Ha habido un resurgimiento en las enfermedades resultantes de infecciones con

microbacterias en los últimos 25 años. La tuberculosis se está convirtiendo en un importante

problema de salud en el pensamiento, debido a la virulencia de los organismos en gran
medida. Los constituyentes más externos de los bacilos, que incluyen el material
extracelular liberado por microbacteria de crecimiento activo en medios de cultivo
artificiales, están compuestos por principalmente de proteínas y carbohidratos. Durante los
últimos años, ha habido un significativo cambio en nuestro conocimiento sobre las tácticas
utilizadas por los microorganismos patógenos para infectar a sus hospedadores.

Muchas de estas proteínas, por ejemplo las proteinasas bacterianas, tienen suficiente
actividad enzimática para explicar su toxicidad. En el caso de Micobacterias, la presencia
de actividades enzimáticas en cultivos de M. tuberculosis ha sido conocida por un largo
tiempo hora. Culturas, en general para identificar las especies. En ambos casos, sin
embargo, y debido a la extensa autolisis que ocurre en cultivos de micobacterias, la
Cuestión de la localización exacta de estas actividades.

Material liberado de M. tuberculosis durante su Las diferentes fases de crecimiento han sido
reinvertidas por varios autores Estos estudios establecieron firmemente que la Cultivos
filtrados de la fase de crecimiento inicial, en la que La lisis bacteriana fue mínima, contenida
secretada. Proteínas que También puede definirse por medios cuantitativos. Aunque
numerosos estudios se han dedicado a Las propiedades antigénicas de estos polipéptidos
secretados. Se rompieron utilizando una celda de presión francesa a 24000-26000 p.s.i. y
las células rotas se centrifugaron durante 15 minutos a 3000 g.

La mezcla se re suspendió en 20 ml de PBS frío y se centrifugó durante 30 minutos, a 3000g

para eliminar las celdas intactas. Los 3000 g de sobrenadantes obtenidos de todas las
especies de micobacterias examinadas, que consistían en citosol y envolturas celulares, se
volvieron a centrifugar durante 20 minutos a 20000 g. Para prevenir cualquier
contaminación bacteriana durante los experimentos de incubación, se agregaron
sistemáticamente a los ensayos cloranfenicol y gentamicina a una concentración de 100 g
/ ml-l. La prueba API ZYM se usó para detectar la presencia de 19 actividades enzimáticas
de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se analizó la actividad de alanina aminopeptidasa utilizando 1 mM de L-alanina-p-

nitroanilida en 25 mM Tris / Tampón HCl, pH 7.2. El índice de localización de una enzima
dada se adaptó del propuesto anteriormente por Wiker et al. Para antígenos
micobacterianos y se definió como la actividad extracelular total por mg de proteína del
fluido de cultivo dividida por la actividad total por mg de proteína en el compartimento unido
a las células. Se detectó mucinasa e hialuronidasa en una De manera similar,utilizando
0,28% de mucina estomacal porcina y 0,1% de ácido hialurónico de Streptococcus
xooepidemicus , respectivamente, las reacciones se revelaron inundando las placas con
cetrimida .

La ADNasa y la ARNasa se ensayaron según lo descrito por Kannan et al. Además, las
actividades de la endopeptidasa se analizaron en condiciones líquidas con sustratos
cromogénicos 2 '/ o, Azocasein, Elastin-Congo Red, colágeno impregnado con Azo-tinte o
Hide Powder Azure , tampón Tris / HCl 25 mM , pH 7.2. Las pruebas de rutina utilizadas en
microbiología para detectar las actividades enzimáticas de los cultivos de agar o caldo se
adaptaron a medios líquidos para los ensayos de las fracciones micobacterianas. La
hidrolización de nitrocefina reveló urelina, hidrolasa de arginina, lisina
descarboxilasa,ornitina descarboxilasa y fenilalanina desaminasa .
Resultados
Crecimiento de M. smegmatis y secreción de proteínas es bien sabido que las
microbacterias liberan diversas sustancias, incluidas las proteínas, en su medio
circundante. Sin embargo, dependiendo del estado fisiológico de los cultivos, el material
puede contener productos que se originan en la envoltura celular y / o en el compartimento
citosólico de la célula. Los bacilos se multiplicaron por 3-4 d, seguido de una fase
estacionaria. La actividad hidrolasa de Tween 80 apareció en el filtrado de cultivo desde el
día 3, mientras que no se detectó actividad de isocitrato deshidrogenasa en el fluido de
cultivo.

La actividad de la alanina aminopeptidasa asociada a la célula se detectó en el fluido de

cultivo desde el inicio de la fase estacionaria, es decir, el día 6, un resultado consistente
con la observación previa de que una actividad máxima de esta enzima, que
presumiblemente está involucrada en el recambio de la pared celular, ocurrió en la última
fase de crecimiento exponencial de M. smegmatis. Esto explicaría la liberación de
materiales solubles de la envoltura celular al fluido de cultivo. Por lo tanto, se consideró que
las actividades enzimáticas presentes en el filtrado de cultivo de M. tu6erculosis H37Rv en
el día 16 se derivan de una ubicación extracelular, mientras que las que aparecieron en
cultivos más antiguos son probablemente Haber derivado de la autolisis de las
bacterias. Actividad enzimática extracelular de M. smegmatis y M. tuberculosis Para
determinar el perfil enzimático de las dos especies de micobacterias, primero realizamos
un análisis cualitativo de los perfiles enzimáticos de los materiales extracelulares.

"Los resultados preliminares demostraron que algunas de las actividades enzimáticas,

especialmente las detectadas por las pruebas realizadas en placas de agar y en general
todas las pruebas enzimáticas realizadas incubando los fluidos de cultivo más de 16 h a 37
"C, pueden dar resultados positivos falsos, probablemente debido contaminación con
especies no micobacterianas. La fracción más susceptible a la contaminación bacteriana
fue el fluido de cultivo dializado, probablemente debido a la eliminación del glicerol, que se
sabe que es tóxico para muchas especies bacterianas en altas concentraciones.
Curiosamente, sin embargo, diez de las actividades extracelulares de M. tuberculosis,
aunque presentes en el extracto celular de M. smegmatis, no se detectaron en el filtrado de
cultivo 5 d de M. smegmatis, lo que sugiere que tienen ya sea una ubicación asociada a la
envoltura o citosólica en esta última especie. A la inversa, se detectaron dos actividades
enzimáticas presentes en los extractos celulares de ambas especies en el fluido de cultivo
de M. smegmatis pero no en el de M. tuberculosis.

Debido a la gran diversidad de proteínas extracelulares producidas por las dos especies,
no se pudo establecer una relación firme entre la presencia o la ausencia de una banda
particular en la SDS-PAGE y las masas moleculares publicadas de los polipéptidos
antigénicos secretados. El uso de los anticuerpos monoclonales disponibles dirigidos contra
las enzimas purificadas confirmaron la presencia de alanina deshidrogenasa de 40 kDa en
el filtrado de cultivo de M. tuberculosis H37Rv , pero este enfoque proporciona poca
información sobre la actividad enzimática. Los intentos de revelar las actividades en geles
se vieron obstaculizados por la desnaturalización irreversible de las enzimas en SDS-PAGE
y la gran dificultad de adaptar la mayoría de las pruebas utilizadas para la detección de
gel, en particular las basadas en la medición cinética de los sustratos. En consecuencia, las
diez actividades enzimáticas presentes en el fluido de cultivo del bacilo tuberculoso y
ausentes de las de la especie saprófita M. srnegmatis se cuantificaron utilizando métodos
convencionales.

La Tabla 3 demuestra que una parte significativa de las actividades enzimáticas se encontró
en el filtrado de cultivo. Dependiendo de la enzima, el porcentaje de la actividad enzimática
total encontrada en el fluido de cultivo varió de 17 a 92 '30. Informaron que el 30% de la
glutamina sintetasa de M. tuberculosis Se encontró H37Rv en el filtrado de cultivo, mientras
que la porción extracelular de esta enzima se estimó en el presente estudio como el 17%
de la actividad bacteriana total de La misma cepa crecida en el mismo medio de cultivo. Las
diferentes actividades fueron entre cuatro y 134 veces más concentrado en el líquido
extracelular que en el interior de las células.

Curiosamente, el fraccionamiento del extracto celular para producir un gránulo de 2OOOOg

que consiste principalmente en fragmentos de envoltura celular demostró que esta fracción
contenía solo un proporción insignificante de la mayoría de las actividades enzimáticas
probadas, lo que confirma aún más que las actividades corresponden a enzimas secretadas
en lugar de proteínas que residen en la fracción de la envoltura celular. Actividades de
enzimas ubicadas en la superficie de M. smegmatis y M.tuberculosis Para identificar las
enzimas que tienen una ubicación en la superficie y por lo tanto poseen un papel potencial
en la interacción entre las bacterias y su entorno, el material amorfo que cubre las células
de las dos especies de micobacterias fue Se extrajo con perlas de vidrio y se analizó su
contenido de enzimas. Las ocho actividades restantes no se detectaron ni en el filtrado de
cultivo ni en el material de envoltura celular más externo de M. smegmatis.

Localización en M. smegmatis de algunas actividades enzimáticas extracelulares

detectadas en M. tuberculosis.
La ausencia en M. smegmatis de un conjunto de enzimas extracelulares y expuestas a la
superficie que se encuentran en M. tuberculosis puede explicarse por una ubicación
citosólica o una ubicación capsular interna de estas enzimas en M. smegmatis. Para ubicar
estas ocho actividades enzimáticas extracelulares, extrajimos los materiales capsulares
que cubren las células de M. smegmatis por etapas con Tween 80 durante 1, 4 o 24 horas
y con perlas de vidrio, un método conocido para exponer los constituyentes capsulares
internos. El análisis de los materiales extraídos mostró una marcada diferencia en la
ubicación de las diversas actividades enzimáticas en los compartimentos de la envoltura
celular de M. smegmatis. Las actividades de nicotinamidasa e isonicotinamidasa se
encontraron enterradas más profundamente en la cápsula de M.Smegmatis que las otras
cinco enzimas, ya que las actividades correspondientes no se pudieron medir antes del
tratamiento de los bacilos con Tween 80 durante 24 h.
Localización en M. tuberculosis de algunas actividades enzimáticas extracelulares de M.
smegmatis.

La ubicación de las dos actividades enzimáticas extracelulares de M. smegmatis no

detectadas en el fluido de cultivo de M. tuberculosis también fue investigada por Midiendo
las actividades en los materiales extraídos del bacilo tuberculoso con Tween 80 y perlas de
vidrio. La erosión de las regiones de La cápsula de M. tuberculosis mediante el tratamiento
de células con Tween 80 durante 1 o 4 horas y el uso posterior de perlas de vidrio no
expusieron las dos enzimas en la bacteria Fue necesario un tratamiento con Tween 80
durante 24 h para extraer la actividad de a-esterasa, pero no se detectó actividad de
hidrolasa de Tween 80.
Actividad enzimática extracelular y localizada en la superficie de otras especies microbacterianas

Para evaluar aún más la importancia biológica potencial de las diez enzimas extracelulares
y localizadas en la superficie del patógeno obligado M. tuberculosis comparamos los perfiles
de enzimas de M. bovis BCG, un patógeno oportunista de crecimiento rápido y de
crecimiento lento, y un patógeno no patógeno adicional. Especies. Esto dio lugar a la
clasificación de las cepas examinadas en tres grupos: los patógenos obligados que
invariablemente secretan o exponer en sus superficies las diez enzimas enumeradas en la
Tabla 4; los no patógenos M. smegmatis y M. phlei, en los cuales la mayoría de estas
enzimas no se secretan ni situado en la superficie; los patógenos oportunistas que secretan
o exponen en su superficie algunas de estas enzimas. Como las tasas de crecimiento de
las especies no están correlacionadas con sus perfiles de enzimas extracelulares, la
diferencia en la secreción y / o exposición de enzimas como superóxido dismutasa,
catalasa, peroxidasa, La glutamina sintetasa y la alanina deshidrogenasa tienen más
probabilidades de estar relacionadas con el grado de patogenicidad de los organismos que
con su tasa de crecimiento.
Discusión
Determinado a lo largo de sus diferentes fases de crecimiento para diferenciar claramente
entre las enzimas extracelulares y los derivados de la liberación de superficie o Material
citosólico en el filtrado de cultivo. La actividad de la isocitrato deshidrogenasa, un marcador
de la lisis celular, y realizar las pruebas de enzimas en condiciones que prevenir la
contaminación bacteriana frecuente. Ocho actividades enzimáticas extracelulares fueron
Se ha encontrado que está presente en los fluidos de cultivo y / o en el Superficies celulares
de M. tuberculosis y M. bovis, y ausentes. Han sugerido que la glutamina sintetasa
extracelular catalizaría principalmente la síntesis de la L-glutamina El componente del
polímero de L-glutamato / glutamina se supone que está presente principalmente en la
envoltura celular de las cepas virulentas del complejo M.tuberculosis.
Además, la glutamina sintetasa, que puede liberar amoníaco de la glutamina, el aminoácido
más abundante de las células huésped, puede contribuir a la capacidad de M. tuberculosis
para inhibir la acidificación fagosoma y la fusión fagosoma-lisosoma en infectados. Esta
hipótesis explicaría el hecho de que la glutamina sintetasa fue más concentrado en el fluido
de cultivo de micobacterias patógenas. De manera similar, se ha demostrado que la alanina
deshidrogenasa se libera en cantidades sustanciales en el medio de cultivo de cepas
virulentas de M. tuberculosis, y encuentro que sugeriría un papel para la alanina
deshidrogenasa en la virulencia de M. tuberculosis. Su participación en el metabolismo del
nitrógeno, liberando amoníaco de la alanina, el segundo aminoácido más abundante en el
fluido extracelular del huésped, también sugeriría un papel para la alanina deshidrogenasa
en la inhibición de la acidificación fagosómica.

Así mismo, se sabe que los mutantes negativos a catalasa de M. tuberculosis que son
frecuentemente resistentes a la isoniacida exhiben una menor virulencia Hacia los conejillos
de indias que las cepas parentales. La aplicación de métodos de biología molecular a las
micobacterias debería ayudar a establecer el Importancia de las enzimas extracelulares que
proponemos como implicadas en la patogenicidad de M. tuberculosis. Estas enzimas no
son necesariamente las únicas extracelulares importantes para la patogenicidad
micobacteriana, ya que el uso de un medio de cultivo sintético podría evitar la producción
de enzimas hidrolíticas inducibles. De hecho, los resultados anteriores han demostrado que
al menos gelatinosa, fibrinógeno y elastina hidrolasa, ureasa o fosfolipasa Las actividades
pueden ser inducidas o fuertemente estimuladas según el medio de cultivo.

El cultivo de los microorganismos en medios que contienen diversos sustratos que imitan
el entorno de las células infectadas complementaría el presente enfoque. Finalmente, un
aspecto significativo del presente trabajo es el encontrando que algunas enzimas
extracelulares de M. tuberculosis Residir en compartimentos internos de la envoltura
celular. Ha sido recientemente mostrado por Escuyer et al. Que M. smegmatis, unas
especies en las que la superóxido dismutasa es estrictamente citosólica, tras la
transformación por el gen de M. avium que codifica la enzima fue capaz de exponer en su
célula.

Superficie e incluso liberar la enzima en el fluido de cultivo. Este resultado sugiere que
M.avium y Las especies micobacterianas patógenas difieren de M. smegmatis en la
secreción de superóxido dismutasa A través de la membrana citoplásmica. Que las
especies micobacterianas también difieren en la exposición en sus superficies y secreción
de algunas proteinas. Mientras que M. tuberculosis y algunas especies patógenas
examinadas aquí secretan y / o exponer en su superficie algunas enzimas potencialmente
involucrados en la patogenicidad, no secretan ni Exponer otras proteínas, como la a-
esterasa y Tween 80.