Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia, Mayo 1973, p. 555-558. Vol. 3, No. 5.

Copyright © 1973 Sociedad Americana de Microbiología Impreso en E.U.

·Nombre: Prieto Escamilla Alexis S. ·Grupo: 5QV1. ·Práctica No. 5 – Curación y segregación de plásmidos en Escherichia coli.

Demostración de factores R en Bordetella

bronchiseptica aislada de cerdos
NOBUYUKI TERAKADO, HAYAMI AZECHI, KIYOJI NINOMIYA y TAKESHI SHIMIZU
Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario, Kokubunji, Tokio, Japón y el Instituto Nacional de Salud Animal, Kodaira,
Tokio, Japón.

Recibido para publicación 9 de Febrero de 1973

Se examinó la transferibilidad de la resistencia a fármacos en cepas de Bordetella bronchiseptica

aisladas de cerdos. Estas cepas fueron resistentes a sulfadimetoxina (SA, más de 1,600 µg/ml),
estreptomicina (SM, más de 800 µg/mL), y aminobencil-penicilina (APC, 200 µg/ml). Todos ellos
podrían transferir su resistencia a fármacos como una unidad, tanto a una cepa sensible de
Escherichia coli, así como a B. bronchiseptica por cultivo mixto. La resistencia transferida SM-
SA-APC en las exconjugantes* de E. coli y B. bronchiseptica fue también transmisible por cultivo
mixto. Sin embargo, la transferencia de la resistencia triple no estuvo mediada por el filtrado libre
de células de la cepa de B. bronchiseptica resistente a fármacos que se utilizó como donadora. Se
encontró que la resistencia triple en la exconjugante E. coli ML1410 se eliminó en su totalidad por
el tratamiento con acriflavina. De acuerdo con estos resultados, puede concluirse con seguridad que
los factores R que contienen la resistencia a SM-SA-APC fueron demostrados en cepas de B.
bronchiseptica aisladas de cerdos.

Bordetella bronchiseptica es un habitante frecuente de las MATERIALES Y MÉTODOS

vías respiratorias de varios animales y se piensa que es un
agente causal de la rinitis atrófica infecciosa en cerdos de
corta edad (8, 9). Muchos antibióticos y compuestos
quimioterapéuticos sintéticos han sido ampliamente
utilizados para su control. Un informe reciente (2), sin
embargo, indica que muchos aislados de B.
bronchiseptica se han vuelto resistentes a las sulfamidas.
Recientemente, hemos aislado de las cavidades nasales
de cerdos jóvenes, cepas de B. bronchiseptica que son
resistentes no sólo a sulfadimetoxina (SA), si no que
también resisten estreptomicina (SM) y aminobenzil-
penicilina (APC). A partir del patrón de resistencia de
estas cepas, se sospechaba que su resistencia podría estar
mediada por factores transferibles de resistencia a
fármacos (factores R) (5). En este artículo se demuestran
la presencia de factores R en cepas de B. bronchiseptica
aisladas de cerdos.
*Exconjugantes: Corresponde a la célula bacteriana que
ha recibido un fragmento de una cepa exógena (el
exogenote) como resultado de una conjugación con otra
célula bacteriana donadora (F+).
Cepas bacterianas. Siete cepas de B. bronchiseptica
aisladas de cerdos fueron utilizadas como donadoras de
resistencia a fármacos. B. bronchiseptica ATCC 4617 fue
utilizada como control. Subcepas de Escherichia coli K-
12 fueron utilizadas como las receptoras de resistencia a
fármacos; ML1410, F– met- (requiere metionina) nal+
(resistente a ácido nalidíxico), ML1410-RFP, F– met– nal+
rfp+ (Resistente a la rifampicina), W3630, F– mal- (no
fermentadora de la maltosa). Las subcepas de K-12
fueron proporcionadas por S. Mitsuhashi. B.
bronchiseptica 114, una mutante resistente a ácido
nalidíxico (NA) obtenida por propagación en una placa
de agar nutritivo que contenía 200 µg de NA/ml, también
fue usada como receptora (para la sensibilidad a fármacos
de estas cepas, véase la Tabla 1).
Medios. El caldo de Penassay (Difco) se usó como un
medio líquido. Como medios sólidos se emplearon: agar
infusión de corazón (BHI) (Difco), medio Mueller-
Hinton (Difco), agar DHL (Eiken Chemical Co., Tokio),
agar nutritivo y agar AL. El agar nutritivo consistió en 10
g de peptona, 5 g de NaCl y 15 g de agar en 1,000 ml de
caldo de infusión de carne de caballo (pH 7,5). El agar
AL consistió de 1,000 ml de medio A (1), 20 g de lactosa,
40 ml de 0.2% de azul de bromotimol y 13 g de agar. La
metionina fue añadida a una concentración de 50 µg/ml
cuando fue necesaria.
 Fármacos. SA, SM, APC, rifampicina (RFP),
tetraciclina (TC), cloranfenicol (PC), kanamicina (KM), y
gentamicina (GM) se utilizaron. RFP y GM fueron
proporcionadas por Y. Yagisawa, de la Asociación de
Investigación de antibióticos de Japón. SA fue
suministrada por las industrias farmaceúticas Takeda,
Ltd., Osaka, y NA por Daiichi Seiyaku Co., Ltd. de
Tokio. El resto de los antibióticos son estándares de
trabajo empleados en nuestro laboratorio.
Prueba de sensibilidad a fármacos. El método de
dilución en agar se utilizó para la determinación de
sensibilidad a los fármacos. Una asada de una dilución
10-2 de un cultivo de toda la noche fue estriado sobre una
placa de agar infusión de corazón que contenía diluciones
seriadas dobles de cada medicamento. Para que el ensayo
de resistencia a SA, se usó el medio Mueller-Hinton. La
concentración mínima inhibitoria de cada fármaco fue
leída después de la incubación a 37 ºC durante 18 h.
Transferencia de la resistencia a fármacos. La
transferibilidad de la resistencia a fármacos en B.
bronchiseptica fue analizada por una modificación de un
método reportado previamente (10). Volúmenes iguales
(5 mL) de cultivos de las cepas donadoras y receptoras
fueron agitados durante toda la noche; densidades celular
de aproximadamente 109/mL de cada cepa, se mezclaron
y se incubaron a 37 ºC, sin agitación. Después de 1 h de
incubación, se sembró en medios selectivos una dilución
adecuada de la mezcla. Cuando ML1410 fue utilizado
como la receptora de la resistencia a fármacos, una placa
de agar DHL que contenía tanto NA (50 µg/ml) y SM
(12,5 µg/ml) fue utilizada para la selección de la
exconjugante ML1410. Cuando B. bronchiseptica 114
fue utilizada como la receptora de la resistencia a
fármacos, una placa de agar nutritivo que contenía tanto
NA (200 µg/ml) y SM (400 µg/ml) fue usada. El número
de células viables de E. coli y B. bronchiseptica fue
determinado por el método de dilución en agar después
de 24 y 48 h de incubación a 37 ° C, respectivamente. La
frecuencia de la transferencia fue siempre calculado en
relación al número de donadoras (es decir, como
transferencia por célula donadora). Cerca de 10 colonias
que desarrollaron en los medios selectivos fueron
tomadas al azar en cada caso y se purificaron en la misma
placa. A partir de entonces la transmisión de su
resistencia fue examinada de nuevo por un cultivo mixto
con cualquiera W3630 o ML1410-RFP. Cuando W3630
se utilizó como receptora, se empleó como medio
selectivo una placa de agar AL libre de metionina que
contenía 12.5 µg de SM/mL. Cuando ML1410-RFP fue
utilizada como receptora, se usó una placa de agar DHL
que contenía tanto RFP (50 µg/mL) y SM (12,5 µg/mL).
Preparación de los filtrados del cultivo. Para
confirmar la transmisión conjugativa de la resistencia a
fármacos en B. bronchiseptica, se prepararon filtrados de
cultivos a través de filtros de membrana de tamaño de
poro 0.45 µm (Millipore Co., Bedford, Mass) de la
siguiente manera: (i) un filtrado de cultivo crecido
durante toda la noche de B. bronchiseptica 0-16 y (ii) un
filtrado de un cultivo irradiado con luz ultravioleta (UV)
de 0-16. La dosis con una lámpara UV (Ultra-Violeta
Products, Inc., San Gabriel, California) fue la que dio,
aproximadamente, 0.1% de sobrevivientes.
Tratamiento con acrilflavina. La exconjugante
ML1410 R+te16, fue usada como una cepa resistente. El
tratamiento con hidrocloruro de acrilflavina (Wako Pure
Chemical Industrias, Ltd. Osaka) fue hecho con un
método que es esencialmente el mismo, propuesto por
Mitsuhashi et al. (6) y por Watanabe y Fukasawa (12).
Las células sensibles, las cuales perdieron sus marcadores
de resistencia, fueron detectadas por réplica de siembra
en placa (4). Todas las colonias que se desarrollaron en la
placa principal, pero que no crecieron en placa de réplica
fueron escogidas, y su resistencia a fármacos fue
examinada.
RESULTADOS
Resistencia a fármacos en B. bronchiseptica.
Sesenta cepas de B. bronchiseptica fueron aisladas de las
cavidades nasales de cerdos jóvenes criados en granjas de
cerdos en varios distritos en Japón, y su resistencia a
agentes antimicrobianos se analizó. De las sesenta cepas
probadas, siete resultaron ser altamente resistentes a SA,
SM, y APC, pero aún fueron sensibles a NA, RFP, TC,
CP, KM, y GM. La resistencia a fármacos de estas cepas
se muestra en la Tabla 1.
Transferibilidad conjugativa de la resistencia en B.
bronchiseptica. Siete cepas de B. bronchiseptica aisladas
de cerdos se usaron como las cepas donadoras de
resistencia a fármacos en cultivo mixto. Como se muestra
en la Tabla 2, la resistencia SM-SA-APC fue trasladada
en su conjunto a ML1410 en una frecuencia de
-7
aproximadamente 10 a 10-8 por célula donadora. Cabe
señalar que los niveles de resistencia a SM y APC fueron
inferiores en la exconjugante ML1410, en comparación
con los niveles de la cepa donadora. Del mismo modo, la
resistencia SM-SA-APC en siete cepas de B.
bronchiseptica se transfirió a la cepa sensible a fármacos:
B. bronchiseptica 114 con una frecuencia de alrededor de
10-4 y 10-5. En este caso, los niveles de SM y APC en las
exconjugantes de B. bronchiseptica 114 fueron los
mismos que aquellos de las donadoras (Tabla 3).
 Además, se encontró que la transferencia de la
resistencia a SM-SA-APC en la exconjugante ML1410
pudo ser transferida por cultivo mixto ya sea a W3630 o
ML1410 RFP. Del mismo modo, la resistencia triple de la
exconjugante B. bronchiseptica 114 resultó ser
transmisible por cultivo mixto a ML1410-RFP. Por otro
lado, la transmisión de la resistencia a SM-SA-APC no se
demostró cuando el filtrado libre de células de una cepa
resistente de B. bronchiseptica 0-16, cuya resistencia fue
transmisible por cultivo mixto, se utilizó como donadora.
Eliminación de la resistencia a fármacos. Para
confirmar que la transmisión de la resistencia a fármacos
en B. bronchiseptica está mediada por factores R, la
exconjugante ML1410 resistente a SM-SA-APC fue
tratada con acriflavina. Las muestras que fueron tratadas
con acriflavina se dividieron en dos grupos, uno fue
irradiado con una lámpara UV antes del tratamiento con
acriflavina y el otro no fue irradiado. Como se muestra en
la Tabla 4, la resistencia a SM-SA-APC pudo ser
eliminada a una frecuencia de 13-21% por tratamiento
con 5.0 µg de fármaco/mL. No se detectó segregación del
patrón de resistencia.
DISCUSIÓN
Desde el descubrimiento de los factores transferibles
de resistencia a fármacos (factores R) en Japón (5), se
han realizado numerosos estudios epidemiológicos y
genéticos sobre los factores R en diferentes partes del
mundo. La resistencia a fármacos transferible por
factores R incluye muchos fármacos útiles contra
infecciones bacterianas. En consecuencia, una
prevalencia incrementada de factores R en bacterias de
origen animal son un serio problema, no sólo por la
higiene animal, sino porque son un reto para la salud
pública.
El presente trabajo muestra que la resistencia triple a
SM-SA-APC de B. bronchiseptica se puede transferir
como una unidad a una cepa sensible de E. coli, así como
a B. bronchiseptica por cultivo mixto. Sin embargo, la
transmisión de la resistencia triple de B. Bronchiseptica
no pudo ser demostrada usando un filtrado de un cultivo
de B. bronchiseptica 0-16, cuya resistencia fue
transferible por cultivo mixto. La resistencia a SM-SA-
APC en el exconjugante ML1410, cuya resistencia fue
transferida por cultivo mixto con B. bronchiseptica 0-16,
fue eliminada por tratamiento con acriflavina. De acuerdo
con estos resultados, se podría concluir que la resistencia
SM-SA-APC en B. bronchiseptica fue mediada por
factores R.
Watanabe y Fukasawa (11) informaron que los niveles
de resistencia a SM de factores R que se originaron de
Shigellas están marcadamente disminuidos cuando se
introducen a una cepa de E. coli K-12. En el presente
estudio se encontró que el nivel de resistencia a SM es
muy alta en B. bronchiseptica, pero baja en E. coli
cuando fue transferida. La razón de esto se desconoce.
Las tetraciclinas son ampliamente utilizadas en la cría
de animales y en medicina veterinaria, como
consecuencia de su uso, es posible encontrar factores R
que llevan la resistencia a TC con alta frecuencia de
bacterias entéricas aisladas de ganado en Japón (3, 7). En
contraste, cepas de B. bronchiseptica resistentes a TC no
han sido aisladas hasta ahora. Por el contrario, cepas de
B. bronchiseptica resistentes a APC son aisladas con
considerable frecuencia, a pesar de que este fármaco no
es tan usado en la medicina veterinaria de Japón. Estas
discrepancias pueden requerir más estudios
epidemiológicos y genéticos, fundamentalmente en lo
que se refiere a la resistencia de las bacterias aisladas de
ganado. Estudios genéticos de los factores R originarios
de B. bronchiseptica se encuentran actualmente en curso
y serán descritos posteriormente.
Tablas

Tabla 1. Sensibilidad a fármacos de las cepas usadas.

a
 Concentración mínima inhibitoria (µg/mL)
  de prueba
Cepa

a
La concentración mínima inhibitoria de cada fármaco fue determinada con el método de dilución en agar.

Tabla 2. Transferencia de la resistencia a fármacos de B. bronchiseptica a E. coli ML1410 por cultivo mixto.
a
  Cultivo Mixto  
Resistencia al fármaco que fue transferido
Frecuencia de
  c
transferencia
b   Nivel de resistencia para:
  Donadora  Receptora  Patrón de
(B. bronchiseptica) (E. coli) resistencia

a
El cultivo mixto fue hecho por el método descrito en Materiales y métodos.
b
La frecuencia de transferencia fue calculada como el número de receptoras exconjugantes que adquirieron resistencia
a fármacos, divididas por el número de células donadoras.
c
La concentración mínima inhibitoria de 10 colonias examinada, demostró ser la misma en estas colonias. Se midió en
µg/ml.
Tabla 3. Transferencia de la resistencia a fármacos de B. bronchiseptica a B. bronchiseptica 114 por cultivo mixto.
a
  Cultivo Mixto   Resistencia al fármaco que fue transferido
Frecuencia de
  b
 
Nivel de resistencia para:
c
transferencia
  Donadora   Receptora   Patrón de
(B. bronchiseptica) (B. bronchiseptica) resistencia

a, b, c
Ver el pie de figura de la Tabla 2.

Tabla 4. Eliminación de la resistencia a fármacos por tratamiento con acriflavina.

Radiación Concentración No. total de Frecuencia
  de
Cepa de   de   acriflavina   de células
No.   células   de células células
No.
sensibles
  prueba
a con UV sensibles
(µg/mL) viables determinadas (%)
(s)

a
Se usó E. coli ML1410 que adquirió resistencia a fármacos por cultivo mixto con B. bronchiseptica 0-16.