Genes de Fusion Biomed - En.es

Leukemia (1999) 13, 1901-1928
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Estandarizada análisis RT-PCR de los transcritos de gen de fusión de aberraciones cromosómicas en

leucemia aguda para la detección de enfermedad residual mínima
Informe de la BIOMED-1 Acción concertada: Investigación de

enfermedad mínima residual en leucemia aguda
JJM van Dongen 1, EA Macintyre 2, JA Gabert 3, E Delabesse 2, V Rossi 4, G Saglio 5, E Gottardi 5, Un Rambaldi 6, G Dotti 6,
F Griesinger 7, Un Parreira 8, P Gameiro 8, M Gonza'lez Dia'z 9, M Malec 10, AW Langerak 1, JF San Miguel 9 y A Biondi 4
1 Departamento de Inmunología, Hospital Universitario de Rotterdam / Universidad Erasmus de Rotterdam, Rotterdam, Países Bajos; 2 Departamento de hema- tología, Hospital Necker-Enfants
Malades, París, Francia; 3 Departamento de Hematología, Instituto Paoli Calmettes, Marsella, Francia; 4 Clinica pedi- ATRICA, Ospedale San Gerardo, Monza, Italia; 5 Departamento de Ciencias
Clínicas y Biológicas de la Universidad de Turín, Ospedale San Luis Gonzaga, Orbassano-Torino, Italia; 6 Departamento de Hematología, Ospedali Riunti, Bergamo, Italia; 7 División de
Hematología-Oncología, Georg-August-Univ- ersita¨t, vaya Göttingen, Alemania; 8 Departamento de Hemato-Oncología, Instituto Portugue's Oncologia, Lisboa, Portugal; 9 Departamento de
Hematología, Hospital Clínico Universitario, Salamanca, España; y 10 Departamento de Hematología, Hospital Karolinska, Estocolmo, Suecia
Estudios prospectivos sobre la detección de la facilidad mínima residual dis- (MRD) en aberraciones; enfermedad residual mínima (ERM); Acción concertada; programa BIOMED
pacientes con leucemia aguda han demostrado que los estudios de MRD a gran escala son
factibles y que clínicamente relevante basado MRD- grupo de riesgo clasi fi cación se puede
lograr y ahora se pueden utilizar para el diseño de nuevo tratamiento protocolos. Sin
embargo, multicéntricos internacionales protocolos de tratamiento con basado en MRD fi
cación estratificación del tratamiento necesitan estandarización cuidado y control de calidad Prefacio
de las técnicas de MRD. Este fue el objetivo de la Euro-pea BIOMED-1 Acción concertada '
El seguimiento de pacientes con leucemia aguda durante y después del tratamiento

Investigación de mínimo para la presencia de células leucémicas ( 'enfermedad residual mínima', MRD)
enfermedad residual en leucemia aguda: ación standardiz- internacional y la evaluación
restante se ha demostrado que dar la penetración importante en la eficacia del
clínica 'Con los participantes de 14 tories labora- en ocho países europeos (ES, NL, PT,
tratamiento. 1-6 En particular, la (semi) medición cuantitativa de la disminución de la
IT, DE, FR, SE y AT). control de Normalización y la calidad se realizó para los tres tipos
principales de técnicas de MRD, es decir, flujo de inmunofenotipo de citometría, análisis carga de células leucémicas durante el primer fases del tratamiento tiene un alto valor
de PCR de los genes del receptor de antígeno, y el análisis de RT-PCR de bien de fi pronóstico. En la leucemia linfoblástica aguda (LLA) esta solicitud de medida MRD se
aberraciones cromosómicas Ned. Este estudio se centró en la técnica MRD último. Se ha demostrado para identificar a un grupo grande sin precedentes de los pacientes de
seleccionó un total de nueve definido aberraciones cromosómicas bien DE con bajo riesgo (40-45%), con una tasa de recaída 4 años de sólo el 2%, y un alto riesgo
transcritos de genes de fusión: t (1; 19) con E2A-PBX1, t (4; 11) con grupo (15%) con una tasa de recaída 4-años de 80%. 6 El grupo restante intermedios
riesgo tuvo una tasa de recaída global de 23%, pero en una etapa posterior durante el
tratamiento de mantenimiento de este grupo se puede dividir en un grupo
MLL-AF4, t (8; 21) con AML1-ETO, t (9; 22) con BCR-ABL p190 y BCR-ABL p210, t (12; 21)
con TEL-AML1, t (15; 17) con PML- RARA, inv (16) con CBFBMYH11, y microdeleción 1p32 MRD-negativa con una tasa de recaída del 10% y un grupo MRD-positiva con una
con 67% de tasa de recaída. 6
SILTAL1. cebadores de PCR se diseñaron de acuerdo con criterios PREDE definido para sola PCR
(cebadores externos A ↔ B) y anidados de PCR (cebadores internos C ↔ D), así como de
'desplazado' de la PCR con un cebador corriente arriba (E5 9 cebador) o aguas abajo (E3 9 cebador)
Está claro que los estudios de MRD potenciales son factibles y que clínicamente relevante
de la A externo ↔ cebadores B. Los 'desplazado' cebadores E fueron diseñados para realizar una
PCR independiente junto con uno de los cebadores internos para confirmación con fi (o exclusión) grupo de riesgo clasi fi cación basada en MRD puede lograrse y ahora se pueden utilizar para
de resultados positivos. Varios protocolos locales de RT y PCR se compararon y posteriormente el diseño de nuevos protocolos de tratamiento. Sin embargo, tocoles pro de tratamiento
un protocolo común fue diseñado, comprobado y adaptado, lo que resulta en un protocolo de internacional multicéntricos con basado en MRD fi de estratificación de tratamiento necesitan
RT-PCR estandarizado. Después de la prueba inicial (con las adaptaciones siempre que sea
estandarización cuidadosa y el control de calidad de las técnicas utilizadas para la detección
necesario) y la aprobación por dos o tres laboratorios, los cebadores fueron probados por todos
de MRD.
los laboratorios participantes, utilizando líneas 17 celulares y muestras de pacientes como
controles positivos. Esta prueba incluye la comparación con los protocolos y cebadores locales,
así como pruebas de sensibilidad a través de experimentos de dilución. Los esfuerzos de Actualmente, existen tres técnicas diferentes con su fi ciente Sensi-tividad de al
colaboración dio lugar a conjuntos de cebadores estandarizados con una sensibilidad mínima de menos 10 - 3 ( una célula leucémica entre 10 3 células normales) se utilizan para la
objetivo 10 - 2 para prácticamente todos los análisis de PCR sola, mientras que la PCR anidada detección de MRD: (1) flujo inmunofenotipo de citometría, que se basa en la
análisis generalmente alcanzó la sensibilidad objetivo mínimo de 10 - 4. El protocolo y conjuntos de
detección de fenotipos anormales o inusuales; (2) Análisis de PCR de las regiones fi
cebadores de RT-PCR estandarizados se pueden utilizar ahora para molecular clasi fi cación de la
c de unión específicos pacientes-de inmunoglobulina reordenado (Ig) o genes de
leucemia aguda en el diagnóstico y para la detección de MRD durante el seguimiento para evaluar
la efectividad del tratamiento. palabras clave: leucemia mieloide aguda (AML); leucemia linfoblástica
receptores de células T (TCR); y (3) análisis de PCR de las regiones punto de fusión
aguda (ALL); PCR; normalización; genes de fusión; cromosoma BREAK- de aberraciones cromosómicas. 7,8 Cada una de estas técnicas de MRD
tiene sus ventajas y desventajas con respecto a la complejidad técnica, aplicabilidad
y sensi- tividad, pero todos ellos necesitan estandarización y control de calidad
cuando se utiliza en estudios multicéntricos. Este fue el objetivo de la europea
BIOMED-1 Acción concertada ' Investigación de la enfermedad mini- mal residual
en leucemia aguda: estandarización internacional y la evaluación clínica '. 9 Un
total de 14 laboratorios diferentes de ocho países europeos (ES, NL, PT, IT, DE, FR,
SE y AT) participaron en este estudio colaborativo. 9 Están- dardization y control de
calidad se realizó para flujo cito-
Correspondencia: Prof. JJM van Dongen, MD, PhD, Departamento de inmu- nología, la
Universidad Erasmus de Rotterdam, PO Box 1738, 3000 DR Rotterdam, Países Bajos; Fax:
31-10-4089456 Recibido el 18 de julio de 1999; aceptado el 25 de de agosto de de 1999
Estandarizada análisis RT-PCR de los transcritos de gen de fusión
JJM van Dongen et al
1902
tabla 1 análisis de RT-PCR de los transcritos de gen de fusión en la leucemia aguda
Cromosoma objetivo RT-PCR Los controles positivos Diseño y pruebas iniciales de cebadores
aberración
Líneas celulares una Los pacientes Responsable colaborando

laboratorio laboratorio
t (1; 19) (q23; p13) E2A-PBX1 697, SUP-B27, RCH-ACV + Un Rambaldi et al Un Biondi et al
t (4; 11) (q21; q23) MLL-AF4 RS4; 11, MV4-11 + F Griesinger et al Un Biondi et al y EA
Macintyre et al
t (8; 21) (q22; q22) AML1-ETO KASUMI-1 + EA Macintyre et al F Griesinger et al y JA Gabert et
al
t (9; 22) (q34; q11) BCR-ABL p190 TOM-1, ALL / MIK + G Saglio et al Un Rambaldi et al
t (9; 22) (q34; q11) BCR-ABL p210 BV173, KCL22, K562, LAMA-84 + JA Gabert et al M Gonzalez et al
t (12; 21) (p13; q22) TEL-AML1 REH + JA Gabert et al G Saglio et al y A Biondi et
al
t (15; 17) (q22; q21) PMLRARA NB4 + Un Biondi et al P Gameiro et al
inv (16) (p13; q22) CBFBMYH11 ME-1 + EA Macintyre et al JA Gabert et al
del (1) (p32; p32) SILTAL1 CEM, RPMI8402 + EA Macintyre et al JJM van Dongen et al
una Amablemente proporcionado por el Dr. HG Drexler, Colección DSMZ-Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania (ver Ref. 40).
inmunofenotipo métrica, análisis de PCR de los genes de Ig y TCR, y el análisis Introducción

PCR de los transcritos de gen de fusión en la leucemia aguda. 9-11 Este informe
describe el éxito ación standardiz- de cebadores de PCR y protocolos de PCR para
Desde el descubrimiento del gen de fusión primero, BCR-ABL en t (9; 22), 12,13 muchas
la detección sensible de fusión transcripciones de genes de nueve aberraciones
otras aberraciones cromosómicas con genes de fusión han sido y están siendo
cromosómicas anillo frecuencia ocurran, en la leucemia aguda.
continuamente identi fi. 14-16 Los genes implicados en las aberraciones genéticas en las
leucemias agudas desempeñan un papel clave en el desarrollo y la función de las
células linfoides y mieloides. Ellos codifican frecuentemente tores de transcripción fac-,
una
sino también reguladores del ciclo celular, moléculas de transducción de señales,
receptores, o moléculas de Ig y TCR. 14,17
Varios estudios clínicos han demostrado que el cromosoma aberración raciones en

ALL y la leucemia mieloide aguda (AML) puede ser utilizado para el grupo de riesgo
UNA segundo
clasi fi cación. 18-22 Por ejemplo, t (9; 22) y 11q23 aberraciones tales como t (4; 11) en
do re todas están asociadas con un mal pronóstico, 18,19,21 mientras que t (12; 21) en ALL, así
E3' como t (8; 21), t (15; 17) e inv (16) en AML están asociados con buen pronóstico. 19,20,23,24
Además de esto citogenética / molecular clasi fi cación de la leucemia aguda en el
diagnóstico, aberraciones cromosómicas con las regiones de genes de fusión fi c
leucemia especí también se pueden usar como dianas de PCR para la detección de
MRD durante si- bajo plano, con sensibilidades de 10 - 3 a 10 - 6.7,8
UNA B1 B2 análisis de PCR de los genes de fusión se basa en el diseño de cebadores

gonucleotide oli- en lados opuestos de las regiones de fusión de punto de interrupción de
do D1 D2
modo que el producto de PCR contiene las secuencias de fusión fi específicos de tumores.
E5'
En la mayoría de tipos de aberraciones cromosómicas con genes de fusión de los puntos
cb de interrupción en diferentes pacientes se extienden por 10 kb o más, las distancias que

son culto fi dif para cubrir por PCR de ADN sobre una base rutinaria. Esto implicaría que
los sitios de recombinación de punto de interrupción precisas a nivel de ADN tienen que ser
determinada para cada paciente individual, con el fin de realizar análisis de PCR sensible
fiable. Sin embargo, en muchas leucemias agudas, el gen de fusión se transcribe en un
ARNm de fusión, que puede servir como el objetivo de PCR después de la transcripción
A2 A1 B inversa (RT) en ADNc.
C2 C1 D
E3'
Los controles de normalización y de calidad en este estudio se centró en nueve
definido aberraciones bien de cromosoma con los transcritos del gen de fusión, que
Figura 1 Tres posibilidades de diseño de cebadores para la detección de RT-PCR
se producen con frecuencia en mia leuke- aguda: t (1; 19) (q23; p13) con el E2A-PBX1
de los transcritos de gen de fusión, depende de la presencia o ausencia de más de una región de
gen de fusión, 25,26
rotura de conglomerados en uno de los dos socios de genes de fusión. (A) En principio para cada
gen de fusión de transcripción dos cebadores externos (A y B), dos cebadores internos (C y D), y un t (4; 11) (q21; q23) con el MLL-AF4 gen de fusión, 27-29
'cambió' cebador (E cebador) fueron diseñados (ver texto). (B) Si más de una región de
t (8; 21) (q22; q22) con el AML1-ETO gen de fusión, 30,31 los dos tipos principales de
agrupamiento de punto Break- se produce en el socio de fusión de genes aguas abajo, los
t (9; 22) (q34; q11) con BCR-ABL fusión
cebadores D B adicional y fueron diseñados. (C) Si más de una región de rotura de conglomerados
se produce en el socio gen de fusión aguas arriba, cebadores adicionales A y C fueron diseñados.
genes, 12,13,32 t (12; 21) (p13; q22) con el TEL-AML1 gen de fusión, 33,34 t (15; 17) (q22;
q21) con el PMLRARA gen de fusión, 35,36 inv (16) (p13; q22) con el CBFBMYH11 fusión
1903
gene, 37 y la microdeleción en 1p32 intracromosómica con el SILTAL1 gen de fusión. 38,39 Tabla 2 referencias de bases de datos por gen
Se decidió que la normalización y el control de calidad debería no sólo se refieren Cromosoma Gen Fecha de adhesión
a los cebadores, sino también la reacción de RT y el protocolo de PCR, así como el aberración número
uso de controles positivos comunes (líneas celulares y algunas muestras de los

pacientes) y un control negativo común (célula HL60 línea) (Tabla 1). 40 t (1; 19) E2A HUME12A M31222 07 Nov de 1994
PBX1 HUMPBX1AB M86546 07 Ene de 1995
t (4; 11) MLL HUMHRX L04284 31 de diciembre 1994
AF4 HUMAF4Y L13773 31 de diciembre 1994
Diseño de cebadores para el análisis de RT-PCR t (8; 21) AML1 HUMAML1C D43969 11 Oct de 1996
ETO HUMMTG8 D14289 27 de Ene de 1993
El estudio de colaboración destinado a la colocación de los cebadores en una forma t (9; 22) BCR HSBCRR X02596 02 Jun de 1994
tal que pueden ser utilizados en varios tipos diferentes de PCR clásica se acerca ABL HSABL X16416 12 de septiembre 1993
(Figura 1).
t (12; 21) TEL HSU11732 U11732 17 de julio 1994
AML1 HUMAML1C D43969 11 Oct de 1996
t (15; 17) LMP HUMPML M73778 08 Ene de 1995

(1) PCR para molecular genética clasi fi cación de la leucemia aguda en diagnóstico:
RARA HSRAR X06538 12 de septiembre 1993
Esto se realiza generalmente mediante PCR sola
(Cebadores A ↔ B) seguido por electroforesis en gel de agarosa o electroforesis en gel inv (16) CBFB HUMCBFB L20298 28 de septiembre 1993
MYH11 HUMMHCAAA D10667 18 de Ene de 1996

de poliacrilamida para la detección de PCR productos de un tamaño particular.
Alternativamente, electroforesis en gel seguidas de transferencia e hibridación con una del (1p32) SIL HUMSIL M74558 13 Ene de 1995
sonda de oligonucleótido (por ejemplo cebador interno) también se puede realizar para TAL1 S53245 S53245 07 de mayo de de 1993
fiable identificación de producto de PCR.
Después de los procedimientos de diseño y las pruebas iniciales en paralelo de

(2) PCR sensible para la detección de MRD: Esto puede ser conjuntos de cebadores antiguos y nuevos, directrices especiales se han desarrollado
logrado por PCR anidada con un conjunto de cebadores externos (A ↔ para el diseño del cebador con el programa de software OLIGO5.0 (Dr Wojciech
B) y cebadores internos (C ↔ D), seguido de la evaluación del tamaño de los Rychlik, Cascade, CO, EE.UU.): (1) La fusión temperatura (Tm ) debe ser 70-75 ° C
productos de PCR obtenidos en gel de agarosa trophoreses elec- o electroforesis en (preferiblemente 70-72 ° DO). Los cálculos de Tm deben ser de acuerdo con el método
gel de poliacrilamida. del vecino más cercano teniendo en cuenta acordado condiciones de PCR como la
concentración de sal, etc: cebador directo: 400 n metro; cebador inverso: 400 n metro; catión
monovalente: 50 m metro; libre de Mg 2+: 1,7 m metro. ( 2) El contenido de GC del producto
(3) Control de PCR para la confirmación o para la exclusión de los resultados tivas posiciones falsas: de PCR debe ser, 70%. (3) La re valores G de la 3 9 final de cada cebador debe ser
control o con fi rmación adicional de los resultados puede ser relativamente baja, es decir, 3 9 pentámeros terminales deben ser menos estables que - 9
obtenido mediante el uso de dos de un solo PCR independiente analiza con dos conjuntos de kcal / mol para evitar falsas cebado. (4) La re Tm (Tm de PCR menos producto Tm de
cebadores diferentes (A ↔ B más C ↔ E3 9 o E5 9 ↔ D), que dan como resultado en parte los cebadores) debe ser, 24 ° C. (5) debe ocurrir No formación de horquilla,
superpuestos (productos de la PCR 'desplazado') (Figura 1). Los cebadores 'desplazado' especialmente en el 3 9 fin. (6) El más estable 3 9 terminal de dímero no debe exceder - 4
deben colocarse aguas arriba (E5 9 cebador) o aguas abajo (E3 9 cebador) de la A externo ↔ kcal / mol; el dímero global más estable no es tan importante. (7) La posición de los
cebadores debe ser como en la Figura 1, dando como resultado productos de PCR de
cebadores B, dependientes por ejemplo, sobre la idoneidad de las secuencias aguas arriba tamaño limitado: cebadores externos A
y aguas abajo para el diseño de cebadores. A fin de reducir el riesgo de contaminación, el
uso de los cebadores E 'desplazado' debe limitarse a la confirmación de los resultados
positivos obtenidos con la A ↔ cebadores B.
↔ B debería dar como resultado productos de PCR de 200-600 pb; los cebadores
En algunas aberraciones cromosómicas de la región de corte se extiende por varios internos C ↔ D en productos de PCR de 120-350 pb; y los cebadores desplazado E5 9 ↔ D
intrones, mientras que en otras aberraciones se producen varias regiones de corte. En o C ↔ E3 9 en productos de PCR de 200- 600 pb. (8) En principio, los cebadores aguas
consecuencia, las correspondientes transcripciones de genes de fusión tendrán arriba A, C y E5 9
diferentes composiciones exón, que no podría fácilmente ser cubiertos por el mismo son de sentido, mientras que los cebadores aguas abajo B, D y E3 9 son anti-sentido.
conjunto de cebadores de PCR. detección de RT-PCR de dichas transcripciones de
genes de fusión requiere el diseño de cebadores adicionales, que están situados más Basándose en las secuencias de la línea germinal publicadas de los genes normales
aguas abajo (Figura 1b) o aguas arriba (Figura 1c), como en el caso de t (9; 22), inv (16) involucradas, hicimos secuencias de transcripción de fusión virtuales, que fueron utilizados para los
y t ( 15; 17). Por estas translocaciones, siete cebadores tenían que ser diseñado, procedimientos de diseño de cebadores. Las referencias de bases de datos de las secuencias de la
mientras que para las otras translocaciones el diseño de cinco cebadores fue su fi ciente. línea germinal utilizadas se dan en la Tabla 2.
En t (9; 22), los dos tipos principales de regiones de rotura de conglomerados en el BCR gen
están asociadas con diferentes categorías de enfermedad, es decir, todos y leucemia
mieloide crónica (CML). 12,13 Por lo tanto, se tratan por separado en este informe como t
(9; 22) BCR-ABL p190 (que se producen casi exclusivamente en ALL) y como t (9; 22) BCR-ABL
Protocolo de RT-PCR
Durante las primeras reuniones de la BIOMED-1 Acción concertada, varios

protocolos locales de RT y PCR se compararon con el fin de comprender la lógica
p210 (que se encuentran en prácticamente todos los LMC y un poco de todo). 12,13 Como de cada diferencia y tomar ventaja de la experiencia de cada laboratorio.
consecuencia, dos conjuntos diferentes de BCR cebadores sino un único conjunto de ABL se Posteriormente, un protocolo común fue diseñado, comprobado y adaptado de
diseñaron los cebadores para el análisis de PCR de las dos t (9; 22) variantes (ver las secciones 4 y nuevo resultante en el protocolo de RT-PCR estandarizado (Tabla 3),
5).
1904
Tabla 3 Protocolo de RT-PCR estandarizado Las muestras de ARN se precipitó con etanol sequently se distribuyeron a todos los
laboratorios participantes. La prueba de imprimación se perfor- med a través de
1. RT-reacción con hexámeros aleatorios experimentos de dilución (de ARN en ARN), en el que se diluyó la paciente ARN o línea
• 1 metro g de RNA (o 0,1 metro g de ARNm) en 9,5 metro l de H 2 O
celular de ARN en HL60 RNA como control negativo. La dilución se llevó a cabo en
• incubación a 70 ° C durante 10 min
pasos de 10 veces, desde sin diluir a 10 - 6 o 10 - 7.
• enfriar en hielo y añadir otros reactivos a FI volumen final de 20 metro l:
tampón de RT: 20 m METRO Tris HCl, 50 m METRO KCl, pH 8,3 MgCl 2: 5 m METRO
Los objetivos de la prueba y la normalización fueron obtener resultados claramente
TDT: 10 m METRO positivos PCR sin c fondo aspeci fi, lo que podría dificultar la interpretación de los
hexámeros aleatorios: 5 metro METRO resultados, y para alcanzar la sensibilidad fi ciente para cada conjunto de cebadores en los
RNAasin: 20 unidades
experimentos de dilución con un ARN de línea celular y el ARN del paciente. Estamos
enzima RT: 200 unidades superíndice (200 unidades por metro l) dNTP: 1 m METRO
encaminados a una sensibilidad objetivo de al menos 10 - 2 para una sola PCR con la A ↔ ANTES
DE CRISTO ↔ D, C ↔ E3 9, y E5 9 ↔ cebadores D y a una sensibilidad objetivo de al menos
• temperaturas y tiempos de incubación:
temperatura ambiente durante 10 min 42 ° C 10 - 4 para la PCR anidada con A ↔ B más C ↔ cebadores d.
durante 45 min 99 ° C durante 3 min 4 ° C al final
de la RT paso
Tan pronto como los laboratorios encargados habían aprobado los conjuntos de
cebadores, los conjuntos de cebadores combinados para todos los nueve aberraciones
2. Single PCR o primera ronda de PCR anidada
cromosómicas fueron enviados a cada laboratorio participante. Nuevos experimentos de
• fi nal volumen de 50 metro l
• 2-3 metro l de cDNA (es decir, 10-15% de la mezcla de RT) dilución fueron realizadas por todos los laboratorios para cada aberración cromosómica. Tan
• cebadores: 400 n METRO concentración final pronto como al menos el 70% de los laboratorios alcanzó la sensibilidad objetivo mínimo, el
• dNTP: 200 metro METRO concentración final conjunto de cebadores fue aprobado. En algunos casos, esto era difícil y nuevos cebadores
• tampón de PCR: 20 m METRO Tris HCl, 50 m METRO KCl, pH 8,3
fueron diseñados.
• MgCl 2: 2,5 m M ( para ser optimizado en cada laboratorio)
• Taq enzima una: 1 unidad por 50 metro l de volumen segundo
Intercambio de personal entre los conservadores que participan boratorios y un total
3. temperaturas y tiempos de ciclo de PCR de nueve sesiones (mayo de 1994 en Lisboa, fe- brero de 1995 en Münster, octubre de
• inicial de fusión: 95 ° C durante 30 s 1995 en Monza, mayo de 1996 en Estocolmo, octubre de 1996 en París, noviembre de
• ciclos de PCR do: 1996 en la putrefacción terdam, abril de 1997 en Lisboa, noviembre de 1997 en
94 ° C durante 30 s (de fusión) segundo
Salamanca, y julio de 1998 en Rotterdam) fueron necesarios para completar el estudio
sesenta y cinco ° C durante 60 s (recocido) 72 ° C
en colaboración. Los resultados de este esfuerzo de colaboración se describen por
durante 60 s (extensión)
• Número de ciclos: 35
aberración cromosómica por los científicos responsables en nueve secciones.
• sin extensión final necesaria
• dejar de PCR: 16 ° C (o temperatura ambiente) re
4. Segunda ronda de PCR para la PCR anidada

• 1 metro l de primera ronda de PCR
• mismo volumen, reactivos y condiciones de ciclo como, por primera ronda de PCR,
utilizando el interna (anidada) C ↔ cebadores D SECCIÓN 1. t (1; 19) (q23; p13) con el E2A-PBX1 gen de fusión
una Durante la fase final del estudio parecía que el uso de amplifica Taq Gold (PE Biosystems,
Foster City, CA, EE.UU.) mejora aún más la sensibilidad. Un Rambaldi 1, M Ruggeri 1, C Manzoni 1, O Spinelli 1,
G Dotti 1, V Rossi 2, Un Rivolta 2 y A Biondi 2 1 Departamento de Hematología,
segundo Si el contenido de GC del producto de PCR es alta (0,70%), se aconseja el uso de 2 unidades
Ospedali Riunti, Bérgamo; y
de Taq de enzima por 50 metro l y para aumentar la temperatura de fusión a 95 ° DO.
2 Clinica Pediatrica, Ospedale San Gerardo, Monza, Italia
do Los fusión, hibridación y extensión tiempos pueden acortarse, si se utiliza una nueva
generación de rápida máquina de PCR.

re Para la evaluación de los productos de PCR, 15 metro l de la mezcla de PCR se usa para
electroforesis en gel de agarosa. Fondo
La t (1; 19) (q23; p13) fue primero reportada en 1984 por diferentes grupos en
que se utilizó en todos los laboratorios de todo el ensayo de los conjuntos de algunos casos de pre-B-ALL 41-43 y los datos de la literatura hasta ahora informaron
cebadores de nuevo diseño. indican que esta translocación se puede encontrar en un equilibrado (25%) o forma
desequilibrada (75%) - 19,
+ der (19) t (1; 19) en la que dos cromosomas normales 1 están presentes. La t (1; 19)
procedimientos de prueba y de normalización se detecta en aproximadamente el 5-6% de la LLA infantil y en aproximadamente el
3% de los adultos ALL. 42,44-47 En ambos pacientes pediátricos y adultos esta
Para cada aberración cromosómica, dos o tres laboratorios realizan el diseño y translocación se produce casi exclusivamente en pre-B-ALL que expresan Ig
ensayo inicial de los nuevos mers pri- PCR (Tabla 1). El ensayo se realizó en paralelo citoplásmica metro, aunque se ha informado de forma esporádica en pro-B-ALL y
con cebadores y protocolos disponibles localmente PCR. Además de materiales de común ALL (, 1%), así como en casos raros de T-ALL y AML. 44,45 La mayoría de los
pacientes disponibles a nivel local, se usó el mismo conjunto de 17 líneas de células casos que llevan el t (1; 19) expresan un inmunofenotipo típico con expresión
como controles positivos estándar en todos los laboratorios (tabla 1). Las 17 líneas homogénea de CD19, CD10, CD9, completa ausencia de CD34, y al menos ausencia
celulares con bien de fi aberraciones cromosómicas Ned fueron proporcionados parcial de CD20. 48 Además, el t (1; 19) se correlaciona con la presencia de
amablemente por el estudio de colaboración por el Dr. HG Drexler (Colección características de alto riesgo clínicos conocidos, tales como el recuento de células
DSMZ-Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania). 40 elevada, los niveles de lactato deshidrogenasa alta de suero y la implicación del
culturalmente extracción de ING y el ARN a gran escala se llevó a cabo en Rotterdam sistema nervioso central. 44
y sub-
una 1905
una paciente
E2A ( 19p13)
MWM
10- 1
10- 2
10- 3
10- 4
10- 5
10- 6
10 0
HO2
1 234 56 7 8910 111213 1415a 15b 16
pb
CEN tel
región de corte
~ 3,5 kb
PBX1 ( 1q23)
1 23 45678
373 -
CEN tel
región de corte
~ 50 kb
E2A-PBX1
↔ A-B
segundo
segundo paciente
13 2
MWM
10- 1
10- 2
10- 3
10- 4
10- 5
10- 6
10 0
HO2
1518 388
pb
13 2
27
100 pb
E2A-A 1 PBX1
434 B-675
E2A-C PBX1 401 -

1479 D-636
PBX1-E3'
748
E2A-PBX1
↔ C-E3'
Figura 2 (A) Diagrama esquemático de la estructura exón / intrón del
E2A y PBX1 genes, que están involucrados en t (1; 19) (q23; p13). El centrómero (CEN) y la do línea celular 697
orientación de los telómeros (TEL), la numeración de exón, y las regiones de corte
MWM
correspondientes se indican. (B) Diagrama esquemático de la clásica E2A-PBX1 transcrito de
10- 1
10- 2
10- 3
10- 4
10- 5
10- 6
10 0
HO2
fusión (superior) y la variante de transcripción (inferior) con una inserción de 27 nucleoides (ver
Refs 50-51). Los números bajo el transcrito de gen de fusión se refieren a los primeros (5 9) marea pb
Núcleo- del exón involucrados, excepto cuando el último (3 9) de nucleótidos del gen aguas arriba
se indica. Las flechas indican la posición relativa de los cebadores; los números se refieren a la 5 9
posición de nucleótidos de cada cebador (véase la Tabla 4).
289 -
Tabla 4 Los cebadores para el análisis de RT-PCR de t (1; 19) (q23; p13) con el
E2A-PBX1 gen de fusión
E2A-PBX1
↔ C-D (anidada)
código de imprimación 5 9 Posición una secuencia 5 9 -3 9
(tamaño) figura 3 El bromuro de etidio-manchado geles de agarosa que muestran dilución
los experimentos con una sola A ↔ B PCR (a), se desplazó C ↔ E3 9 PCR (b), y PCR anidada (c)
usando ARN de t (1; 19) pacientes positivas o la línea 697 de células. Un tubo sin RNA se utilizó
E2A-A 1434 (19) CACCAGCCTCATGCACAAC
como control negativo (H 2 O).
PBX-B 675 (19) TCGCAGGAGATTCATCACG
E2A-C 1479 (19) CACCCTCCCTGACCTGTCT
PBX-D 636 (19) GGCCTGCTCGTATTTCTCC
PBX-E3 9 748 (19) TGAACTTGCGGTGGATGAT
una Véase la Tabla 2 para obtener información secuencia completa. Tabla 5 Los tamaños de los productos de PCR y registrar las sensibilidades de E2A-PBX1
conjuntos de cebadores en las pruebas de RT-PCR
Como se muestra en la figura 2a esta translocación implica la E2A UNA ↔ segundo do ↔ re UNA ↔ segundo do ↔ E3 9
+ do ↔ re
gen en el cromosoma 19 (banda p13.2-p13.3) y la PBX1
gen (también conocido como PRL) en el cromosoma 1 (q23). 25,26,49 La organización
Los tamaños de los productos de PCR en pb
genómica de E2A está bien definido-de fi y puntos de interrupción se produce casi
estándar 373 289 289 401
exclusivamente en una región intrón de 3,5 kb entre el exón 13 y 14. 25,26,49 La
variante (+ 27bp) una 400 316 316 428
organización genómica de la PBX1
gen no está todavía completamente conocido y los puntos de ruptura están dispersos a través de una
697 - 3 - 4 - 5 - 3
región intrónica de aproximadamente 50 kb entre los exones 1 y
SUP-B27 - 3 - 4 - 5 - 3
2. 25,26,49 En la mayoría de los casos las E2A-PBX1 fusión tran- guión muestra un sitio RCH-ACV - 3 - 3 - 4 - 3
de unión constante del exón 13 (nucleótido Los pacientes - 4 - 4 - 5 - 3
1518) de E2A 26 para el segundo exón (nucleótido 388) de PBX1
variante de empalme con la inserción de 27 pb.
(KA Monica, resultados no publicados, número de acceso M86546) una
1906
(Figura 2b). Una variante de transcripción de fusión se describe en capacidad de unión al ADN hemimethylated se encuentra en el 5 9
aproximadamente 5-10% de t (1; 19) -positivo ALL. 50-52 Se caracteriza por un tramo porción de la proteína codificada por el exón 8. Un dominio de dedo de cinc está
de 27 nucleótidos insertada en el punto de unión usual entre los nucleótidos 1518 y codificado por los exones 11 a 16 y de dominio rax homología una drosophila tritho-
388 de la E2A y PBX1 está situado en el 3 9 parte del gen.
genes, respectivamente (Figura 2b). Estos nucleótidos adicionales, que son los MLL gen se ha encontrado a participar en aproximadamente 30 translocaciones
idénticos en cada caso, parecen surgir de un exón diferen- entially empalmada de diferentes, de los cuales aproximadamente 20 con identi fi genes asociados ed. 15 Aunque
cualquiera E2A o PBX1 genes, pero su derivación exacta aún se desconoce. 50-52 algunas de las parejas de fusión se trata puede compartir una homología de secuencia,
los socios de fusión de completamente diferentes propiedades funcionales predichos
se han caracterizado. MLL genes de fusión se encuentran en precursor- B-ALL, AML,
síndrome mielodisplásico (MDS), algunos casos de T-ALL, y en la leucemia
secundaria. 60-66
Los resultados de diseño de cebadores PCR y pruebas
La Tabla 4 muestra la posición y la secuencia de cada tivo relación imprimación a la E2A Además de MLL genes de fusión generadas por translocaciones, deleciones del
y PBX1 genes. Primer E2A-A, derivada de exón 11 se han asociado con T-ALL 67 y duplicaciones en tándem del gen se han
E2A exón del gen 13 y el cebador PBX-B, derivado de PBX1 exón gen 2, se utilizaron en observado en tanto
un primer ciclo de PCR utilizando el protocolo estandarizado PCR del proyecto de novo y LMA secundaria 68 así como en células de sangre periférica y
mononucleares de médula ósea normales. 69
BIOMED-1. Esta primera ronda de PCR alcanza un nivel de sensibilidad de 10 - 3 / 10 - 4, cuando
el ensayo se forma per- utilizando ARN obtenido a partir de líneas de control de células los AF4 gen se compone de 20 exones y codifica una proteína
(697, SUP- B27, RCH-ACV), así como todos los pacientes. Cuando una segunda ronda serina-prolina-rico. 28,70 La función de esta proteína no ha sido determinada, y los
de la amplificación fi se realiza usando los cebadores internos E2A-C y PBX-D, un nivel dominios funcionales no están bien caracterizadas.
de sensibilidad reproducible de 10 - 4 / 10 - 5
MLL-AF4 genes de fusión se han encontrado en prácticamente todos t (4; 11) y en
se obtiene en ambas líneas celulares y todos los pacientes (Tabla 5). Los productos de PCR se un número no puede significante de casos en que el t (4; 11) no fue detectado por
ejecutan en 1.5% geles de agarosa y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio aparecen citogenética convencional. 57 Recíproco
como bandas claras de 373 pb y 289 pb para la primera y la PCR anidada, respectivamente. No AF4-MLL transcripciones se han encontrado en el 70% de los casos. 57 En contraste con
hay bandas adicionales se encuentran por lo general con la posible excepción de una pequeña la t (8; 21) o la t (12; 21), donde se observan, por lo menos 10 diferentes sólo uno o dos
banda de tamaño que ocurre de vez en cuando a una dilución de 10 - 5 ( Figura transcripciones variante de fusión
MLL-AF4 transcritos de fusión se han encontrado, debido a los puntos de BREAK- en
3). Finalmente, la PCR desplazado empleando el cebador de E2A-C y PBX-E3 9, utilizado diferentes intrones (Figura 4A). Además, diferencial de empalme es un fenómeno común,
dando lugar a más de una transcripción de fusión en una leucemia. Todos los transcritos
para excluir resultados falsos positivos, genera una banda clara de 401 pb con una
de fusión descritas en este documento son en marco (Figura 4b). 57
sensibilidad de al menos 10 - 2, cuando se usa ARN a partir de líneas celulares y todos los
pacientes (Figura 3b).
La principal región de corte de la MLL gen ha sido bien caracterizado y está
situado en una Bam fragmento HI de 8,3 kb. Los puntos de corte se agrupan en la
región de 6,5 kb entre los exones 8 y 12 (Figura 4a); rotura ocurre más
frecuentemente en intrones 9 y 10 en pediátrica y de adultos ALL, y en el intrón 11 en
SECCIÓN 2. t (4; 11) (q21; q23) con el MLL-AF4 gen de fusión
LLA infantil, dando lugar a genes de fusión que implican los exones 9 y 10 en adultos
y pacientes pediátricos, y el exón 11 en los recién nacidos (Figura 4b). 71 La región de
F Griesinger 1, Un Biondi 2, EA Macintyre 3, E Delabesse 3, rotura de conglomerados de la AF4 gen es más grande, que abarca una región de 40
V Rossi 2, Un Rivolta 2 y S Schnittger 1 1 División de Hematología-Oncología, kb (Figura 4a). El punto de fusión más frecuente en MLL-AF4 genes de fusión es el
Georg-agosto-Universität, vaya Göttingen, Alemania; 2 Clinica Pediatrica, exón 4; en casos raros los exones 5, 6 y 7 se fusionan con el MLL gen (Figura 4b).
Universita' Milano, Ospedale San Gerardo, Monza, Italia; y 3 Departamento

de Hematología, Hospital Necker-Enfants Malades, París, Francia
MLL-AF4 ha sido ed fi identi como un tor fac- pronóstico adverso en la leucemia
infantil por varios grupos de estudio. 19,53,72,73 Además, se ha asociado con un mal
pronóstico en los adultos, pero el pronóstico parece haber mejorado con la
introducción de altas dosis de Ara-C en la terapia de inducción de la LLA en adultos. 54
En los casos pediátricos, hay algunos indicios de que los diferentes grupos de
Fondo edades tienen diferentes pronósticos. 19,53 Si existe una correlación con los diferentes
tipos de MLL-AF4 genes de fusión todavía no está claro.
Los estudios moleculares han demostrado que t (4; 11) (q21; q23) implica la MLL
(HRX, Htrx) y AF4 (FEL) genes. 27-29 MLL-AF4- leucemias extremo positivo se
observan en el 50-70% de los lactantes todos los casos y en aproximadamente el
5% de los niños y adultos todos los casos. 19,53,54 La presencia de al (4; 11) (q21; q23) Tabla 6 Los cebadores para el análisis de RT-PCR de t (4; 11) (q21; q23) con el
MLL-AF4 gen de fusión
ha sido asociados con el pro-B-ALL fenotipo (CyCD79a +, CD19 +, CD10 -, CD24 -) 54,55
y con la coexpresión de antígenos de diferenciación mieloides (CD15 y CD65) 55-57 así
código de imprimación 5 9 Posición una Secuencia (5 9 -3 9)
como el antígeno NG2. 58 La t (4; 11) (q21; q23) fusiona el 5 9 Una porcion de MLL al
(tamaño)
3 9 Una porcion de AF4 ( Figura 4).
MLL-A 3916 (17) CCGCCTCAGCCACCTAC

AF4-B 1714 (20) TGTCACTGAGCTGAAGGTCG
los MLL gen se compone de 37 exones que abarcan una región de .1 MB. Hay MLL-C 3936 (18) AGGACCGCCAAGAAAAGA
dos sistemas de numeración de los exones; el sistema más reciente se utiliza en AF4-D 1677 (20) CGTTCCTTGCTGAGAATTTG
este informe (Figura 4). 59 La proteína MLL contiene una región de tres AT-ganchos, MLL-E5 9 3793 (18) AAGCCCGTCGAGGAAAAG
que tienen capacidad de unión al surco menor del ADN. Un dominio con
una Véase la Tabla 2 para obtener información secuencia completa.
una 1907
MLL ( 11q23)
1 2 3 4 5 6 7 891011 12 - 161718 2122
- 27 28-29 31 32 - 33 36- 37
CEN tel
~ 6,5 kb
AF4 ( 4q21)
1a 1b 23 4 sesenta 7
y cinco 89 10 11 12 15
- dieciséis- 19 20
CEN tel
región de corte
~ 40 kb región de corte
segundo
frecuencia
e8-e7 raras los
bebés no
tipo 7 8 9 <10% lactantes
4012 1628 1683 1738
e8-e4 8 4 5 6 raro <5%
7 8 9
1459 1504 1591
e9-e5 8 9 5 6 7 8 9 <10% 16%
4013 4086 6
e9-e4 8 9 5 7 8 9 raro 25%
e10-e6 8 9 10 raro <5%

6
7 8 9
4087 4218
e10-e5 8 9 10 5 <10% <5%
3936 8
e10-e4 8 9 10 7 8 9 18% 39%
E11-e6 8 9 10 11 5 6 7 8 9 raro <5%
6
7 8 9
4219 4332
E11-e5 8 9 10 11 5 6 7 8 9 <10% rara
E11-e4 8 9 10 11 4 5 6 7 8 9 55% <5%
100 pb MLL-A 3 AF4-B

916 1714
MLL-C AF4-D
1677
MLL-E5'
3793
Figura 4 Diagrama esquemático de la estructura exón / intrón del MLL y AF4 genes, que están involucrados en t (4; 11) (q21; q23). el centrómero
(CEN) y de los telómeros (TEL) orientación, la numeración de exón, y las regiones de corte correspondientes se indican. (B) Diagrama esquemático de los diversos tipos de MLL-AF4 transcritos de fusión. Los
números debajo de los transcritos del gen de fusión se refieren a los primeros (5 9) de nucleótidos del exón implicados, excepto cuando el último (3 9) de nucleótidos del gen aguas arriba se indica. Las
frecuencias relativas de los transcritos de fusión difieren entre lactantes y no lactantes (niños y adultos) y son causadas por diferencias en la ubicación de los puntos de interrupción (véase el texto). Las
flechas indican la posición relativa de los cebadores, que pueden amplificar todos los transcritos de fusión indicados; los números se refieren a la 5 9 posición de nucleótidos de cada cebador (véase la Tabla
6).
1908 una MV4-11 línea celular están disponibles para la monitorización de MRD en pacientes con la t (4; 11) Sólo los
datos limitados por análisis molecular. Los pocos casos que se han estudiado hasta ahora,
MWM
HL60
10- 1
10- 2
10- 3
10- 4
10- 5
10- 6
10 0
HO2
sugieren, que la MLL-AF4 gen de fusión desaparece por debajo del umbral de sensibilidad en
pb
pacientes que permanecieron en remisión completa continua. 74,75 Sin embargo, más
pacientes necesitan ser estudiados con el fin de sacar conclusiones final.

468 -
Los cebadores para la detección de MLL-AF4 transcripciones fueron diseñados en MLL exón
8 y AF4 el exón 7, que permite la detec- ción de todos conocida MLL-AF4 transcripciones
de genes de fusión (Figura 4b). La información de la secuencia del cebador exacto y la
MLL-E5' ↔ AF4-D posición de los cebadores se resumen en la Tabla 6.
Individual PCR con A ↔ ANTES DE CRISTO ↔ D, y E5 9 ↔ D conjuntos de cebadores

segundo RS4 línea celular; 11
alcanzaron sensibilidades de 10 - 3 en el caso de la RS4; 11 y MV4-11 líneas celulares y 10 - 2 en
MWM
el caso de los pacientes (Figura 5). La PCR anidada dio lugar a sensibilidades de 10 - 4 a 10 - 5
HL60
10- 1
10- 2
10- 3
10- 4
10- 5
10- 6
HO2 ( La Figura 5 y la Tabla 7).

pb
SECCIÓN 3. t (8; 21) (q22; q22) con el AML1-ETO gen de fusión
502 -
E Delabesse 1, F Griesinger 2, JA Gabert 3, Y Toiron 3,
P Villarese 1 y EA Macintyre 1 1 Departamento de Hematología, Hospital
Necker-Enfants Malades, París, Francia; 2 División de Hematología-Oncología,
Georg-August-Universität, vaya Göttingen, Alemania; y
MLL-AF4↔C-D (anidada)
3 Departamento de Hematología, Institut Paoli Calmettes, Marsella,
Figura 5 El bromuro de etidio-manchado geles de agarosa que muestran dilución Francia

experimentos con el 'desplazado' E ↔ D PCR (a) y la PCR anidada (b), usando ARN de la t (4;
11) líneas de células positivas MV4-11 y RS4; 11, respectivamente. HL60 ARN y H 2 O se Fondo
utilizaron como controles negativos. La C ↔ conjunto D cebador dio un gran fondo banda fi c
aspeci, que podría ser fácilmente discriminado de las correctas 502 productos de PCR pb. La t (8; 21) (q22; q22) fue primero descrita en 1973. 76 Se encuentra principalmente en de
novo AML de subtipo FAB-M2 y ha sido identificados en la línea celular Kasumi-1,
derivado de un paciente con AML-M2 en la recaída. 77 La t (8; 21) funde el AML1 gen
(leucemia mieloide aguda 1 gen), también identificado como ed PEBP2a ( polioma
promotor de la proteína de unión 2 de la subunidad a) o CBFA2 ( de unión central
subunidad del factor A2) a la ETO gen (ocho veintiuno gen), también identificado como ed
CDR ( ciclina D-relacionado con el gen) o MTG8
(Gen de translocación mieloide en el cromosoma 8). los AML1

Tabla 7 Los tamaños de los productos de PCR y registrar las sensibilidades de MLL-AF4 gen se compone de nueve exones que abarca una región de 150 kb y el ETO gen
se compone de 13 exones, abarca 87 kb (Figura 6a).
UNA ↔ segundo do ↔ re UNA ↔ segundo E5 9 ↔ re

los AML1 gen no sólo está implicado en t (8; 21), sino también en varias otras
+ do ↔ re
translocaciones, incluyendo t (3; 21) (q26.2; q22) con fusión a EVI1, EAP o MDS1, t
(12; 21) (p13; q22) con la fusión para TEL ( también llamado ETV6), y t (16; 21) con la
fusión para
e8-e7 184 127 127 270
e8-e4 353 296 296 439
MTG16. 78-80 Otras bandas cromosómicas han demostrado ser reorganizado a la AML1
e9-e5 382 325 325 468
locus, incluyendo 1p36, 5q13, 14q22, 15q22, 17q11 y 20p13. 81,82
e9-e4 427 370 370 513
e10-e6 427 370 370 513 AML1-ETO transcritos de fusión se encuentran por RT-PCR en virtualmente todos
e10-e5 514 457 457 600
los casos de t (8; 21) -positivo AML. Generan productos de PCR predominante de un
e10-e4 559 502 502 645
tamaño constante, que corresponde a una fusión en marco de AML1 exón 5 a ETO exón
E11-e6 541 484 484 627
E11-e5 628 571 571 714
2. AML1- ETO transcritos de fusión no sólo se encuentran en prácticamente todos los
E11-e4 673 616 616 759 casos de t (8; 21), sino también en los casos con translocaciones complejas y en una
proporción significativa de t (8; 21) -negativo AML. 83,84 AML1
MV4-11 (e9-e5) - 3 - 3 - 5 - 3
RS4; 11 (e10-e4) - 3 - 3 - 5 - 3 los puntos de interrupción se encuentran entre el exón 5 y el exón 6 (Figura 6a), principalmente
Los pacientes - 2 - 3 - 4 - 2 en una 20 kb Bam región HI. ETO los puntos de corte se encuentran aguas arriba del exón 2. Por
lo que sabemos, la variante AML1-
una línea celular KASUMI-1 1909
AML1 ( 21q22)
1 3 4 5 6 7a 7b 8
paciente
2
MWM
U937
10- 1
10- 2
10- 3
10- 4
10- 5
10- 6
kb CEN controles negativos pb
región de corte
~ 25 kb
ETO ( 8q22)
1b 1a 2 3 4 5 6 7 8 9a 9 10 11
tel CEN
región de corte
~ Tel 15
segundo
395 -
12 3 5 2 3 4 5
503 542 796 953 4 1057 275 413 655 745
100 pb
AML1-A ETO-B
884 495
AML1-C ETO-D
920 396 AML1-ETO A-B
↔
AML1-E5'
842 Figura 7 El bromuro de etidio-manchado gel de agarosa con una dilución
experimento de ARN a partir de la t (8; 21) línea celular -positivo KASUMI-1 usando el Un externa ↔
Figura 6 (A) Diagrama esquemático de la estructura exón / intrón del cebadores B. ARN a partir de al (8; 21) -negativo paciente AML y de la línea celular U937 se
AML1 y ETO genes, que están involucrados en t (8; 21) (q22; q22). El centrómero (CEN) y la utilizaron como controles negativos.
orientación de los telómeros (TEL), la numeración de exón, y las regiones de corte
correspondientes se indican. (B) Diagrama esquemático de la AML1-ETO con transcripción AML1 exón
Tabla 9 Los tamaños de los productos de PCR y registrar las sensibilidades de AML1-ETO
5 fusionado a ETO exón 2. Los números bajo el transcrito de gen de fusión se refieren a los
primeros (5 9)
de nucleótidos del exón implicados, excepto cuando el último (3 9) de nucleótidos del gen aguas
arriba se indica. Las flechas indican la posición relativa de los cinco cebadores; los números se UNA ↔ segundo do ↔ re UNA ↔ segundo E5 9 ↔ re
refieren a la 5 9 posición de nucleótidos de cada cebador (Ver Tabla 8). + do ↔ re
Los tamaños de los
productos de PCR en pb 395 260 260 338
Tabla 8 Los cebadores para el análisis de RT-PCR de t (8; 21) (q22; q22) con el
KASUMI-1 - 4 - 4 - 5 - 4
AML1-ETO gen de fusión
Los pacientes - 3 - 4 - 4 - 3
Cebador 5 9 Posición una Secuencia (5 9 -3 9)

código (tamaño)
frecuente en el subtipo de AML-M2, donde se encuentra en el 20-40% de los casos. 83 También

AML1-A 884 (21) CTACCGCAGCCATGAAGAACC se ha descrito en casos raros de de AML M1 y AML-M4 y en AML terapia relacionada
ETO-B 495 (21) AGAGGAAGGCCCATTGCTGAA
con (t-AML). Este último puede estar relacionado con la presencia de un consenso
AML1-C 920 (22) ATGACCTCAGGTTTGTCGGTCG
topoiso- M BORRAR II escisión motivo aproximadamente 440 pb aguas arriba de
ETO-D 396 (22) TGAACTGGTTCTTGGAGCTCCT
AML1-E5 9 842 (24) TGGCTGGCAATGATGAAAACTACT
AML1 el exón 6, la misma región que está implicada en la fusión con el ETO gene. 89
una Véase la Tabla 2 para obtener información secuencia completa. La incidencia de la RT-PCR AML1-ETO
positividad varía de 8 a 12% de AML, 83,84,90 por lo tanto repre- resentir un aumento signi
fi cativo en comparación con, aunque las incidencias históricas, citogenéticas.
ETO no se han descrito transcritos de fusión derivadas de puntos de ruptura El interés de AML1-ETO RT-PCR en el seguimiento de pacientes con LMA es
variantes. Recíproco ETO-AML1 transcritos de fusión no han sido identificados fi. objeto de controversia. Ciertos grupos han informado de la persistencia de AML1-ETO
transcripciones en remisión a largo plazo tras el trasplante alogénico de médula
los AML1-ETO RT-PCR producto está generalmente presente como una sola ósea (BMT) utilizando PCR anidada, 91 mientras que otros han sugerido que la
banda, pero los productos de PCR menores adicionales de intensidad variable se positividad residual puede tener pronóstico significación. 92 negatividad PCR,
pueden ver. Dos grupos tienen identi fi ed tres alternativa empalmado, fuera de marco incluyendo después de la PCR anidada, ha sido reportado. 93 El uso de repro- ble,
de las variantes consiste en adicional pequeña ETO exones alternativos (de 46, 68 o 82 RT-PCR cuantitativa determinará si estas diferencias se deben a variables clínicas o
nucleótidos de longitud) entre AML1 exón 5 y ETO exón 2. 85,86 técnicas.
La t (8; 21) está asociada con un pronóstico relativamente bueno, con una
particularmente buena respuesta a ciertos agentes terapéuticos, en particular,
arabinósido de citosina. 87,88 Estas observaciones han allanado el camino hacia el uso Los resultados de diseño de cebadores PCR y pruebas
de la terapia adaptada al riesgo basada en la evaluación genética citogenética y / o

molecular. La Tabla 8 muestra la posición y la secuencia de cada tivo relación imprimación a la AML1
Citogenéticamente, la t (8; 21) representa casi el 7% de de novo y ETO genes. Los tres AML1-A, AML1- C y AML1-E5 9 cebadores se encuentran en AML1
AML, siendo más frecuente en los pacientes más jóvenes. Es más es exón 4,
1910
mientras que el cebador ETO-B se encuentra en el exón ETO 3 y el cebador ETO-D Tabla 10 Los cebadores para el análisis de RT-PCR de t (9; 22) (q34; Q11) con el
BCR-ABL gen de fusión p190
en el exón 2 (Figura 6b).
Las tres pruebas de PCR individual con una ↔ ANTES DE CRISTO ↔ D y E5 9 ↔ cebadores
D dieron buenas sensibilidades de 10 - 3 a 10 - 4; la PCR anidada alcanzó una sensibilidad del 10 - 4 a
(tamaño)
10 - 5 ( La Figura 7 y la Tabla 9).
BCR-e1-A 1479 (21) GACTGCAGCTCCAATGAGAAC

ABL-a3-B 458 (21) GTTTGGGCTTCACACCATTCC
BCR-e1-C 1602 (21) CAGAACTCGCAACAGTCCTTC
SECCIÓN 4. t (9; 22) (q34; q11) con el BCR-ABL gen de fusión p190 ABL-a3-D 441 (23) TTCCCCATTGTGATTATAGCCTA
ABL-A3-E3 9 505 (23) TGACTGGCGTGATGTAGTTGCTT
E Gottardi 1, G Dotti 2, Un Parziale 1, M Ruggeri 2, una Véase la Tabla 2 para obtener información secuencia completa.
D De Micheli 1, C Manzoni 2, Un Rambaldi 2 y G Saglio 1 1 Departamento de

Medicina y Oncología Molecular, Ospedale San Luis Gonzaga,
Orbassano-Torino; y ció que la translocación Ph siempre resulta en la unión de 3 9 secuencias de la
2 Departamento de Hematología, Ospedali Riunti, Bérgamo, Italia
tirosina cinasa c- ABL proto-oncogén en el cromosoma 9 al 5 9 secuencias de la BCR
gen en el cromosoma 22. 13,97 Mientras que los puntos de interrupción en los cromo-
unos 9 son por lo general 5 9 a ABL el exón 2, los puntos de ruptura en el
cromosoma 22 difieren en su posición dentro de la BCR gen, dando lugar a
transcritos de fusión con diferentes tipos de BCR-ABL uniones. 97
Fondo
El cromosoma Filadelfia (Ph), además de ser el sello distintivo de la LMC, también

En la CML, los puntos de ruptura en el cromosoma 22 están restringidas a una
se produce en aproximadamente el 5% de la LLA infantil y en el 20-50% de ALL en
región central de la BCR gen llamado 'major breakpoint cluster region' (M- bcr), que
adultos, con una incidencia progreso- ively aumenta con la edad. 94-96 Molecular
lleva a las transcripciones con diferentes tipos de BCR-ABL uniones, que dependen de
análisis han esta-
la posición del punto de interrupción en BCR intrón 13 o del intrón 14. 98,99 Estos
transcritos de fusión codifican una proteína BCR-ABL de 210 kDa, llamado p210 BCR / ABL
una
( véase la Sección 5).
BCR ( 22q11)
1 alternativa 2 3 4 5 6 7 8 91011- 16 15 17181920 212223
exones
e1 Una segunda región de agrupamiento de punto de interrupción en el BCR gen ha
sido identi fi cado casi exclusivamente en LLA Ph +. 13 De hecho, mientras que
CEN
m ~bcr
55
tel aproximadamente el 40% de Ph + ALL muestran las mismas reordenamientos ecular
kb en moles como en el CML, en el 60% restante de Ph + ALL el BCR los puntos de
ABL ( 9q34)
corte se encuentran en la denominada 'menor breakpoint cluster region' (m- BCR) entre
1b 1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
los dos exones alternativos y el exón 2 (Figura 8A). Los puntos de interrupción en el ABL
a2 a3
gen se encuentra virtualmente todos en la región intrón grande (| 200 kb) entre ABL exón
tel
1b y el exón 2 (también llamado a2 exón). Como consecuencia de la m- bcr puntos de
CEN
región de corte interrupción sólo el primer exón del BCR gen (también llamado el exón e1) se unió a ABL
~ 200 kb
exón 2 (unión e1-a2) (Figura 8b). 13 Esto resulta en la producción de una proteína
segundo BCR-ABL de 190 kDa de peso molecular (p190 BCR / ABL) 0,100 Aunque el tipo E1-a2 de
e1-a2 frecuencia transcripción se ha asociado principalmente con ALL, también se han reportado casos
tipo 1 2 3 4 > 95% esporádicos de la LMC que expresan sólo este tipo de transcripción. 101 Además, se ha
1767 227 401 697
encontrado que casi todos los pacientes con LMC en el diagnóstico, además de la
E1-a3 1 3 4 raro
habitual BCR-ABL transcipts p210, a través de un mecanismo de corte y empalme
alternativo también expresan bajas cantidades de transcritos E1-a2, cuyo clínico y
100 pb patogenético significación aún espera a ser dilucidado. 102103
BCR-e1-A ABL-a3-B
1479 458
BCR-e1-C ABL-a3-D
1602 441
ABL-a3-E3'
505
Figura 8 (A) Diagrama esquemático de la estructura exón / intrón del Detección de BCR-ABL transcripciones en todos los pacientes
BCR y ABL genes, que participan en t (9; 22) (P34; q11) con el foco en la región de clúster menor
punto de interrupción (m- BCR). El centrómero (CEN) y la orientación de los telómeros (TEL), la
En total, el cromosoma Ph-y en consecuencia la BCR-ABL
numeración de exón, y las regiones de corte correspondientes se indican. La antigua nomenclatura
reordenamiento es un tor pronóstico desfavorable independiente fac-, que afecta
de BCR exón 1 y ABL
los exones 2 y 3 también se indica. (B) Diagramas esquemáticos de la BCR-ABL transcripciones
tanto a hematológica tasa de remisión completa y la probabilidad de supervivencia
p190. Los números bajo el transcrito de gen de fusión se refieren a los primeros (5 9) de libre de enfermedad. 104-106 Los pobres resultados de los protocolos de tratamiento
nucleótidos del exón implicados, excepto cuando el último (3 9) de nucleótidos del gen aguas arriba convencionales han llevado a la amplia utilización de enfoques de consolidación
se indica. El transcrito de fusión e1-a2 se encuentra con mayor frecuencia (0,95%), pero se ha más agresivos, que incluyen trasplante alogénico o autólogo, ya sea con médula
informado de casos esporádicos con transcripciones E1-a3 (véase Ref. 106). Las flechas indican
ósea o células madre de sangre periférica. 107108 En estos protocolos de tratamiento,
la posición relativa de los cebadores; el tres ABL cebadores son idénticos a los utilizados para la
RT-PCR la detección de BCR-ABL
detección de BCR-ABL transcripciones p210 (ver Figura 10B). Los números se refieren a la 5 9 posición
de nucleótidos de cada cebador (Ver Tabla 10).
transcripciones de fusión sin duda representa el método de elección para el seguimiento
de MRD durante el seguimiento. 109 La validez clínica
1911
de este método en Ph + Todo se ha demostrado recientemente para los pacientes que
una
paciente +
línea celular
recibieron trasplante de médula ósea. 110 En estos pacientes con ALL la reaparición de
paciente -
ALL / MIK
MWM
MWM
MWM
positividad RT-PCR después de BMT era significativamente asociación ted con la ocurrencia
HO2
de una recaída hematológica. Por otra parte, la posibilidad de identificar pacientes con alto
pb
riesgo de recaída permitirá eventualmente a la prueba de la e fi cacia de nuevas estrategias
terapéuticas encaminadas a la disminución de las tasas de recaída después del trasplante,
como la inmunoterapia adoptiva, las terapias basadas en anticuerpos, o interferón.
521 -
La Tabla 10 muestra la posición y la secuencia de cada uno con relación cebador

para el primer exón del BCR gen (e1) y el tercer exón de ABL gen (a3). La elección
de los cebadores inversos situados en ABL exón 3 en lugar de en ABL exón 2, se
basa en el hallazgo de que en los casos esporádicos de la BCR-ABL unión tiene
lugar entre el BCR exón 1 y ABL exón 3 (también llamado a3 exón) como
consecuencia de un punto de interrupción en ABL intrón 2, lo que resulta en la unión
BCR-e1-A ABL-a3-B
↔
e1-a3 rara (Figura 8b). 106
segundo
paciente +
línea celular
paciente -
Primer BCR-e1-A y el cebador ABL-a3-B se utilizaron en una ronda primera de

ALL / MIK
MWM
MWM
MWM
PCR utilizando el protocolo de RT-PCR estandarizado. La sensibilidad alcanzado en

HO2
pb esta etapa fue 10 - 3. Cuando se realizó una segunda ronda de catión amplificador (PCR
anidada) utilizando los cebadores internos BCR-e1-C y ABL-a3-D, un nivel sensi-
bilidad reproducible de 10 - 4 / 10 - 5 se obtuvo (Tabla 11). Los cebadores C y D
ensayadas en una ronda primera de RT-PCR mostraron una tividad sensi- de 10 - 3 / 10 - 4.
Por último, el desplazado RT-PCR, empleando ABL-A3-E3 9 como cebador inverso en
conjunción con BCR-e1-C como cebador directo, mostró una sensibilidad de 10 - 2 / 10 - 3.
445 -
En todas las reacciones, después de la primera ronda de RT-PCR, los productos ed

amplificadores visualizaron en bromuro de etidio en geles de agarosa teñidos mostró
bandas solamente individuales del tamaño ecular en moles esperado (Figura 9 y Tabla
11). Sin embargo, al probar los pacientes que expresan tanto p190 y p210 de tipos BCR-ABL
transcripciones, se pueden observar una banda muy alto peso molecular

(aproximadamente 1800 pb). Esta banda corresponde a la ampli fi cación de las
BCR-e1-C ABL-a3-E3'
↔ secuencias completas de ADNc incluida entre el BCR exón 1 y ABL exón 3 en los
tipos de guiones p210 tran-. Finalmente, una banda de aproximadamente 500 pb se
puede observar en el gel después de la reacción de RT-PCR anidada, repre-
Figura 9 El bromuro de etidio-manchado geles de agarosa que muestran la posi-
tiva PCR resultados con la A externo ↔ cebadores B y 'desplazado' C ↔ E3 9 resentir el producto fi ed ampli derivado de la primera ronda de RT-PCR (521 pb).
cebadores en al (9; 22) paciente -positivo y la línea celular ALL / MIK. A t (9; 22) - negativo ALL
paciente y H 2 O se utilizaron como controles negativos.
SECCIÓN 5. t (9; 22) (q34; q11) con el BCR-ABL gen de fusión p210
Tabla 11 Los tamaños de los productos de PCR y registrar las sensibilidades de BCR-ABL
conjuntos de cebadores p190 en las pruebas de RT-PCR

M Gonza'lez Dia'z 1, Un Waronko 2, R Garci à-Sanz 1, Y Toiron 2,
MC Chillo'n 1 y JA Gabert 2 1 Departamento de Hematología, Hospital Clínico
UNA ↔ segundo do ↔ re UNA ↔ segundo do ↔ E3 9 Universitario, Salamanca, España; y 2 Departamento de Hematología, Institut
+ do ↔ re
Paoli Calmettes, Marsella, Francia
Los tamaños de los
productos de PCR en pb
p190 e1-a2 521 381 381 445

p190 E1-a3 una 347 207 207 271
Fondo
TOM-1 - 3 - 3 - 4 - 3
ALL / MIK - 3 - 3 - 4 - 2
La consecuencia molecular de t (9; 22) (q34; q11) es la for- mación de dos genes
Los pacientes - 3 - 4 - 5 - 3 híbridos: BCR-ABL en el cromosoma Ph y ABL-BCR en 9Q +. 12,32 los BCR-ABL gen
de fusión codifica una proteína con actividad de tirosina quinasa elevada que parece
una El producto de PCR e1-a3 rara p190 es causada generalmente por un punto Break- en ABL intrón ejercer sus efectos interfiriendo con la transducción de señal celular
2.
1912 una
del 95% de los pacientes con LMC tiene una BCR-ABL génica en sus células kemic
BCR ( 22q11) Leu-. Sin embargo, no es exclusivo de la LMC, ya que se encuentra en alrededor del
1 alternativa 2 3 4 5 6 7 8 91011- 1516 17181920 212223 30% (20-50%) de LLA en adultos y en el 2-10% de la LLA infantil, así como en casos
exones b3 b2 c4 c3
esporádicos de LMA (, 2%), linfoma y mieloma. 19,95-97,112-116
CEN tel
bcr μ - bcr La proteína de fusión BCR-ABL puede variar de 190 kDa a 230 kDa, dependiendo
del sitio del punto de interrupción en el BCR gene. Esta diversidad parece estar
ABL ( 9q34) M- ~ 2,9 kb
relacionada con el tipo de leucemia fenotipo y la agresividad. 106112 En casi todos los
1b 1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
a2 a3 LMC, así como en el 30-50% de los adultos Ph + ALL y una pequeña proporción
(20-30%) de la infancia Ph + Todos, los puntos de interrupción en el BCR gen se
encuentran dentro de la M- bcr región. 113117118 Inicialmente esto se definió como una
tel
región de corte región de 5,8 kb que abarca los exones 12 a 16 (originalmente llamado b1 a b5) de la BCR
CEN
~ 200 kb
gene. 98 Vitually todos los pacientes con LMC tienen su punto de interrupción en la
región de 2,9 kb entre BCR los exones 13 y 15 (también llamados exones b2 y b4),
segundo
tipo frecuencia que fusiona a la gran intrón entre ABL exones 1b y 2 (Figura 10a). 119 Esto resulta en un
b3-a2 11 12 13 14 2 3 4 ~ 55% híbrido BCR-ABL transcripción de 8,5 kb que contienen cualquiera BCR exón b2 o b3
y ABL exón 2 (también llamado a2 exón). Este ARNm codifica la proteína de 210 kDa
3015 3091 3196 3270 227 401 697
BCR-ABL (p210 BCR / ABL). La mayoría de los pacientes con LMC tiene transcripciones con
b2-a2 11 12 13 2 3 4 ~ 40%
la b3-a2 (55%) o b2-a2 (40%) uniones (Figura 10b). 120121 En el 5% de los casos, ambos
3195
transcritos-B3 A2 y B2-A2 se pueden formar como resultado de corte y empalme
b3-a3 11 12 13 14 3 4 raro alternativo. 112120121 Hasta el momento, ninguna diferencia clara en el resultado clínico se
ha informado entre los dos BCR-ABL transcripciones p210. 112120
b2-a3 11 12 13 3 4 raro
100 pb
BCR-b1-A ABL-a3-B
3086 458
De vez en cuando en los pacientes con LMC en otros puntos de ruptura tanto
BCR-b2-C ABL-a3-D
3126 441 BCR y ABL genes se han descrito. En casos muy raros de LLA Ph + CML (, informaron
de 10 casos), el punto de interrupción en el BCR
ABL-a3-E3'
505 gen implica la m- asociado-ALL bcr región, lo que resulta en la producción exclusiva
de la p190 más pequeña BCR / ABL proteína de fusión (véase la Sección 4). 101 p190
Figura 10 (A) Diagrama esquemático de la estructura exón / intrón del Clínicamente + pacientes con LMC se presentan con una prominente monocitosis
la BCR y ABL genes, que participan en t (9; 22) (P34; q11) con el foco en la región principal de rotura relativa y absoluta y tienen hallazgos clínicos intermedios entre CML y leucemia
de conglomerados (M- BCR). El centrómero (CEN) y de los telómeros (TEL) orientación, la numeración mielomonocítica crónica. 122
de exón, y las regiones de corte correspondientes se indican, incluyendo la región de clúster micro
punto de interrupción ( metro- BCR). La antigua nomenclatura de la BCR y ABL los exones se indican en
parte. (B) Diagrama esquemático de la BCR-ABL transcripciones p210. Los números debajo de los
Una proporción muy pequeña de pacientes Ph + CML muestra una mayor BCR-ABL
transcritos del gen de fusión se refieren a los primeros (5 9) transcrito de fusión que resulta de una fusión entre BCR exón 19 (originalmente
llamado C3) y ABL exón
de nucleótidos del exón implicados, excepto cuando el último (3 9) de nucleótidos del gen aguas 2. Esto es causado por los puntos de interrupción en la región ter clus- punto de
arriba se indica. Los transcritos b3-a2 y b2-a2 se encuentran con mayor frecuencia, pero se han interrupción micro ( metro- BCR) Entre BCR exón 19 y 20 (Figura 10a). Esta BCR-ABL gen
descrito casos esporádicos con transcripciones-B3 A3 y B2-A3. Las flechas indican la ition posi-
de fusión codifica una proteína grande de 230 kDa BCR-ABL que parece interrumpir el
relativa de los cebadores; el tres ABL cebadores son idénticos a los utilizados para la detección
proceso normal de diferenciación cytic granulomatosa que conduce a un trastorno
de BCR-ABL transcripciones p190 (ver Figura 8B). Las fibras No. de orden se refieren a la 5 9 posición
caracterizado por un curso clínico indolente en la mayoría de los casos. 123 Además,
de nucleótidos de cada cebador (véase la Tabla 12).
algunos esporádicos Ph + y Ph - LMC con BCR puntos de ruptura fuera de las tres
regiones de racimo anteriormente comentadas se han reportado, que implica varios
otros intrones (2, 5, 6, 8 y 10). 112
Tabla 12 Los cebadores para el análisis de RT-PCR de t (9; 22) (q34; Q11) con el
BCR-ABL gen de fusión p210
Finalmente, en raras Ph + casos de CML y también en algunos Ph + ALL (, 5%), la BCR
secuencias en el híbrido BCR-ABL transcripción se fusionan a ABL exón a3 en
(tamaño)
lugar de a2 (Figura 8b y la Figura 10b). 106
BCR-b1-A 3086 (22) GAAGTGTTTCAGAAGCTTCTCC

ABL-a3-B 458 (21) GTTTGGGCTTCACACCATTCC
BCR-b2-C 3126 (21) CAGATGCTGACCAACTCGTGT Detección de BCR-ABL transcripciones en pacientes con LMC
ABL-a3-D 441 (23) TTCCCCATTGTGATTATAGCCTA
ABL-A3-E3 9 505 (23) TGACTGGCGTGATGTAGTTGCTT
El uso de RT-PCR para la detección de BCR-ABL transcripciones es posible en prácticamente

todas las CML (0,95%), incluso en los casos perdidos por citogenética estándar (hasta un 10%
de los casos). 124 En la mayoría de los casos de CML restantes los eventos moleculares
subyacentes todavía tienen que ser descubierto. RT-PCR es una herramienta útil para la
vías normalmente implicadas en el control de la muerte celular y la proliferación y detección de MRD durante el seguimiento. 125 Desde 1989 se han realizado varios estudios de
adhesión célula-célula, que implica dominios de ambas proteínas BCR y ABL. 111 El MRD-PCR, sobre todo en pacientes con LMC que se sometieron a trasplante de médula ósea
recíproco ABL-BCR gen de fusión ha sido estudiados con menos intensidad, pero alogénico con el fin de evaluar la incidencia y la significación de las células positivas por PCR. 126-129
algunos estudios muestran que más de dos tercios de los pacientes con LMC producen La mayoría de estos estudios se encontró que los resultados negativos de PCR predicen
ABL-BCR claramente una
ARNm. El rol de ABL-BCR, en su caso, sigue sin estar claro. Más
una 1913
HL60 HO
paciente
paciente
de nuevo no se correlaciona con la recaída, ya que las células positivas por PCR se han
paciente
KCL22
BV173
MWM
MWM
b2-a2
b2-a3
b3-a2
K562
observado incluso varios años después del trasplante de médula ósea sin ningún signo
2
pb de progresión de la enfermedad, lo que puede sugerir el establecimiento de un equilibrio
entre estas células y el sistema inmunológico. 129 Las limitaciones de la PCR cualitativa
para predecir la recaída en pacientes individuales ha iniciado el desarrollo de ensayos de
PCR cuantitativa (Q-PCR) que permiten el seguimiento de
417 -
BCR-ABL los niveles de transcripción. Se ha sugerido que Q-PCR puede ser considerada
- 342 -
como un factor de predicción temprana del resultado y que las decisiones clínicas se puede
169 de la basar en los resultados de Q-PCR después de alo- trasplante geneic 130 o durante el
tratamiento con interferón. 131 Esto es particularmente importante en pacientes candidatos
para infusión de linfocitos de donante-ya que, al parecer, la respuesta se correlaciona con la
BCR-b1-A ABL-a3-B
↔ carga tumoral residual. 132133
K562 línea celular

segundo
MWM
HL60
10- 1
10- 2
10- 3
10- 4
10- 5
10- 6
10- 7
10 0
HO2

pb
Cinco cebadores fueron diseñados para BCR-ABL, p210. Su posición y ubicación en

el BCR y ABL genes, así como sus secuencias se dan en la Tabla 12 y la Figura
10b. Con el fin de detectar la rara BCR-ABL variantes b3-a3 y b2-a3, los cebadores
iniciales en ABL exón a2 fueron sustituidos con cebadores en la
ABL exón a3 (B, D y E3 9 cebadores). De hecho, los mismos tres

417 -
ABL cebadores se usan para la detección de tanto BCR-ABL p210 y
BCR-ABL p190, es decir, el M- bcr y M- bcr variantes, respectivamente (Figuras 8b y
BCR-b1-A ABL-a3-B
↔
10b).
Los tamaños de los productos de PCR obtenidos de acuerdo con los tipos dife-
Figura 11 El bromuro de etidio-manchado gel de agarosa con varios variabilidad rentes de M- bcr los puntos de interrupción (b3-a2, b2-a2, a3-b3 A3 y B2) y los
hormigas de BCR-ABL transcripciones p210 como se detectó con la A externo ↔ diferentes pares de cebadores se dan en la Tabla 13 y en parte ilustran en la Figura
cebadores B (a). Esto se refiere a los transcritos b3-a2 en la línea celular K562 y un paciente, las 11a. La sensibilidad de las combinaciones de cebadores y estrategias de PCR
transcripciones b2-a2 en la línea celular KCL22 y un paciente, y BV línea de células 173 con las dos
diferente también se muestra en la Tabla 13. Cuando se utilizó una sola PCR, la
transcripciones. Por último, se presenta un paciente con la transcripción b2-a3 rara. Los resultados de
sensibilidad osciló entre 10 - 3 y 10 - 4, ya sea con el uso de externo (A ↔
un experimento de dilución con ARN de la línea celular K562 usando el A ↔ conjunto de cebadores B
(b).
B) o interno (C ↔ D) los cebadores, así como el conjunto de cebadores 'desplazado'
(C ↔ E3 9) ( Figura 11b). Esta sensibilidad se incrementó a 10 - 5 / 10 - 6 cuando se realizó
Tabla 13 Los tamaños de los productos de PCR y registrar las sensibilidades de BCR-ABL PCR anidada (Tabla 13). En todos los casos, la sensibilidad fue independiente del tipo
conjuntos de cebadores p210 en las pruebas de RT-PCR
de transcripción presentes en la translocación (b2-a2 o b3-a2).
UNA ↔ antes de Cristo ↔ DA ↔ antes de Cristo ↔ E3 9
+ do ↔ re
Los tamaños de los
productos de PCR en pb SECCIÓN 6. t (12; 21) (p13; q22) con el TEL-AML1 gen de fusión
p210 b3-a2 417 360 360 424
p210 b2-a2 342 285 285 349
p210 b3-a3 243 186 186 250 G Cazzaniga 1, E Gottardi 2, G Volpe 2, Y Toiron 3,
p210 b2-a3 168 111 111 175 Un Waronko 3, Un Biondi 1, G Saglio 2 y JA Gabert 3 1 Pediatrica clínica, Ospedale
San Gerardo, Monza, Italia;
BV173 (b2-a2 y - 4 - 4 - 6 - 4 2 Departamento de Medicina y Oncología Molecular, Ospedale San Luis
b3-a2)
Gonzaga, Orbassano-Torino, Italia; y
KCL22 (b2-a2) - 4 - 4 - 5 - 4 3 Departamento de Hematología, Institut Paoli Calmettes, Marsella,
Los pacientes (b2-a2) - 3 - 4 - 4 - 3
K562 (b3-a2) - 4 - 4 - 5 - 4 Francia
LAMA-84 (b3-a2) - 3 - 3 - 5 - 3
Los pacientes (b3-a2) - 3 - 3 - 5 - 3
Fondo
resultado favorable, pero un resultado positivo es difícil de interpretar. Mientras que la mayoría La t (12; 21) (p13; q22) fue primero reportada por dos grupos diferentes en 1995. 33,34
de los pacientes (0,75%) son positivas en la PCR sin impacto clínico claro durante los primeros Varios estudios posteriores demostraron que esta translocación, no detectable por
6 meses después del trasplante de médula ósea, PCR tividad posi- parece ser un buen etics cytogen- convencionales, constituye el reordenamiento más frecuente en la
indicador del riesgo de recaída de 6 meses a 1 año después del TMO (20-40 % de los niñez ALL. Se produce en aproximadamente el 25% de la LLA infantil. 23,24,34,134,135 La
pacientes). 128 En la mitad de los casos, la PCR negatividad parece correlacionarse con mayoría de los pacientes positivos varían en edad entre 1 y 12 años al momento del
enfermedad de injerto contra huésped y la retirada del tratamiento inmunosupresor. 127 En el diagnóstico, con un pico entre 2 y 5 años; todos mostrar un inmunofenotipo de
período post-trasplante tarde, la existencia de células PCR-positivos células precursoras-B,
1914 una
paciente 1
paciente 2
TEL ( 12p13)
MWM
MWM
HL60
REH
1a 2 3 4 5 67 8
HO2
pb
tel CEN
región de corte
~ 15 kb
AML1 ( 21q22)
1 2 3 4 5 6 7a 7b 8
tel CEN
región de corte
~ 150 kb 298 -
259 -
segundo
4 5 2 3 4 5 6
488 1033 503 542 796 953 1058
4 5 3 4 5 6
TEL-A AML1-B
↔
TEL-A AML1-B
100 pb Figura 13 El bromuro de etidio-manchado gel de agarosa que muestra los dos
845 611 tipos de TEL-AML1 transcripciones en la línea celular REH y dos pacientes utilizando el A externo ↔ cebadores
B. Paciente 1 contiene tanto las transcripciones: la banda (débil) inferior se deriva de la variante
TEL-C AML1-D
577
alternativa de empalme (véase la Figura 12).
928
TEL-E5'
692
Tabla 15 Los tamaños de los productos de PCR y registrar las sensibilidades de TEL-AML1
la TEL y AML1 genes, que participan en t (12; 21) (p13; q22). El mero (CEN) y de los telómeros (TEL)
orientación Centro-, la numeración de exón, y las regiones de punto de interrupción Evant rel- se
indican. (B) Diagrama esquemático de la UNA ↔ segundo do ↔ re UNA ↔ B E5 9 ↔ re
TEL-AML1 transcritos de fusión. Los números bajo el gen de fusión tran- secuencias de comandos hacen + do ↔ re
referencia a la primera (5 9) de nucleótidos del exón implicados, excepto cuando el último (3 9) de nucleótidos
del gen aguas arriba se indica. La mayoría de t (12; 21) de los pacientes positivas tienen el transcrito más Los tamaños de los
grande debido a un punto Break- en AML1 intrón 1, pero corte y empalme alternativo pueden causar saltos de AML1 productos de PCR en pb
exón 2, dando lugar a dos productos de PCR en algunos pacientes (ver texto). En una minoría de los estándar 298 181 181 417
pacientes las AML1 punto de interrupción se encuentra en el intrón variante ( - 39 pb) una 259 142 142 378
2, dando como resultado una transcripción más corto sin AML1 exón 2. Las flechas indican la posición
REH - 3 - 3 - 4 - 3
relativa de los cinco cebadores; los números se refieren a la 5 9 posición de nucleótidos de cada
cebador (véase la Tabla 14).
una Esta variante puede ser causada por corte y empalme alternativo o por puntos de interrupción alternativos en
Tabla 14 Los cebadores para el análisis de RT-PCR de t (12; 21) (p13; q22) con AML intrón 2.
la TEL-AML1 gen de fusión
código de imprimación 5 9 Posición una Secuencia (5 9 -3 9) Árbitro. 140). Sin embargo, los análisis de los pacientes con LLA recidivante han
(tamaño) demostrado que la frecuencia de esta translocación es similar al momento del
diagnóstico. 141142 Sin embargo, la translocación t (12; 21) -positivos pacientes conservan
TEL-A 845 (20) TGCACCCTCTGATCCTGAAC un buen pronóstico y parecen tener un momento más tardío de la recaída. 141142 Por el
AML1-B 611 (19) AACGCCTCGCTCATCTTGC contrario, otros grupos reportaron una incidencia muy baja en todos los recaída. 21140143 Esta
TEL-C 928 (22) AAGCCCATCAACCTCTCTCATC
aparente discrepancia debe ser clari fi ed por estudios prospectivos grandes con un largo
AML1-D 577 (18) TGGAAGGCGGCGTGAAGC
de seguimiento.
TEL-E5 9 692 (20) CGCACCAGGAGAACAACCAC
una Véase la Tabla 2 para obtener información secuencia completa. Como se muestra en la Figura 12a, t (12; 21) implica la TEL / ETV6
gen en el cromosoma 12 y el AML1 / CBFA2 gen en cro- mosome 21. 33,34,144,145 los AML1
gen también está implicado en t (8; 21), como se describe en la Sección 3 (Figura
en particular, todos comunes y pre-B-ALL, más raramente pro-B-ALL. Además, estos 6). La región del cromosoma 12 en el que el TEL gen se localiza es completamente
pacientes se caracterizan por recuento lowWBC el momento del diagnóstico (, 50000 / secuenciado y está disponible en la base de datos (tabla 2). los TEL
l). Curiosamente, la gran mayoría de los pacientes tienen un contenido de ADN no
hiperdiploidia (índice de ADN = 1), la mayoría tienen la coexpresión de marcadores gen es muy grande y se compone de ocho exones, pero los puntos BREAK- racimo
mieloides 24 y la mayoría (70-80%) muestra la supresión de la no reordenado en una región 15 kb entre los exones 5 y 6 (Figura 12a). 146 Sólo dos casos se han
descrito como que tiene un punto de interrupción en el intrón 4, 24134 que se perderían
TEL alelo. 136137 Hasta el momento, t (12; 21) no se ha encontrado en T-ALL o AML. con el análisis de PCR descrito aquí. La organización genómica de la
Nunca se ha descrito en las leucemias infantiles (edad menos de 1 año) y la
frecuencia en pacientes leucémicos adultos es baja (, 2%). 138139 AML1 gen aún no ha sido completamente descifrado, 147 y los puntos de ruptura puede
ocurrir ya sea en el muy grande intrón 1 (con más frecuencia) o en el intrón 2. En la
Varios estudios informaron resultados favorables para t (12; 21) - pacientes mayoría de los casos, la TEL-AML1
positivos, 23,24 en ambos estudios retrospectivos y estudios prospectivo con transcrito de fusión muestra una unión de exón 5 (nucleótido 1033) de TEL para el
relativamente corto de seguimiento (revisado en segundo exón (nucleótido 503) de AML1 ( Figura
una 1915
12b). Splicing alternativo hace que la omisión de AML1 exón 2 (39 pb) en una minoría de
PML ( 15q22)
las transcripciones, resultando en dos bandas de PCR de la misma paciente. Con menor 1 2 3 4 56 7 8 9
frecuencia, el punto de interrupción se produce en AML1 intrón 2, también resulta en la
unión de TEL CEN tel
bcr3 ~ bcr1
bcr2 ~ 0,3 kb
exón 5 para el tercer exón de AML1 ( Figura 12b). Sin embargo, las dos proteínas de 1,5 kb ~ 2 kb
fusión derivados conservan el mismo marco y estructura.

RARA ( 17q21)
1 2 3 4 56
CEN tel
región de corte
Los resultados de diseño de cebadores PCR y pruebas ~ 15 kb
La Tabla 14 muestra la posición y la secuencia de cada uno con relación imprimación a la TEL y
segundo
tipo frecuencia
AML1 ARNm. Imprimación TEL-A, que se encuentra en TEL exón 5, y el cebador AML1-B, que bcr1 3 4 5 6 3 ~ 55% de
se encuentra en AML1 exón

1264 1335 1479 1737 405
3, se utilizaron en un primer ciclo de PCR utilizando el protocolo de RT-PCR

bcr2 3 4 5 6 3 ~ 5%
estandarizado. Esta primera ronda de PCR permitió un nivel de sensibilidad que se
alcance de 10 - 3, cuando se utilizó ARN de la línea celular de control REH y 10 - 2 utilizando
bcr3 3 3 ~ 40%
ARN de todos los pacientes. Cuando se realizó una segunda ronda de catión amplificador
(PCR anidada) utilizando los cebadores internos TEL-C y AML1-D, un nivel de sensibilidad 1263
100 pb
reproducible de 10 - 4 o 10 - 3 se obtuvo de la línea celular o REH pacientes, respectivamente

(Tabla 15). Los cebadores TEL-C y AML1- D (generalmente sólo se usa en la PCR PML-A2 PML-A1 RARA-B
969 1438 485
anidada), probados en una primera ronda de PCR, permitió una sensibilidad de 10 - 3 a

alcanzar en tanto REH y ARN paciente. Por último, el 'desplazado' de la PCR con el PML-C2 PML-C1 RARA-D
997 1546 426
TEL-E5 9 y los cebadores AML1-D mostraron una sensibilidad de 10 - 3 en la línea celular
REH y 10 - 4 en el ARN del paciente. Los productos de PCR obtenidos con una ↔ cebadores RARA-E3'
682
B pueden mostrar los siguientes patrones en AGA- geles rosa:
la LMP y RARA genes, que participan en t (15; 17) (q22; q21). El mero (CEN) y de los telómeros
(TEL) orientación Centro-, la numeración de exón, y las regiones de punto de interrupción Evant rel-
se indican. Las regiones bcr1 y bcr2 de punto de interrupción se yuxtaponen en el intrón 6 y el exón
• una banda de PCR de 298 pb en el caso de un punto de interrupción en AML1- 6, respectivamente. (B) Diagrama matic Sche- de los tres tipos de PMLRARA transcripciones,
intrón 1 (línea celular REH en la Figura 13); relacionados con los diferentes LMP las regiones de corte. El tamaño del transcrito de bcr2
• dos bandas de PCR de 298 pb y 259 pb (menos intensa) en caso de un punto de interrupción depende de la posición del punto de interrupción en LMP exón 6. Los números bajo la fusión
transcripciones de genes se refieren a los primeros (5 9) marea Núcleo- del exón involucrados,
en AML1 intrón 1 y una variante de corte y empalme alternativo que carece AML1 el exón 2,
excepto cuando el último (3 9) de nucleótidos del gen aguas arriba se indica. Los siete flechas
respectivamente (paciente 1 en la Figura 13);
indican la posición relativa de los cebadores; los números se refieren a la 5 9 posición de nucleótidos
de cada cebador (véase la Tabla 16).
• sólo una banda de 259 pb en el caso de un punto de interrupción en AML1
intrón 2 (paciente 2 en la Figura 13).
Tabla 16 Los cebadores para el análisis de RT-PCR de t (15; 17) (q22; Q21) con
la PMLRARA gen de fusión

(tamaño)
SECCIÓN 7. t (15; 17) (q22; q21) con el PMLRARA gen de fusión
PML-A1 1438 (21) CAGTGTACGCCTTCTCCATCA

PML-A2 969 (18) CTGCTGGAGGCTGTGGAC
Un Biondi 1, V Rossi 1, P Gameiro 2, S Vieira 2, L Corral 1,
RARA-B 485 (20) GCTTGTAGATGCGGGGTAGA
Un Bac¸a~o 2, G Cazzaniga 1, J diamante 2 y A Parreira 2 1 Clinica Pediatrica,
PML-C1 1546 (21) TCAAGATGGAGTCTGAGGAGG
Ospedale San Gerardo, Monza, Italia; y 2 Departamento de PML-C2 997 (19) AGCGCGACTACGAGGAGAT
Hemato-Oncología, Instituto Portugue's Oncologia, Lisboa, Portugal RARA-D 426 (20) CTGCTGCTCTGGGTCTCAAT
RARA-E3 9 682 (20) GCCCACTTCAAAGCACTTCT
Fondo
La t (15; 17) está asociada con la leucemia promielocítica aguda (APL), un los puntos de interrupción se localizan dentro de un fragmento de ADN de 15 kb de la
subconjunto de AML distinto con citomorfología M3. 148 Las regiones cromosómicas RARA intrón 2 (Figura 14a). Por el contrario, tres regiones del
de interrupción han sido asignadas a diversas 15q22-q24, y 17q11-q21. Los sitios LMP locus están implicados en la translocación de interrupción: el intrón 6 (bcr1;
de rotura cromosómicos se aislaron por cuatro grupos utilizando enfoques 55% de los casos), el exón 6 (bcr2; 5%), y el intrón 3 (bcr3; 40%). quimérico PMLRARA
experimentales diferentes. 149-152 Los dos genes implicados en la t (15; 17) están LMP, y RARA-PML guiones tran- se forman como consecuencia del catión translo-
que codifica para un nuevo factor de transcripción putativo, en el cromosoma 15 149-152 recíproca entre la LMP y RARA loci. La existencia de regiones de corte diferentes
y el receptor-ácido retinoico una en el LMP locus y la presencia de corte y empalme alternativo de LMP transcripciones
son responsables de
( RARA) gen en el cromosoma 17. 153154 El cromosoma 17
1916 una do
segundo
bcr3 paciente +
bcr1 paciente +
bcr2 paciente +
paciente bcr3-
bcr2- paciente
MWM
MWM
MWM
MWM
MWM
HL60
MWM
NB4
HO
HO
HO
2
2
pb pb pb
381 - 345 - 376 -
PML-RARA↔A1-B PML-RARA↔A1-B PML-RARA↔A2-B
Figura 15 De etidio en geles de agarosa teñido con bromuro de muestra productos de PCR, derivan de los tres tipos de PMLRARA genes de fusión utilizando el
Un externa ↔ cebadores B. ARN a partir de t (15; 17) de los pacientes negativos al, la línea celular HL60, y H 2 O se utilizaron como controles negativos.
bcr3 paciente +
de PMLRARA uniones en todos los pacientes con APL. 156 La observación de que RARA-PML transcripciones
están presentes en la mayoría pero no todos los casos de APL, ha favorecido el uso de PMLRARA transcripciones
MWM
HL60
10- 1
10- 2
10- 3
10- 4
10- 5
10- 6
10- 7
10 0
como diana de PCR para la detección de células con APL en el diagnóstico y durante Toring moni-.
HO2
pb
Varios estudios intentaron correlacionar el tipo de PML- RARA transcripción, ya sea

con las características clínico-biológica en diag- nóstico o con la respuesta al tratamiento
y el resultado (revisado en Ref. 157). La gran mayoría de series analizadas compara los
289 -
dos principales PMLRARA isoformas, que se refiere a las transcripciones como largos (L)
(incluyendo LMP S) transcripciones (cortas bcr1 y bcr2) y ( LMP bcr3). Debido bcr2
(también referido como 'variante' o en forma de V) y bcr1 están situados en LMP el exón 6
PML-RARA C2-D
↔ (anidada) y el intrón 6, respectivamente, la secuenciación de todos los casos L transcripción serían
necesarios para distinguir claramente estas dos isoformas. Tal distinción por lo general
Figura 16 El bromuro de etidio-manchado gel de agarosa que muestra una no se informó en los estudios clínicos con un gran número de pacientes. 157 Al momento
experimento dilución con ARN a partir de al (15; 17) paciente -positivo con bcr3 tipo PMLRARA transcripciones.
del diagnóstico no se encontraron correlaciones con respecto a sexo, recuento de
Una sensibilidad de 10 - 4 se alcanzó con el enfoque de PCR anidada. plaquetas, la presencia de coagulopatía o síndrome retinoico, al comparar pacientes con
tipo L o S-type PMLRARA transcripciones. 157 Sin embargo, los pacientes con
transcripciones Stype tenían recuentos de glóbulos blancos significativamente más altos
y más frecuentemente morfología M3v. Aunque las transcripciones Stype correlacionados
con las características establecidas pronósticos adversos (es decir hiperleucocitosis,
la gran heterogeneidad de PMLRARA uniones observadas entre pacientes con APL M3v), esta asociación no se tradujo en resultados más pobres en comparación con los
(revisado en Ref. 155). Por otra parte, el uso alternativo de dos RARA sitios de pacientes con L-
poliadenilación genera adicional PMLRARA transcripciones de diferentes tamaños. 155 Un
conjunto de mers pri- ha sido inicialmente de fi nido que permitió que el catión fi cador
Tabla 17 Los tamaños de los productos de PCR y registrar las sensibilidades de PMLRARA conjuntos de cebadores en las pruebas de RT-PCR
A1 ↔ segundo A2 ↔ segundo C1 ↔ re C2 ↔ re A1 ↔ segundo A2 ↔ segundo C1 ↔ E3 9 C2 ↔ E3 9

+ C1 ↔ re + C2 ↔ re
Los tamaños de los
productos de PCR en pb
bcr1 381 (1329) 214 (688) 214 (688) 470 (944)

bcr2 345 una (819) una 178 una (652) una 178 una (652) una 434 una (908) una
bcr3 - 376 - 289 - 289 - 545
NB4 - 3 N / A segundo - 3 N/A - 4 N/A - 2 N/A
Los pacientes - 2 - 2 - 3 - 2 - 3 - 4 - 1 - 2
una Los tamaños de los productos de PCR en bcr2 + pacientes con APL son variables debido a las posiciones de punto de interrupción variables en el exón 6 de la LMP gene.
segundo NA: no aplicable.
1917
escriba transcripciones, en el contexto de la combinación de ATRA y los regímenes de asociada con AML-M4 con eosinófilos anormales (M4Eo). La t (16; 16) (p13; q22) se
quimioterapia. identificó como una aberración variante. La inv (16) (p13q22) y t (16; 16) (p13; q22)
fundir el CBFB
gen (factor de unión central segundo subunidad), también identificado como ed PEBP2b
Los resultados del diseño de cebadores de PCR y las pruebas (Proteína de unión del polioma potenciador 2 segundo), situado en 16q22 cromo- alguna
a la MYH11 gen (cadena pesada de miosina 11
Con el fin de cubrir los tres puntos de interrupción en el LMP gen, dos cebadores directos
adicionales fueron diseñados. Conjuntos de cebadores A1 ↔ B y C1 ↔ D cubrir los puntos de una
interrupción bcr1 y bcr2, mientras que conjuntos de cebadores A2 ↔ B y C2 ↔ D puede MYH11 ( 16p13)
detectar PMLRARA transcripciones derivado de LMP puntos de interrupción en bcr3 12345 6 7 8910 11 a 16 17 1819 20 21
(Figuras 14 y 15). La información de la secuencia exacta y la posición relativa de los siete
cebadores se dan en la Tabla 16. Tabla 17 resume los tamaños esperados de los productos
de PCR por tipo de rotura de conglomerados y por conjunto de cebadores. Cabe señalar CEN tel
región de corte
que el tamaño de los productos de PCR varía en caso de bcr2 + pacientes, debido a las
~ 7,5 kb
posiciones de punto de interrupción variables en el exón 6 de la LMP gene.
segundo
frecuencia
Las pruebas de sensibilidad se realizaron con el ARN obtenido a partir de
pacientes con APL, así como con el ARN de la línea celular NB4, que tiene la LMP punto Un tipo “4” “5” 12 14 88%
de interrupción en la región bcr1. Los ARN positivos se diluyeron en serie en ARN

379 474 1921 2134 2296
negativo obtenido de la línea celular HL60.

segundo “4” “5” 11 12 13 14 1 caso
Una sensibilidad relativamente alta de 10 - 4 se logró con el anidado de amplificación 1708
de los transcritos bcr1 obtenidos a partir de la línea celular NB4 y las transcripciones
do “4” “5” 10 11 12 13 14 1 caso
bcr3 de pacientes con APL (Figura
dieciséis). El catión amplificador bcr1 anidado fue un log menos sensible (10 - 3) cuando 1528
se utiliza ARN de pacientes positivos (Tabla 17). re “4” “5” 8 9 10 11 12 13 14 5%
PCR individual era capaz de detectar los diferentes tipos de PML- RARA transcripciones
1201 1306 1459
pero con al menos un registro de menos sensibilidad Comparado con la PCR anidada: 10 - 2 cuando
se utiliza ARN de pacientes positivos y 10 - 3 con ARN de la línea celular NB4. Un resultado mi “4” “5” 7 8 9 10 11 12 13 14 5%
similar se obtuvo con los cebadores anidados solo, excepto para bcr1 transcripciones, que 14 13
994
podrían ser detectadas a niveles de dilución de 10 - 3, lo que implica que el C1 ↔ conjunto de

F “4” 12 13 1 caso
cebadores D es muy e fi ciente. El 'desplazado' de la PCR fue igualmente sensible en la
detección de los transcritos de bcr1 de la línea celular NB4 y las transcripciones bcr3 de los 378
pacientes, pero dio una sensibilidad de registro de 10 - 1 cuando la amplificación de los sol “4” 8 9 10 11 12 13 14 1 caso
transcritos de bcr1 de pacientes con APL (Tabla 17).
H “4” 7 8 9 10 11 12 13 14 1 caso
No hay bandas adicionales se encuentran generalmente en los productos de la PCR se ejecutan en

1099
1,5% geles de agarosa y se visualizaron con tinción con bromuro de etidio. Sin embargo,
múltiples bandas pueden aparecer en pro ductos de la PCR de bcr1 + pacientes, si yo “4” 13 14 1 caso
cebadores se usan para bcr3 punto Break- identificación. Estas bandas adicionales son
causados por empalme alternativo de LMP exones. 155
J “4” “5” 9 10 11 12 13 14 1 caso
100 pb
CBFB-A MYH11-B1 MYH11-B2

253 1316 2116
CBFB-C MYH11-D1 MYH11-D2

345 1225 2061
SECCIÓN 8. inv (16) (p13; q22) con el CBFBMYH11 gen de fusión
CBFB-E5'
199
E Delabesse 1, JA Gabert 2, M Magen 1, Un Waronko 2
y EA Macintyre 1 1 Departamento de Hematología, Hospital Necker-Enfants
Malades, París, Francia; y 2 Departamento de Hematología, Institut la MYH11 gen, que está implicado en la inv (16) (p13; q22). El mero (CEN) y de los telómeros (TEL)
Paoli-Calmettes, Marsella, Francia orientación Centro-, la numeración de exón, y la región de punto de interrupción se indican. (B)
Diagrama esquemático de los 10 tipos diferentes de CBFBMYH11 transcritos de fusión. Los
números debajo de los transcritos del gen de fusión se refieren a los primeros (5 9) de nucleótidos del
exón implicados, excepto cuando el último (3 9) de nucleótidos del gen aguas arriba se indica. Los
diferentes tipos de transcripciones son causados principalmente por los puntos de corte en diferentes
Fondo intrones del MYH11 gene. Fusión tran- scripts de tipo A, D y E en conjunto representan
aproximadamente el 98% de todos los pacientes, mientras que los otros tipos se refieren a casos
individuales. Los siete flechas indican la posición relativa de los cebadores; los números se refieren a
A del (16) (q22) se informó inicialmente en AML en 1982. Esto se demostró la 5 9 posición de nucleótidos de cada cebador (véase la Tabla 18).
rápidamente para corresponder a una inversión pericéntrica del cromosoma 16, es
decir, inv (16) (p13q22), que parecía ser
1918 una línea celular ME-1 (tipo A)
MWM
Tabla 18
HL60
10- 1
10- 2
10- 4
10- 5
10- 6
Los cebadores para el análisis de RT-PCR de inv (16) (p13; q22) con el
10- 3
HO2
CBFBMYH11 gen de fusión
pb

(tamaño)
CBFB-A 253 (22) GCAGGCAAGGTATATTTGAAGG

MYH11-B1 1316 (20) TGAAGCAACTCCTGGGTGTC
MYH11-B2 2116 (22) TCCTCTTCTCCTCATTCTGCTC
CBFB-C 345 (20) GGGCTGTCTGGAGTTTGATG
MYH11-D1 1225 (20) TCCCTGTGACGCTCTCAACT
MYH11-D2 2061 (18) CTTGAGCGCCTGCATGTT
CBFB-E5 9 199 (21) CAGGGAGAACAGCGACAAACA
271 -
gen), cuya proteína producto es también identificada como SMMHC (cadena pesada
de la miosina del músculo liso) y está situado en mosome cro- 16p13. 37 La inv (16)
(p13q22) se ha descrito en la línea celular ME-1 ( CBFBMYH11 tipo A transcripción). 158 CBFB-C MYH11-D2
↔ (anidada)
La estructura genómica de la humana CBFB gen no se pub- ció. Un mapa

segundo paciente (tipo D)
putativo se puede derivar a partir del mapa genómico de la murino CBFB gen: la
mayoría de los puntos de interrupción se encuentran en un intrón de 15 kb entre
MWM
HL60
10- 1
10- 2
10- 3
10- 4
10- 5
10- 6
HO2
'exón 5' y 'exón 6', aquí llamado intrón 5. El 5 9 a 3 9 orientación es centrómero a
telo- mero. expresión de la proteína CBFB es ubicuo y forma un factor de
transcripción erodimeric Het junto con Cbfa1, CBFA2 (llamado AML1; véase la
Sección 3), o CBFA3.
los MYH11 gen se compone de 21 exones que abarcan 37 kb (Figura 17A). el 5 9

región de la MYH11 gen es frecuentemente elimina durante el proceso de inversión.
Por consiguiente, sólo el CBFBMYH11 gen de fusión se expresa de forma
reproducible en los casos de inv (16) (p13q22). 338 -
diez diferentes CBFBMYH11 Se han reportado la transcripción de fusión. La

nomenclatura utilizada en este informe se deriva y actualizado de la revisión por Liu et
al. 159 Más del 85% de los pacientes positivos tienen tipo A transcripción; otros dos
guiones tran- (D y E) representan casi el 5% cada uno, mientras que todos los otros
representan casos únicos. 160-163 Las incidencias relativas dadas en la Figura 17b
para los tipos A, D y E se basan en una compilación literatura de aproximadamente
200 reportado CBFBMYH11 CBFB-A-B1↔MYH11
transcritos de fusión. Dos clases diferentes de puntos de interrupción se pueden ver en el CBFB Figura 18 El bromuro de etidio-manchado geles de agarosa que muestran una
gene. Debido a la ausencia de un ser humano CBFB experimento de dilución de la línea celular ME-1 ( CBFBMYH11 tipo A transcripciones) con el
enfoque de PCR anidada (a) y una dilución de experi- ment de un inv (16) paciente -positivo ( CBFBMYH11
mapa genómico, las dos clases se hará referencia a como el nucleótido HUMCBFB 378
transcripciones de tipo D) con una externa ↔ cebadores B (b).
(también referido como 399), cuyos puntos de ruptura están probablemente situado en el
intrón 4, y el nucleótido HUMCBFB 474 (también referido como 495), cuyos puntos de
ruptura están probablemente situado en intrón 5. Estos últimos puntos de interrupción se
producen en casi el 99% de los casos. heterogeneidad punto de ruptura es mucho más
marcada en el MYH11 gen, ya que siete exones diferentes (de los exones 7 a 13) son de
forma variable incluyen en transcritos de fusión, como se indica en la Figura 17b. Todos
los puntos de interrupción de fusión distintos tipos C y H se producen en los límites de anomalías, M2, M5 y, con menor frecuencia, M1, M6 y M7. 170 La inv (16) (p13q22)
exón. también se encuentra en raros casos de LMC en crisis blástica, síndromes
mielodisplásicos, y therapyrelated LMA. 171172
La inv (16) (p13q22) se asocia generalmente con un pronóstico relativamente
bueno, 164165 aunque esto no es universal. 166 La naturaleza sutil de los cambios del El valor de detección de CBFBMYH11 transcripciones durante el seguimiento se
cariotipo en inv (16) prestan sus citogenética dif detección fi culto, particularmente di fi culto de evaluar debido a un número limitado de pacientes analizados en cada
después de R bandas o cuando su presencia no se sospecha de hallazgos serie. Un grupo detecta la persistencia de CBFBMYH11 en remisión a largo plazo
morfológicos. Por estas razones, CBFBMYH11 RT-PCR positividad pero inv (16) tras el TMO alogénico usando PCR anidada. 173 Por el contrario, otros han informado
negatividad no es infrecuente. 167-169 CBFBMYH11 de la desaparición de CBFBMYH11 transcripciones en pacientes con seguimiento a
largo plazo de seguimiento. 174-178 Será importante para determinar el valor clínico de CBFBMYH1
transcripciones se encuentran en casi 10% de de novo LMA. 170 monitoreo en serie más grande.
Aunque la mayor parte (| 50%) de estas leucemias corresponden a M4Eo de AML, CBFBMYH11
transcripciones también se han encontrado en muchos otros tipos de AML, incluyendo
M4 sin eosinofílica
1919
Tabla 19 Los tamaños de los productos de PCR y registrar las sensibilidades de CBFBMYH11 conjuntos de cebadores en las pruebas de RT-PCR
UNA ↔ B1 UNA ↔ B2 do ↔ D1 do ↔ Un D2 ↔ B1 + C ↔ Un D1 ↔ B2 + C ↔ D2 E5 ↔ D1 E5 ↔ D2
escribe un - 418 - 271 - 271 - 417

tipo B - 630 - 483 - 483 - 679
escriba C - 811 - 664 - 664 - 810
escriba D 338 (1138) 155 (991) 155 (991) 301 (1137)
tipo E 545 (1345) 362 (1198) 362 (1198) 508 (1344)
tipo F - 322 - 175 - 175 - 321
el tipo G 242 (1042) 59 (895) 59 (895) 205 (1041)
escriba H 344 (1144) 161 (997) 161 (997) 307 (1143)
Tipo i - - - - - - - -
escriba J - 1033 - 886 - 886 - 1032
ME-1 (tipo A) N / A una - 2 N/A - 3 N/A - 4 N/A - 3

Los pacientes - 2 - 3 - 2 - 3 - 5 - 4 - 2 - 3
una NA: no aplicable.
Los resultados del diseño de cebadores de PCR y las pruebas es un fi c deleción sitio-específica entre TAL1 y un gen situado aproximadamente a 90 kb
corriente arriba, SIL (SCL interrumpiendo locus). 181
Los cebadores A, C y E5 9 se encuentran en 'exón 4' de la CBFB Esta supresión coloca la TAL1 el marco de lectura bajo el control de la SIL promotor,
gen de modo que ambos tipos de CBFB los puntos de interrupción pueden ser que se expresa en las células T. Un modo adicional de TAL1 desregulación es la
cubiertos (Figura 17b). Los cebadores B1 y D1 se colocan en la unión de MYH11 los expresión 'aberrante' de TAL1
exones 8 y 9 y en el exón 8, respectivamente. Esto implica que se pueden utilizar sin reordenamiento genético aparente, que se estima que se producen en el 5-10% de
T-ALL. 182
para la detección de MYH11 CBFB- transcripciones de tipo D, E, G y H, en conjunto
repre- resentir 10-15% de los casos. Los cebadores B2 y D2 son posi- itioned en MYH11 los TAL1 gen se compone de ocho exones que abarcan 16 kb (Figura 19). El
exón 12 y por lo tanto puede ser utilizado para virtualmente todos los demás CBFBMYH11primer cuatro son exones alternativos (1a, 1b, 2a y 2b). los TAL1 el marco de lectura
variantes, excepto para el tipo I. La posición precisa de los siete cebadores y sus se encuentra en los exones 4, 5 y 6, dando una proteína de 42 kDa, que es un factor
secuencias se dan en la Tabla 18. de transcripción de la familia básica hélice-bucle-hélice (bHLH). Se heterodimeriza
con miembros bHLH ubicuos de la familia E2A (E12, E47, HEB) y es esencial para
el desarrollo de todos los linajes hematopoyéticos, pero su función en LLA-T no está
Dos variantes de corte y empalme alternativa más débiles de tipo A se han identificado fi, claramente definida. 183
con la adición alternativa de 31 nucleótidos, ya sea debido a un sitio donante de corte y
empalme alternativo de la última CBFB los SIL gen se compone de 18 exones que abarcan 70 kb. Los primeros dos
exón o al corte y empalme alternativo de MYH11 exón 11. 163 exones (1a y 1b) son no codificante. SIL función no está bien definida pero
La prueba de sensibilidad se realizó mediante experimentos de dilución con la constituye un miembro de la familia del gen temprano inmediata-. 184
línea celular ME-1 (inv (16) de tipo A) y varios pacientes portadores de inv (16) de tipo
A, D o E. Los experimentos de dilución individuales de PCR alcanzaron SILTAL1 fusiones son ilegítimos reordenamientos J V (D), que no son visibles
consistentemente sensibilidades de 10 - 2 / 10 - 3, mientras que los experimentos de PCR por citogenética clásica. SIL contiene tres sitios de deleción donante (sildb1 a
anidadas alcanzaron 10 - 4 / 10 - 5 ( La Figura 18 y la Tabla 19). sildb3), uno de los cuales (sildb1) se utiliza en la gran mayoría (98%) de los casos. TAL1
contiene siete sitios aceptor de deleción (taldb1 a taldb7), con dos bienestar
involucrado en casi todos casos (Taldb1 y

taldb2). 38,39,181,185-188 En todos los casos menos uno, estos mentos rearrange- crean
SECCIÓN 9. microdeleción intra-cromosómica 1p32 en el SILTAL1 gen alternativas transcripciones de fusión que contienen la totalidad SIL exón 1a y TAL1 exón
de fusión 4. Estos código transcripciones para una proteína de TAL1 normal de 42 kDa. Un
solo caso con un sitio de deleción donante situado entre TAL1 los exones 4 y 5
E Delabesse 1, AW Langerak 2, D Leboeuf 1, ILM Wolvers- Tettero 2, JJM van Dongen 2 y (taldb6) se ha descrito. 185 SIL exón 1 es, por consiguiente fusiona directamente a TAL1
EA Macintyre 1 1 Departamento de Hematología, Hospital Necker-Enfants exón 5; este los códigos de transcripción de la proteína de 22 kDa TAL1 más corto.
Malades, París, Francia; y 2 Departamento de Inmunología, Universidad Debe, sin embargo, se observó que las proteínas TAL1 en T-ALL explosiones con TAL1
Erasmus de Rotterdam, Rotterdam, Países Bajos deleciones sólo se han analizado en un número limitado de casos. 182
Numeroso SIL-TAL1- líneas positivas de células T han sido caracterizarse,

incluyendo RPMI8402, CEM, HSB2 y MOLT-16. 39
Fondo
Los puntos de ruptura de ADN de los tres sitios de donante-supresión en el SIL gen
La t (1; 14) (p32; q11) translocación fue primer caracterizado y los siete sitios de aceptor-supresión en el TAL1
1984. 179 Se trata de la TCRD locus en el cromosoma 14q11 y la TAL1 gen (las gen se muestra en la Figura 19. Estos se agrupan en el sitio de secuencias de señal
células T gen leucemia aguda 1), también ident- i fi cada como SCL ( leucemia de de reconocimiento de recombinasas heptámero-similares. La gran mayoría (casi
células madre) o TCL5 ( T gen leucemia de células 5), en el cromosoma 1p32. 180 La 90%) de SILTAL1 deleciones se encuentran entre sildb1 y taldb1, tald1 ( TAL1- tipo
translocación no modifica el TAL1 el marco de lectura, pero induce aberrante TAL1 de deleción
1). 38,39,186 Otra deleción involucrados con frecuencia está entre sildb1 y taldb2, tald2. 38,39
expresión. Un modo mucho más frecuente de TAL1 desregulación Todos los demás sitios de eliminación han sido
1920
Contiene SIL exón 1a y exon1b empalmados a TAL1 los exones 3 y 4 (tipo III) o SIL exón
una 1a directamente empalmado a TAL1 exón 4 (tipo I) (Figura 19b y en la Tabla 21). 189
SIL TAL1 ( 1p32)
~ 90 kb SILTAL1 transcripciones se encuentran exclusivamente en T-ALL. 188189

1a 1b 2 1a 1b 2b2a 3 4 5 6
los SILTAL1 RT-PCR descrito aquí detecta todo SILTAL1
tachaduras aparte del caso reportado con una sola TAL1
tel deleción entre el exón 4 y el exón 5, ya que la TAL1 cebadores están localizados en
1 32 4 3 2 51 7 6 el exón 4 (Figura 19b). También no detecta
95% 5% 90% TAL1 translocaciones o expresión 'aberrante' de TAL1 sin aparente
reordenamiento. Los datos relativos a la incidencia de
SIL TAL1 los puntos de interrupción
los puntos de interrupción
SILTAL1 supresiones se basan en gran medida en la detección genómica de tald1 y
tald2. La incidencia en la infancia LLA-T está acoplado estimación en aproximadamente
5-25% de los casos. 38,39,188 Un único estudio sugiere que estas deleciones genómicas
están ausentes en adultos T- TODOS. 190 SILTAL1 transcripciones se han encontrado en
segundo el 26% de la niñez T-ALL y 16% de los adultos T-ALL, predominantemente en adultos más
III
jóvenes. 188
tipo 1a 1b 3 4 5
1 128 211 60 216 663 La detección de tald1 y tald2 a nivel del ADN no tenía significación pronóstica fi en
II 1a 3 4 5 una serie retrospectiva de la infancia LLA-T, 185 pero estos objetivos se han utilizado
con éxito para si- bajo hacia arriba. 6191 El valor de SILTAL1 detección de RT-PCR en
127
la evaluación Nostic prog- y seguimiento es desconocida, pero actualmente están
yo 1a 4 5
siendo analizados en un estudio prospectivo manera (ensayo LALA94 francés
coordinado por JA Gabert, Marsella, Francia).
100 pb
TAL1
B-384
SIL-A TAL1-D
82 280 Los resultados de diseño de cebadores PCR y pruebas
TAL1-E3' Es importante tener en cuenta que SILTAL1 RT-PCR es estrictamente dent depende la
451
presencia de DMSO al 10%. No fue posible identificar pares aceptables de cebadores
Figura 19 (A) Diagrama esquemático de la estructura exón / intrón del que permiten una verdadera anidada RT- PCR, principalmente porque el SIL cebadores
la SIL y TAL1 genes, que están implicados en la microdeleción en 1p32. La numeración exón y la tuvo que ser diseñado en el pequeño rica en GC SIL exón 1a (| 200 pb). Por esta razón,
posición de los diversos puntos de interrupción en el SIL y TAL1 genes se indican. En la gran un protocolo semi-anidada con una sola SIL cebador fue desarrollado (Tabla 20 y la
mayoría de los casos las SIL punto de interrupción 1 se utiliza en combinación con TAL1 punto de Figura 19b). Tabla 21 resume el tamaño de los productos de RT-PCR de los diferentes SILTAL1
ruptura 1 o 2. (b) tres tipos principales de SILTAL1 transcritos de fusión se forman mediante corte
empalme transcripción variantes usando las diversas combinaciones de cebadores.
y empalme alternativo de SIL exón 1b y TAL1 exón 3. Los números en virtud de la fusión de las
análisis individual PCR con la A ↔ B, A ↔ D, o A ↔ E3 9 las combinaciones de cebadores
transcripciones de genes se refieren a los primeros (5 9) de nucleótidos del exón implicados,
excepto cuando el último (3 9) de nucleótidos del gen aguas arriba se indica. Las flechas indican la dieron como resultado sensibilidades de 10 - 2 a 10 - 3, mientras que el
posición relativa de los cuatro cebadores. Debido al pequeño rica en GC SIL exón único 1a SIL cebador
podría diseñarse, lo que implica que un enfoque semi-PCR anidada se utiliza para la detección
sensible de SILTAL1 transcripciones. Los números bajo los códigos de imprimación se refieren al
5 9 posición de nucleótidos de cada cebador (véase la Tabla 20).
línea celular CEM
5.10- 3
MWM
HL60
10- 1
10- 2
10- 3
10- 4
10- 5
10 0
HO2
pb
Tabla 20 Los cebadores para el análisis de RT-PCR de del (1) (p32; p32) con el
SILTAL1 gen de fusión

(tamaño)
SIL-A 82 (19) TCCCGCTCCTACCCTGCAA

TAL1-B 384 (18) CGCGCCCAGTTCGATGAC 351
TAL1-D 280 (18) CCGCGTCCCGTCCCTCTA 267 -
TAL1-E3 9 451 (19) CGTCGCGGCCCTTTAAGTC
111 -
SIL-A TAL1-D
↔ (semi-anidada)
encontrado en casos singulares solamente: tald3 (sildb1-taldb4), 39 tald4 (sildb1-taldb5), 39
tald5 (sildb2-taldb3), 187 tald6 (sildb1-
Figura 20 El bromuro de etidio-manchado gel de agarosa que muestra una
taldb6) 185 y tald7 (sildb3-taldb7). 188
experimento de dilución de ARN a partir de la SIL-TAL1- línea celular CEM positivo utilizando el
tres diferentes SILTAL1 transcripciones se forman por corte y empalme tiva
enfoque de PCR semi-anidada con la A ↔ B y A ↔ D combinaciones de cebadores. La línea
alterna- de los dos SIL exones 1a y 1b y TAL1 los exones 3 y 4. 188 La transcripción celular HL60 y H 2 O se utilizaron como controles tivos nega-. SILTAL1 variantes de empalme de
predominante (tipo II) contiene SIL tipo II y tipo III se detectó en la línea celular CEM (véase la Figura 19 y la Tabla 21).
exón 1a empalmado a TAL1 los exones 3 y 4. Las otras dos formas
1921
Tabla 21 Los tamaños de los productos de PCR y registrar las sensibilidades de SILTAL1 conjuntos de cebadores en las pruebas de RT-PCR
UNA ↔ segundo UNA ↔ re UNA ↔ segundo UNA ↔ E3 9
+ UNA ↔ re
tipo de variante de empalme III (1A.1b-3.4) 455 351 351 522

tipo II variante de empalme (1a-3.4) 371 267 267 438
tipo I de empalme variante (1a-4) 215 111 111 282
RPMI8402 - 2 - 3 - 4 - 2
CEM - 3 - 2 - 4 - 2
Tabla 22 Resumen de los conjuntos de cebadores de PCR estandarizados y su aplicabilidad
Cromosoma gen de fusión Nº de Estimado Recomendado para

aberración cebadores de PCR sensibilidad diagnóstico molecular
PCR sola PCR anidada TODOS AML
t (1; 19) (q23; p13) E2A-PBX1 5 10 - 3 / 10 - 4 10 - 4 / 10 - 5 + -

t (4; 11) (q21; q23) MLL-AF4 5 10 - 2 / 10 - 3 10 - 4 / 10 - 5 + + / - segundo
t (8; 21) (q22; q22) AML1-ETO 5 10 - 3 / 10 - 4 10 - 4 / 10 - 5 - +
t (9; 22) (q34; q11) BCR-ABL, p190 5 10 - 2 / 10 - 3 10 - 4 / 10 - 5 + + / - segundo
t (9; 22) (q34; q11) BCR-ABL, p210 5 ••• 7 una 10 - 3 / 10 - 4 10 - 4 / 10 - 6 + + / - segundo
t (12; 21) (p13; q22) TEL-AML1 5 10 - 2 / 10 - 4 10 - 4 / 10 - 5 + do -
t (15; 17) (q22; q21) PMLRARA 7 10 - 2 / 10 - 3 10 - 3 / 10 - 4 - +
inv (16) (p13; q22) CBFBMYH11 7 10 - 2 / 10 - 3 10 - 4 / 10 - 5 - +
microdeleción 1p32 SILTAL1 4 10 - 2 / 10 - 3 10 - 4 + re -
una Los cebadores inversos (B, D y E3 9) para BCR-ABL p190 y BCR-ABL p210 son idénticos.
segundo MLL-AF4 genes de fusión rara vez se observan en AML (Refs 60, 61). BCR-ABL genes de fusión se observan en el 1-2% de AML (Refs 114-116).
do Se han reportado; sólo unos pocos casos de LLA en adultos con t (21 12); estos pacientes eran todos menores de 30 años.
re Hasta aquí SILTAL1 genes de fusión sólo se han detectado en T-ALL.
semi-anidada A ↔ LICENCIADO EN LETRAS ↔ D PCR dio como resultado sensibilidades de 10 - 4 controles positivos y negativos con el fin de evaluar su Ance perform- en las
(Figura 20 y Tabla 21). condiciones locales.
La sensibilidad objetivo mínimo de 10 - 2 se alcanzó generalmente para
prácticamente todos los análisis de PCR sola, mientras que la PCR anidada análisis
generalmente alcanzó la sensibilidad objetivo mínimo de 10 - 4, a excepción de los
niveles de sensibilidad ocasionales de 10 - 3 En el caso de PMLRARA, que se sabe que
es un objetivo culto fi dif para la detección tiva sensi- (Tabla 22). Durante la fase final
Conclusión del estudio parecía que el uso de AmpliTaq Gold (PE-Biosystems, Foster City, CA,
EE.UU.) podrían mejorar aún más la sensibilidad.
Los extensos estudios de colaboración por parte de los 10 laboratorios durante un periodo de 4
años han dado lugar a un protocolo estandarizado RT-PCR (Tabla 3) y los conjuntos de Los participantes de la BIOMED-1 Acción concertada decidió optimizar y
cebadores de PCR para la detección de nueve fi aberraciones bien de cromosomas NED. El estandarizar los ensayos de RT-PCR usando PCR anidado, ya que la mayoría de los
protocolo y los cebadores se pueden utilizar para catión molecular clasi fi el momento del miembros están actualmente utilizando esta técnica. Sin embargo, debido al riesgo de
diagnóstico, es decir, para el grupo de riesgo clasi fi cación, así como para la detección de MRD, contaminación por producto de la PCR se transfieren, una estrategia alternativa se
es decir, para la evaluación de la efectividad del tratamiento. puede usar: una ronda siguió PCR por transferencia e hibridación con una sonda
interna, 124 que podría ser el cebador C o D. Esta estra- EGY fue probado por un
Tabla 22 resume la información acerca de los conjuntos de cebadores de PCR laboratorio (Marsella) y mostraron exceso de todas las sensibilidades similares a las
estandarizados y su aplicación diferencial para molecular clasi fi cación de ALL y AML en del procedimiento de PCR anidada.
el diagnóstico. Para fi ciente análisis PCR ef al momento del diagnóstico de un 96 pocillos
máquina de PCR permite el análisis lectivo COL- de aproximadamente 14 ALL o 10 El intercambio de experiencias entre los participantes oratorios en laboratorio, la
muestras de AML usando el A ↔ B conjuntos de cebadores y que incluyen todos los central de producción de los reactivos de normalización y ARN de control, y las
controles positivos y negativos relevantes para cada uno de aberración cromosómica. Todas reuniones regulares jugó un papel importante en la finalización con éxito de esta
las muestras de pacientes positivos deben ser confirmado con el 'desplazado' (control) C ↔ E3 acción concertada dades Europeas.
9 o E5 9 ↔ D conjuntos de cebadores. Mientras que los cebadores y protocolos
estandarizados presentados aquí proporcionan una base útil para la buena práctica de La complejidad de la normalización y control de calidad en los estudios clínicos
laboratorio, se debe enfatizar que cada laboratorio debe probar los cebadores y protocolos internacionales es frecuentemente subestimada y por lo tanto no se aborda
con adecuadamente. Los protocolos y primeros presentados en este informe pueden ser e
fi cientemente utilizado en múltiples
1922
estudios de centro y por lo tanto son altamente valiosos para los estudios clínicos, en referencias
particular los estudios de MRD multicéntricos. Sin embargo, las reuniones regulares, cada
1 San Miguel JF, Martínez A, Macedo A, Vidriales MB, Lopez-
uno seguido de un informe con los Acuerdos y puntos de acción, siguen siendo esenciales Berges C, Gonza'lez M, Caballero D, Garcia-Marcos MA, Ramos
para la preservación de la calidad y la innovación continua de los tics diagnosticable F, Fernández-Calvo J, Calmuntia MJ, Diaz-Mediavilla J, investigación Orfao A. El
moleculares. inmunofenotipo de la enfermedad mínima residual es un enfoque útil para predecir la
recaída en pacientes mia leuke- mieloide aguda. Sangre 1997; 90: 2465-2470. 2 Foroni L,
Coyle LA, Papaioannou M, Yaxley JC, Cole Sinclair MF,
Durante los últimos 2 años varios estudios de MRD basados en la PCR a gran
escala han demostrado claramente que la infor- mación cuantitativa acerca de los
Chim JS, Cannell P, Secker-Walker LM, Mehta AB, Prentice HG, Hoffbrand AV. detección
niveles de MRD es importante para el grupo de riesgo basados en MRD clasi fi
molecular de la enfermedad mínima residual en adultos y la leucemia linfoblástica aguda
cación. 2,3,5,6 Las técnicas de llamada cuantitativa en tiempo real PCR (RQ-PCR) infantil revela diferencias en la respuesta al tratamiento. Leucemia 1997; 11: 1732
ofrecen la posibilidad para la cuantificación rápida y reproducible de los niveles de
MRD sin manipulación posterior a la PCR, lo que impide la contaminación con 1741.
conductos pro- PCR. 133192193 Los laboratorios moleculares de la BIOMED-1 Acción 3 Diverio D, Rossi V, Avvisati G, De Santis S, Pistilli A, panel F,
concertada por lo tanto ahora han iniciado un gran grupo de estudio de 25 Saglio G, Martinelli G, Petti MC, Santoro A, Pelicci PG, Mandelli
F, Biondi A, Lo Coco FL. La detección temprana de la recidiva de la
laboratorios de 10 países europeos con el fin de estandarizar analiza la RQ-PCR del
polimerasa-transcriptasa análisis de reacción en cadena inversa prospectivo del gen de
cromosoma aberración raciones utilizando la técnica TaqMan. 194
fusión PML / RARalpha en pacientes con leucemia promielocítica aguda inscrito en el
multicéntrico GIMEMA-AIEOP ensayo 'AIDA'. GIMEMA-AIEOP multicéntrico 'AIDA'. Sangre
1998; 92:
784-789.
4 Coustan-Smith E, FG Behm, Sánchez J, Boyett JM, Hancock ML,
Raimondi SC, Rubnitz JE, Rivera GK, Sandlund JT, Pui CH, Cam- pana detección D.
inmunológica de la enfermedad residual mínima en niños con leucemia linfoblástica
apoyo subvención aguda. Lanceta 1998; 351:
550-554.
5 Cave' H, Van der Werff ten Bosch J, Suciu S, Guidal C, Waterkeyn
Este estudio en colaboración con el apoyo de una beca del programa BIOMED-1 de C, Otten J, Bakkus M, Thielemans K, Grandchamp B, Vilmer E. Clinical significación de
la Comisión Europea, es decir, el Con- acción concertada ' Investigación de enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda infantil. New Engl J Med 1998;
enfermedad mínima residual en leucemia aguda: normalización internacional y 339:
la evaluación clínica '(Subvención BMH-94-1675 CMT). JJMvD y AWL fueron 591-598.

6 Van Dongen JJM, Seriu T, Panzer-Gru¨mayer ER, Biondi A, Pong-
apoyados por el holandés Cancer Society / Koningin Wilhelmina Fonds (concesión
ers-Willemse MJ, Corral L, Stolz F, Schrappe M, Masera G, Kamps WA, Gadner H, Van
de 94 a 852 euros) y el Fondo Rotatorio de la Uni-versidad Hospital de Rotterdam
wering ER, Ludwig WD, Basso G, De Bruijn MAC, Cazzaniga G, Hettinger K, Van der
(subvención 1995-908); EAM y ED fueron apoyados por l'Asistencia Does-van den Berg A, Hop WCJ, Riehm H, Bartram CR. Valor pronóstico de la
Pública-Hospitales de París y le Fondation de France (Fondation contre la enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda en la infancia. Lanceta 1998; 352:
leucémie); JAG, EAM y ED fueron apoyados por l'Asociación para la Investigación 1731-1738. 7 Campana D, Pui CH. La detección de enfermedad mínima residual en
sobre el Cáncer (contrato 9623); VR y AB fueron apoyados por la Fundación M

Tettamanti y por el Consig- lio Nazionale della Ricerche (PF ACRO, conceder
leucemia aguda: avances metodológicos y clínica cance fi- signi. Sangre 1995; 85: 1416-1434.
92.02140 PF39.); SG y EG fueron apoyados por CNR-Progetto Finaliz- zato
8 Van Dongen JJM, Szczepan'ski T, de Bruijn MAC, Van den Beemd
Biotechnologie, Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer, y la Asociación
Italiana contra la Leucemia; AR y GD fueron apoyados por Associazione Italiana per MWM, De Bruin-Versteeg S, Wijkhuijs JM, Tibbe GJM, Van gas tel-Mol EJ, Groeneveld K,
la Ricerca sul Cancro, el Consejo Nacional de Investigación, proyecto de destino de Hooijkaas H. La detección de enfermedad residual mínima en pacientes con leucemia
Biotecnología, y Associazione Paolo Belli, Lotta alla Leu CEMIA; AP y PG fueron aguda. Las citoquinas Mol Ther
1996; 2: 121-133.
apoyados por Junta Nacional de Investigac¸a~o Cientı
9 San Miguel JF, Van Dongen JJM, Bartram CR, Parreira A, WO rm-
Ann B, Biondi A, Porwit MacDonald A. Investigación de enfermedad mínima residual
(MRD) en la leucemia aguda (AL): estandarización internacional y evaluación. En: SS
Baig (ed.). Investigación del Cáncer soportado bajo BIOMED-1. Investigación Biomédica
y de la Salud.
'fi ca E Tecnolo'gica / Ministe'rio da Ciencia e IOS Press: Amsterdam, 1998; 24: 300-306. 10 Pongers-Willemse MJ, Seriu T, Stolz F,
D'Aniello E, Gameiro P,
Tecnologia (subvención JNICT: PECS / C / SAU / 66/95); MG-D y JFSM fueron
Pisa P, Gonza'lez M, Bartram CR, Panzer-Gru¨mayer ER, Biondi
apoyados por los Fondos de Investigacio'n de la Seguridad Social (beca 98/1156),
A, San Miguel JF, Van Dongen JJM. Los cebadores y protocolos para la detección
Comisio'n Interminesterial de Ciencia y Tecnología (SAF otorga 92/0041, 94/0308 estandarizada de enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda utilizando
SAF), Junta de Castilla y León (subvención SA 26/96) y Asociacio'n Española inmunoglobulina y de células receptor reordenamientos del gen T y TAL1 deleciones
Contra el cáncer (94-96 an~os). como dianas de PCR: Informe del BIOMED-1 Acción concertada: investigación de mini-
enfermedad residual mal en la leucemia aguda. Leucemia 1999; 13:
110-118.
11 Lu'cio P, Parreira A, Van den Beemd MWM, Van Lochem EG,
Van wering ER, Baars E, Porwit-MacDonald A, Bjorklund E, Gaipa G, Biondi A, Orfao A,
Expresiones de gratitud Van Dongen JJM, San Miguel JF. Análisis citométrico de flujo de la diferenciación de
células B normal: un marco de referencia para la detección de enfermedad mínima
residual en precursor-B-ALL. Leucemia 1999; 13: 419-427. 12 De Klein A, Geurts van
Agradecemos Ellen J van Gastel-Mol, Ingrid LM Wolvers-Tettero, y W Marieke Kessel A, Grosveld G, Bartram CR,
Comans-Bitter para la síntesis de los mers pri- PCR, el cultivo de las líneas celulares, y
la realización de las las extracciones de ARN. Se agradece al Dr. Wojciech Rychlik por Hagemeijer A, Bootsma D, Spurr NK, Heisterkamp N, Groffen J, Stephenson JR. Un
oncogén celular se transloca al cromosoma elphia Philad- en la leucemia mieloide
sus consejos y el puerto SUP- en el diseño de los conjuntos de cebadores y el Dr. Hans
crónica. Naturaleza
G Drexler para proporcionar la amabilidad de las líneas celulares. Agradecemos a
mil novecientos ochenta y dos; 300: 765-767.
Danielle Korper- shoek por su apoyo secretarial continua y alquitrán van Os para hacer 13 Hermans A, Heisterkamp N, Von Lindern M, Van Baal S, Meijer
las figuras. D, Van der Plas D, Wiedemann LM, Groffen J, Bootsma D, Veld Gros-G. fusión única de bcr
y C- abl genes en Filadelfia
1923
cromosoma leucemia linfoblástica aguda positiva. Célula 1987; 34 Romana SP, Mauchauffe' M, Le Coniat M, Chumakov I, Le Paslier
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Leukemia (1999) 13, 1901-1928

• 1999 Stockton Press Todos los derechos reservados 0887-6924 / 99 $ 15.00

Estandarizada análisis RT-PCR de los transcritos de gen de fusión de aberraciones cromosómicas en

Informe de la BIOMED-1 Acción concertada: Investigación de

El seguimiento de pacientes con leucemia aguda durante y después del tratamiento

JJM van Dongen et al

Líneas celulares una Los pacientes Responsable colaborando

inmunofenotipo métrica, análisis de PCR de los genes de Ig y TCR, y el análisis Introducción

Varios estudios clínicos han demostrado que el cromosoma aberración raciones en

UNA B1 B2 análisis de PCR de los genes de fusión se basa en el diseño de cebadores

cb de interrupción en diferentes pacientes se extienden por 10 kb o más, las distancias que

JJM van Dongen et al

uso de controles positivos comunes (líneas celulares y algunas muestras de los

t (4; 11) MLL HUMHRX L04284 31 de diciembre 1994

AF4 HUMAF4Y L13773 31 de diciembre 1994

t (15; 17) LMP HUMPML M73778 08 Ene de 1995

MYH11 HUMMHCAAA D10667 18 de Ene de 1996

fiable identificación de producto de PCR.

Después de los procedimientos de diseño y las pruebas iniciales en paralelo de

Durante las primeras reuniones de la BIOMED-1 Acción concertada, varios

JJM van Dongen et al

4. Segunda ronda de PCR para la PCR anidada

generación de rápida máquina de PCR.

electroforesis en gel de agarosa. Fondo

JJM van Dongen et al

E2A-C PBX1 401 -

conjuntos de cebadores en las pruebas de RT-PCR

JJM van Dongen et al

Universita' Milano, Ospedale San Gerardo, Monza, Italia; y 3 Departamento

MLL-A 3916 (17) CCGCCTCAGCCACCTAC

JJM van Dongen et al

tipo 7 8 9 <10% lactantes

4012 1628 1683 1738

e8-e4 8 4 5 6 raro <5%

e9-e5 8 9 5 6 7 8 9 <10% 16%

e9-e4 8 9 5 7 8 9 raro 25%

e10-e6 8 9 10 raro <5%

e10-e5 8 9 10 5 <10% <5%

e10-e4 8 9 10 7 8 9 18% 39%

E11-e6 8 9 10 11 5 6 7 8 9 raro <5%

E11-e5 8 9 10 11 5 6 7 8 9 <10% rara

E11-e4 8 9 10 11 4 5 6 7 8 9 55% <5%

100 pb MLL-A 3 AF4-B

JJM van Dongen et al

Los resultados de diseño de cebadores PCR y pruebas

MLL-E5' ↔ AF4-D posición de los cebadores se resumen en la Tabla 6.

Individual PCR con A ↔ ANTES DE CRISTO ↔ D, y E5 9 ↔ D conjuntos de cebadores

HO2 ( La Figura 5 y la Tabla 7).

SECCIÓN 3. t (8; 21) (q22; q22) con el AML1-ETO gen de fusión

Figura 5 El bromuro de etidio-manchado geles de agarosa que muestran dilución Francia

(Gen de translocación mieloide en el cromosoma 8). los AML1

UNA ↔ segundo do ↔ re UNA ↔ segundo E5 9 ↔ re

JJM van Dongen et al

una línea celular KASUMI-1 1909

503 542 796 953 4 1057 275 413 655 745

Los tamaños de los

productos de PCR en pb 395 260 260 338

Cebador 5 9 Posición una Secuencia (5 9 -3 9)

frecuente en el subtipo de AML-M2, donde se encuentra en el 20-40% de los casos. 83 También

de la terapia adaptada al riesgo basada en la evaluación genética citogenética y / o

JJM van Dongen et al

BCR-e1-A 1479 (21) GACTGCAGCTCCAATGAGAAC

D De Micheli 1, C Manzoni 2, Un Rambaldi 2 y G Saglio 1 1 Departamento de