se purificó antes de su
clonación. Por lo tanto, siempre nos sentimos bien con respecto a la muy difícil década o más de trabajo
que se llevó a cabo en la purificación de los cuatro receptores adrenérgicos que proporcionaron las primeras
secuencias, la Piedra de Rosetta, si así lo desea, sobre la cual podría construirse una superfamilia mucho
más grande.

A continuación, utilizamos varias técnicas para tratar de comprender cómo la estructura única y altamente
conservada de siete receptores transmembrana que se extienden determina las dos funciones básicas de la
unión del ligando y la activación de la proteína G. Nos basamos principalmente en la mutagénesis dirigida
(28) y en la creación de los primeros receptores quiméricos, en este caso, quimeras del receptor α2 y β2-
adrenérgico (29). Una vez más, Brian tomó la iniciativa en este trabajo. Aunque están estrechamente
relacionados en su estructura (estos dos receptores mostraron una identidad de secuencia del 50%) realizan
funciones bioquímicas y fisiológicas diametralmente opuestas con el receptor α2 inhibidor de la adenilato
ciclasa a través de Gi y el receptor β2-adrenérgico que lo estimula a través de Gs (Fig. 4A) Al crear estas
quimeras pudimos demostrar que la especificidad de acoplamiento de la proteína G y, por lo tanto, la
función del receptor α2 se podría convertir de inhibidor de Gi a estimulante de Gs simplemente
reemplazando su tercer bucle citoplasmático con el del receptor adrenérgico β2 (Fig. 4B). Estos y muchos
otros estudios similares confirmarían que la amplitud de la membrana y los bucles extracelulares fueron
responsables de la especificidad de unión a los ligandos de los receptores, mientras que las regiones
mostradas en azul aquí en el citosol fueron responsables de determinar la especificidad del acoplamiento
de la proteína G (30,31) (Fig. 4C).

Figura 4. Receptores α2-β2-adrenérgicos quiméricos. Adaptado de las referencias 29 y 65.

Figura 5. Receptores adrenérgicos mutantes constitutivamente activos.

En el curso de realizar una mutagénesis adicional, Susanna Cotecchia, una compañera en el laboratorio,
descubrió por casualidad, para nuestra sorpresa, que algunas mutaciones en la parte distal del tercer bucle
citoplasmático de varios receptores adrenérgicos condujeron a receptores mutantes constitutivamente
activos. Estos son receptores que están activos incluso en ausencia de ligando (32-34) (Fig. 5A). En el
momento en que conceptualizamos esto como debido a su abrogación de ciertas interacciones
intramoleculares cruciales que normalmente mantendrían al receptor en su conformación inactiva, se
muestra como R y por lo tanto imitan los cambios conformacionales normalmente producidos por los
agonistas que conducen a la forma activa del receptor. para acoplar a G se muestra como R * (Fig. 5A). En
breve, Brian Kobilka explicará cómo las estructuras cristalinas de rayos X de los receptores han revelado
la naturaleza de las restricciones intramoleculares que se rompen por la activación de los receptores
inducida por agonistas. Curiosamente, ahora se ha demostrado que una creciente lista de enfermedades
humanas se debe a tales mutaciones activadoras de varios GPCR (Fig. 5B) (35).
Contemporáneo con este trabajo sobre la estructura de los receptores, mi laboratorio se había centrado en
tratar de entender el fenómeno virtualmente universal de la desensibilización del receptor. Este fenómeno
se ilustra en la Fig. 6 para el receptor β-adrenérgico expresado en un sistema celular cultivado. Cuando se
agrega a las células un agonista, como el isoproterenol, que es un congénero sintético de epinefrina,
estimula los receptores y el cAMP se eleva en respuesta. Pero dentro de unos minutos, los niveles vuelven
esencialmente al estado no estimulado a pesar de la presencia continua del fármaco (36). Desde los
primeros días de mi carrera, siempre me había fascinado este fenómeno, tal vez porque representa un
ejemplo tan claro de lo que es uno de los principios más generalizados de la fisiología, denominado
homeostasis. Por lo tanto, las células y los tejidos, cuando se estimulan de cualquier forma, tienen
innumerables mecanismos que tienden a devolverlos a su estado basal no estimulado.

Figura 6. Desensibilización de la producción de cAMP después de la estimulación del receptor β2-

adrenérgico. Reproducido con permiso de la referencia 36.

Estado basal no estimulado. Déjenme contarles cómo llegamos a descubrir el principal mecanismo
bioquímico responsable de dicha desensibilización. Aproximadamente en 1980, cuando acabábamos de
desarrollar sondas de fotoafinidad para el receptor β-adrenérgico (37), Jeff Stadel, un compañero en el
laboratorio utilizó esta sonda para marcar los receptores β-adrenérgicos en células que habían sido
desensibilizadas por exposición previa al agonista. isoproterenol (38). Cuando sometimos estos receptores
desensibilizados marcados con fotoafinidad a SDS Page, observamos que su movilidad en los geles se
retrasó (Fig. 7). Recientemente se había descrito que la fosforilación de proteínas de membrana a menudo
conducía a tales cambios en la movilidad electroforética. En consecuencia, etiquetamos las células con
fosfato inorgánico y pudimos demostrar que la desensibilización inducida por catecolamina se asoció con
la fosforilación del receptor β-adrenérgico (38).

Durante los siguientes años, un talentoso estudiante graduado, Jeff Benovic, pudo primero identificar la
nueva quinasa responsable de la fosforilación (39), purificarla hasta homogeneizarla en el cerebro bovino
(40) y clonar su ADNc (41). Fue una nueva quinasa independiente de cAMP que llamamos βARK, para el
receptor adrenérgico quinasa β. Ahora se conoce como receptor kinasa 2 acoplado a proteína G o GRK2.
Al mismo tiempo, se había encontrado que la rodopsina estaba fosforilada por una nueva quinasa
denominada rodopsina quinasa, cuando era blanqueada por la luz (42). Del mismo modo, esto parecía estar
asociado con una reducción en su función. Pudimos clonar el cDNA para la rodopsina quinasa (42) y
mostrar que él y βARK fueron los primeros dos miembros de una nueva subfamilia de quinasa, ahora
conocida como quinasas receptoras acopladas a proteína G. Hoy sabemos que esta familia contiene siete
enzimas, dos, los GRK 1 y 7 están limitados a la retina. Los GRK 2, 3, 5 y 6 se expresan de forma ubicua
(43) (Fig. 8). Gracias al trabajo del laboratorio de John Tesmer, se dispone de estructuras de cristal para
varias de ellas, la primera es la estructura que resolvió en colaboración con mi laboratorio hace unos 10
años para GRK2 en complejo con las subunidades βγ de las proteínas G, con las que interactúa en el citosol
para facilitar su translocación a los receptores unidos a la membrana plasmática (44) (Fig. 8). Todos los
miembros de la familia comparten una estructura de dominio tripartita conservada con un dominio de
quinasa catalítica central conservada flanqueada por dos dominios reguladores más divergentes.
 Figura 7. La desensibilización implica la
fosforilación del receptor. SDS-PAGE
de los receptores adrenérgicos β2 de las
membranas de eritrocitos de pavo
marcadas covalentemente con la sonda
de fotoafinidad [125I] -p
azidobencilcarazolol. Carril 2, células
incubadas con isoproterenol, 1 µM;
carril 3, isoproterenol, 1 µM en
presencia de propanolol 10 µM (un
antagonista); carril 4, células de control
incubadas con tampón solo.
Reproducido con permiso de la
referencia 38.

Figura 8. Quinasas receptoras acopladas a la proteína G. Reimpreso con permiso de la referencia 44.

Pero resultó que había más en la historia que solo estos GRK que fosforilan el receptor. En el curso de la
purificación de GRK2, encontramos que incluso a medida que aumentaba su actividad específica para
fosforilar las preparaciones de receptores, su capacidad para desensibilizar el receptor aislado, ensayado en
un sistema reconstituido, disminuyó. Esto nos sugirió que podríamos estar perdiendo algún otro elemento
o cofactor requerido (45).
Aproximadamente en esta época, el difunto Hermann Kuhn describió su observación de que una proteína
retiniana abundante, conocida entonces como proteína 48K o antígeno S, de alguna manera funcionó junto
con la rodopsina quinasa para desactivar la rodopsina (46). En consecuencia, la proteína pasó a llamarse
arrestina, porque "detuvo" la función de la rodopsina. Inmediatamente especulamos que esta proteína podría
ser similar a lo que estábamos perdiendo durante nuestra purificación GRK2. Por supuesto, su expresión
restringida solo a la retina significaba que no podía ser la proteína que buscábamos. Llamando a Kuhn, hice
los arreglos para que nos enviara algo de esta proteína 48K, que Benovic pudo demostrar rápidamente
restaurando la capacidad de βARK o GRK2 para desensibilizar el receptor β in vitro, aunque en altas
concentraciones (45).

Poco después, Toshimichi Shinohara en el NIH clonó el ADNc de esta proteína retiniana (47). Razonando
que lo que podríamos estar perdiendo durante nuestras preparaciones de enzimas no solo podría ser
funcionalmente análogo con la arrestina retiniana o la proteína 48K, sino que, de hecho, estructuralmente
homólogo con él, obtuvimos el clon de Shinohara y, usando técnicas de detección de baja rigurosidad,
Martin Lohse, luego En el laboratorio, fue capaz de clonar el cDNA para una secuencia idéntica al 70% de
la molécula que denominamos β-arrestin (48). Un año o dos más tarde, otro compañero, Håvard Attramadal,
pudo clonar otra molécula similar que denominamos β-arrestin2 (49). Ahora, con las tres auténticas
moléculas de arrestina recombinante en la mano, la arrestina visual y las dos β-arrestinas 1 y 2, podríamos
comparar sus capacidades para desensibilizar la rodopsina y el receptor β in vitro en sistemas reconstituidos
(Fig. 9). Cuando utilizamos rodopsina fosforilada en rodopsina quinasa, la arrestina visual fue bastante
potente en la inactivación de la señalización, mientras que las dos β-arrestinas fueron bastante débiles (Fig.
9A). A la inversa, para el receptor β fosforilado de GRK2, las dos β-arrestinas eran muy potentes y la
arrestina era muy débil (Fig. 9B). Estos hallazgos establecieron la similitud de los mecanismos de
desensibilización tanto para la rodopsina como para el receptor β, aunque con gran especificidad para la
molécula de arrestina involucrada (49).

Figura 9. Inhibición del receptor β2-adrenérgico y

la función de la rodopsina por la β arrestina 1, la
β-arrestina 2 y la arrestina en sistemas
reconstituidos. (A) La rodopsina se fosforiló con
la rodopsina quinasa. (B) los receptores β2-
adrenérgicos se fosforilaron con GRK2. La
transducina GTPasa estimulada por rodopsina fue
inhibida de forma más potente por la arrestina
visual (). En contraste, la Gsasa G2 estimulada por
el receptor adrenérgico β2 fue mucho más
potentemente inhibida por la β-arrestina 1 (●) o la
β arrestina 2 (▲). Reproducido con permiso de la
referencia 49.

Hoy sabemos que hay cuatro arrestos. Dos de ellos, arrestin1 y X arrestin, se limitan a la retina. Las β
Arrestinas 1 y 2, también conocidas como arrestina 2 y 3, se expresan de manera ubicua. Todas las
estructuras cristalinas se han resuelto y muestran, en cada caso, una proteína de dos dominios que consiste
casi en su totalidad en hojas β antiparalelas conectadas por una región bisagra y estabilizadas por un núcleo
polar (50) (Fig. 10).

Figura 10. Las arrestinas. Adaptado de la referencia 50 con permiso.

Entonces, donde todo esto nos llevó a mediados de los 90, se ilustra en la Fig. 11. Ilustra los dos paradigmas
universales que gobiernan la función de los GPCR y se basa en el entendimiento de que tres familias de
proteínas comparten la propiedad notable de poder para interactuar de manera casi universal con los
receptores de una forma totalmente agonista o dependiente de estímulos. Estas proteínas son las proteínas
G heterotriméricas, las quinasas receptoras acopladas a la proteína G y las β-arrestinas. Después de la
estimulación, los receptores activados interactúan con las proteínas G para conducir a la señalización celular
a través de una cascada de fosforilaciones. Sin embargo, los receptores activados son reconocidos y
fosforilados por los GRK, lo que conduce a la unión de una segunda proteína, la β-arrestina, que luego
interrumpe estéricamente la estimulación de la proteína G por el receptor, lo que conduce a la
desensibilización y disminución de las respuestas fisiológicas (51). También descubrimos otros
mecanismos de retroalimentación que operan para reducir la actividad de señalización del receptor, como
la fosforilación de los receptores por quinasas de segundo mensajero como la PKA y la PKC. Pero
generalmente no son específicos del receptor (52).

Sin embargo, durante los últimos diez años, ha surgido un nuevo paradigma, ya que nos hemos dado cuenta
de que el sistema β arrestin-GRK es en realidad multifuncional (Fig. 12). Por lo tanto, no solo desensibiliza
la señalización mediada por la proteína G sino que también sirve como un sistema de transducción de
señales por derecho propio. Las β-Arrestinas actúan como adaptadores o andamios que unen los receptores
a un número cada vez mayor de moléculas intracelulares (53,54). Aquí se muestran algunas de las vías que
se han demostrado en los últimos años, así como las consecuencias fisiológicas celulares resultantes. Los
más estudiados a fondo han sido las enzimas MAP quinasas. Las β-arrestinas también median la endocitosis
del hoyo recubierta de clatrina al interactuar con una lista creciente de elementos de la maquinaria
endocítica (55). Así, las β arrestinas median tres tipos de función, desensibilización, internalización del
receptor y señalización.

Figura 11. Activación y Figura 12. Nuevo paradigma para múltiples

desensibilización de GPCRs funciones mediadas por la β-arrestina.
Reproducido con permiso de referencia 65.

En el curso del estudio de la señalización mediada por la β-arrestina, hicimos un descubrimiento interesante
que ha facilitado enormemente este trabajo y que también puede tener importantes implicaciones
terapéuticas. Esto fue de los llamados agonistas sesgados (revisado en 56). Un agonista sesgado es un
ligando que estabiliza una conformación activa particular de un receptor, estimulando así algunas respuestas
pero no otras. Siete ligandos del receptor transmembrana, por ejemplo, pueden estar sesgados hacia una
proteína G particular o una β-arrestina. Los receptores mutados también pueden estar sesgados.

En el modelo clásico de dos estados de activación del receptor, los receptores pueden existir como un
receptor R inactivo o un receptor R * activo, con agonistas que estabilizan la conformación activa que
promueve los efectos celulares. En este modelo, todos los efectos del receptor son una consecuencia de la
forma R * activada única del receptor. Sin embargo, la existencia de agonistas sesgados que pueden
conducir a la estimulación de la señalización mediada exclusivamente por la proteína G-arrestina o β
implica que debe haber múltiples conformaciones activas del receptor (57).

A modo de ilustración, la Fig. 13 muestra algunos datos que comparan la capacidad de tres
ligandos para promover la interacción del receptor AT1A de angiotensina con proteínas G (Gq)
o β-arrestina en una línea celular que expresa el receptor (58). La activación de la proteína G se
está evaluando mediante un ensayo típico de segundo mensajero y se muestra en rojo, y el
reclutamiento de β-arrestina se muestra en negro. El primer panel muestra las curvas de
respuesta a la dosis para un agonista completo imparcial típico, la angiotensina en sí misma. Se
puede ver que las curvas para la interacción de la proteína G y la β-arrestina son muy similares.
Este panel central muestra la situación de un antagonista competitivo clásico que no tiene
actividad en ninguno de los ensayos. El tercer panel muestra los datos de un ligando con
polarización de β-arrestina completamente, en este caso TRV120027, que es un análogo de
octapéptido de la angiotensina. Como puede ver, este ligando no tiene absolutamente ninguna
capacidad para activar la señalización de la proteína G, por lo que es un antagonista competitivo
clásico para la activación de la proteína G, pero tiene una actividad sustancial para el
reclutamiento de la β-arrestina.

Figura 13. Activación de Gq y β arrestina por el receptor de angiotensina AT1a

estimulada por varios ligandos. Vea el texto para más detalles. Reproducido con permiso
de la referencia 58.

Como señalé, una consecuencia de este reclutamiento de la β arrestina es estimular las vías de señalización,
como la kinasa del mapa ERK, de forma paralela y, en algunos casos, completamente independiente de las
proteínas G. Con el fin de obtener una visión más global de las consecuencias de la señalización mediada
por la β-arrestina, hemos utilizado la espectrometría de masas para cuantificar todos los sitios de
fosforilación presentes en las células antes y después de la estimulación del receptor de angiotensina con
un agonista sesgado por la β-arrestina que no Activar las proteínas G (59).

Como se muestra en la Fig. 14, varias redes de señalización se iluminaron con fosforilación cuando la β-
arrestina, pero no la proteína G, la señalización mediada se activó de esta manera. Estos incluyeron varios
elementos de señalización de MAP quinasa, señalización de PI3 quinasa-AKT, mecanismos de reparación
de ADN, ciclo celular y vías de desarrollo y una extensa red de moléculas involucradas en la reorganización
del citoesqueleto y la dinámica de la actina. Estos resultados sugieren que la señalización mediada por la
β-arrestina es extremadamente diversa e implica la activación de muchas de las mismas vías que pueden
activarse a través de las proteínas G. Sin embargo, a menudo con consecuencias celulares muy distintas.

Resultados como estos probablemente tengan implicaciones para el desarrollo de nuevos agentes
terapéuticos. Déjame darte varios ejemplos. La angiotensina que actúa a través de los efectos mediados por
la proteína G es uno de los vasoconstrictores más potentes conocidos y puede provocar un aumento de la
presión arterial. Por el contrario, sus efectos mediados por el arresto β incluyen varios efectos
potencialmente beneficiosos, como la citoprotección y los efectos antiapoptóticos (60). Los bloqueadores
de los receptores de angiotensina, llamados ARB, se encuentran entre los medicamentos más importantes
utilizados en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, específicamente porque bloquean los efectos
hipertensivos de la angiotensina mediados por proteínas G potencialmente dañinos. Sin embargo, también
bloquean los efectos mediados por la β-arrestina potencialmente beneficiosos. Supusimos que un ligando
del receptor de angiotensina sesgado por β-arrestina que bloquea la señalización mediada por la proteína G
al mismo tiempo que estimula los efectos potencialmente beneficiosos de β-arrestin mediated podría
representar un tipo novedoso y excepcionalmente eficaz de agente terapéutico. De hecho, un compuesto
con tales propiedades, Trevena 120027, retarda la progresión de la insuficiencia cardíaca en animales,
disminuye la presión arterial (61) y es antiapoptótico (62).

Los ligandos también pueden estar sesgados hacia una proteína G y tales agentes también pueden tener
potencial terapéutico. Por ejemplo, la utilidad terapéutica de los opiáceos, los medicamentos más potentes
para aliviar el dolor disponibles, está mediada a través de la estimulación de las proteínas Gi a través del
receptor opioide μ (63,64), mientras que los efectos secundarios angustiantes del estreñimiento, la depresión
respiratoria y la tolerancia, requieren dosis mayores y mayores, están todas mediadas a través de la
señalización mediada por β-arrestin2 y se pierden en ratones knockout β-arrestin2 (63,64). Por lo tanto, los
ligandos sesgados de la proteína G para el receptor opioide μ deberían aliviar el dolor mientras tienen
efectos adversos notablemente reducidos

Estos ejemplos de ligandos sesgados de β-arrestina y proteína G demuestran cómo nuestra nueva
comprensión de estos dos tipos de vías de señalización, adquirida inicialmente a nivel bioquímico, puede
ser potencialmente aprovechada para beneficio terapéutico