Medios Procedimientos Artículos

ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS.
Agar Papa
Fórmula por Litro
Papa 200g
Sacarosa 20g
Sulfato de amonio 1g
Cloranfenicol 0.4g
Medio de Transformación de Hanson (1992).
Fórmula por Litro.
Glucosa 80g
Sulfato de Amonio 7.92g
Fosfato diácido de potasio 5.0g
Sulfato de Magnesio 1.0g
2 mililitros de una solución de elementos traza preparada en 100ml.
Sulfato ferroso 0.1g

Sulfato de Cobre 0.015g
Sulfato de Zinc 0.16g
Sulfato de Manganeso 0.01g
Molibdato de Amonio 0.1g.
Dinitrito de Cobalto *6H2O 0.01g
Medio de Transformación de Hanson (1993).
Fórmula por Litro.
Glucosa 80g
Nitrato de Amonio 4.8g
Fosfato de potasio dihidrógeno 5.0g
Sulfato de Magnesio 1.0g
2 mililitros de una solución de elementos traza preparada en 100ml.
Sulfato ferroso 0.1g

Sulfato de Cobre 0.015g
Sulfato de Zinc 0.16g
Sulfato de Manganeso 0.01g
Molibdato de Amonio 0.1g.
Medio De Biotransformación de Fraga (2000; 2000b).
Fórmula por litro
Glucosa 8%
Nitrato de amonio 0.48%
Sulfato de magnesio heptahidratado 0.1%
Fosfato di – ácido de potasio 0.5%
Solución de elementos traza 0.2%

- Sulfato ferroso 0.1%
- Sulfato férrico pentahidratado 0.015%
- Sulfato de zinc heptahidratado 0.16%
- Sulfato de magnesio tetrahidratado 0.01%
- (NH4)6Mo7O24 * 4H2O 0.1%
pH 5 – 6.
Medio de Transformación de Mitchel y Jackson (1982).
Formula por litro
Extracto de malta 17g

Peptona 3g
pH: 5.4
ANEXO 2
PROCEDIMIENTO EMPEADO PARA LA REALIZACIÓN DE CULTIVOS MONOSPÓRICOS.
ANEXO 3.
MATERIALES Y PROTOCOLO EN LA DETERMINACIÓN DE AZUCARES

REDUCTORES POR EL MÉTODO COLORIMÉTRICO DE SOMOGYI Y
NELSON.
AZUCARES REDUCTORES POR SOMOGYI Y NELSON: Cuando los azúcares
reductores son calentados en una solución alcalina de cobre cúprico, estabilizado con
tartratos, el cobre es reducido y precipitado como óxido cuproso. El óxido cuproso
formado es proporcional a la cantidad de azúcar reducida presente. El cobre reducido
puede ser determinado colorimétricamente por la medición de la cantidad de molibdeno
azul formado cuando el reactivo de Nelson es adicionado.
PROTOCOLO.
1. Tomar de 5 a 50µl del patrón de glucosa.
2. Adicionar 200µl del reactivo de Somogyi I y 50µl del reactivo Somogyi II.
3. Calentar al baño de maría a 92ºC durante 20 minutos (hasta ebullición).
4. Enfriar a temperatura ambiente.
5. Agregar 250µl del reactivo de Nelson y 750 µl de agua destilada.
6. Debe presentarse coloración azul.
7. Dejar en reposo 4 horas.
8. Medir absorbancia a 660nm con lámpara de luz UV.
MATERIALES.
Reactivo Somogyi I (Para 250ml).

Tartrato de sodio y Potasio 3.75g
Carbonato de Sodio 7.5g
Sulfato de Sodio 45g
Se mezcla, se lleva al volumen y se guarda.
Reactivo Somogyi II (Para 250ml)

Sulfato de Cobre prehidratado 4g
Sulfato de Sodio 36g
Mezclar y llevar al volumen.
Reactivo de Nelson (Para 500ml)

Molibdato de Amonio en 450ml de agua destilada 25g
Ácido sulfúrico concentrado 21ml
Arsenato monoácido de sodio en 25ml de agua destilada 0.6g
Se mezcla, se lleva al volumen y se incuba a 37ºC por 24horas. Se almacena en botellas

opacas y libre de la luz directa.
ANEXO 4.
BIORREACTORES CONSTRUIDOS PARA EL CULTIVO A UN LITRO DE

LAS CEPAS SELECCIONADAS PARA EL PROCESO DE
BIOTRANSFORMACIÓN.
A. Modelo DP-1-1. El aire impulsado por un compresor, sale por el difusor de acuario y es distribuido
por la agitación de la barra magnética.
ANEXO 5.
CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS SELECCIONADAS COMO

BIOTRANSFORMADORAS POTENCIALES DE LOS SUSTRATOS
DITERPÉNICOS.
1. Curva de crecimiento de la cepa de Penicillium sp. EB-130-01 en el medio de
transformación reportado por Hanson (1993) (Ver Anexo 1).
Esta curva de crecimiento permitió conocer el comportamiento de la cepa en el medio

de transformación empleado, el cual posee una relación 20:1 de carbono : nitrógeno. Se
determinó la adición del sustrato al cultivo, a las 52 horas de crecimiento con un inóculo
de 1x107 conidios por mililitro, momento en el cual se presenta una biomasa de
16.7mg/ml, suficiente para resistir el estrés que sufre el hongo por la adición del
sustrato disuelto en solventes orgánicos.
Adicionalmente, se observa un descenso significativo en la concentración de glucosa,

que teóricamente coincide con el agotamiento de la fuente de nitrógeno y la producción
de enzimas del metabolismo secundario.
2. Cinética de crecimiento de la cepa nativa Penicillium sp. EB-406-05 en el medio

de transformación reportado por Fraga (2000) (Ver Anexo 1).
De acuerdo con la curva de crecimiento, se determinó la adición del sustrato a las 48
horas de cultivo, ya que en este momento se observa una disminución total de la
concentración de glucosa en el medio, lo cual indica el inicio de la idiofase y por tanto
de la producción de metabolitos secundarios.
ANEXO 7.
COMPARACIÓN DE LOS DATOS DE 1HMNR DE LA SUSTANCIA Mc2

OBTENIDA DE LA BIOTRANSFORMACIÓN DE 13-EPIESCLAREOL POR LA
CEPA Mucor sp. EB-321g, FRENTE A LOS DATOS REPORTADOS POR
ABRAHAM (1994).
1
HMNR 19-hidroxi esclareol. Mc2
Abraham (1994)*.
MS m/z: 306.2559 MS m/z: 306
0.78 3H, s, H-20 H
0.75 H
0.94 1H, m, H-3a
0.95 H
0.97 3H, s, H-18 H
0.99 1H, m, H-5
1.15 3H, s, H-17 H
1.25 H
1.28 3H, s, H – 16 H
1.30 H
1.50 2H, m, H – 2 H
1.70 H
1.76 1H, m, H – 3 b
3.15 H
3.44 1H, d, J = 11 H2Z H-
19
3.40 H
3.50 H
3.68 1H, d, J = 11Hz, H –
19 `
5.0 H
5.04 1H, dd, J = 10, 1Hz, H
– 15
5.1 H
5.21 1H, dd, J = 17, 1Hz, H
– 15
5.3 H
5.7 H
5.8 H
5.93 1H, dd, J = 17, 10z,
H14
6.05 H
6.15 H
* ABRAHAM W.R. 1994. Microbial hydroxylation of sclareol. Phytochemistry. Vol. 36; p. 1421-1424.
ANEXO 8.
CORRELACIÓN DE LA TASA DE CRECIMIENTO RADIAL Y LA TASA DE

CRECIMIENTO ESPECÍFICO EN EL MEDIO PDC-X-4910 DE HONGOS
FILAMENTOSOS AISLADOS DE PARTES AÉREAS DE LA PLANTA Espeletia
barclayana.
Zulma Astrid Moreno, Rubén Torrenegra.

Grupo de Investigación en Biotransformación, Departamento de Química, Pontificia Universidad
Javeriana.
INTRODUCCIÓN
En el estudio del crecimiento de hongos filamentosos resulta importante la
determinación del crecimiento radial y el crecimiento específico en medios
determinados, ya que actualmente estos parámetros son empleados como factor decisivo
en la estandarización de procesos de cultivo en laboratorio, y en el presente proyecto
dicho conocimiento aporta al desarrollo de un proceso adecuado para la
biotransformación de terpenoides obtenidos de plantas, por los hongos filamentosos
aislados.
Para la valoración del crecimiento específico y del crecimiento radial de un hongo

filamentoso, en algunos estudios se han utilizado solidificantes diferentes al agar – agar,
tales como el Pluronic F127 y el Carragenan X-4910, los cuales han proporcionado
buenos resultados.
En este trabajo se realizó la determinación de la tasa de crecimiento radial y la tasa de

crecimiento específico de hongos filamentosos, aislados de las partes aéreas de
Espeletia barclayana, empleando un solidificante diferente al agar, como fue el
carragenan X-4910, el cual, gracias a su composición física permite mantener y separar
la biomasa del gel para determinar fácilmente la tasa de peso seco a una temperatura no
destructiva para el micelio del hongo (60ºC). Además, este gelificante evita la presencia
de residuos adicionales que pueden alterar el peso de la biomasa estudiada.
EXPERIMENTACION
Para establecer la tasa de crecimiento radial se realizó un paralelo entre dos medios
sólidos: Papa Dextrosa Carragenan (PDC-4910)1 y Agar Papa Dextrosa (PDA),
obteniendo resultados similares para la mayoría de los hongos, los cuales fueron
sometidos a las mismas condiciones de crecimiento extrínsecas (temperatura y
humedad) e intrínsecas (pH y concentración).
Se evaluaron 22 cepas de hongos pertenecientes a los géneros Curvularia, Mucor,

Trichoderma, Acremonium, Cladosporium y Fusarium, aislados de Espeletia
barclayana, las cepas se encuentran relacionadas en el trabajo.
La determinación del crecimiento radial se realizó por mediciones del diámetro de las
colonias fúngicas en los medios de cultivo sólidos, con la ayuda de reglillas. Después de
1
Extracto de papa 200g, Glucosa 20g, Carragenen 20g. pH 5.6.
medir el crecimiento radial, la muestra se sometió a desgelificado a 60ºC durante 20
minutos, se realizó lavado con agua destilada también a 60ºC para retirar los residuos
del gel y se secó por 24 horas, al cabo de las cuales se realizó pesaje a presión reducida.
Estos procedimientos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones reportadas por
Prosser (1991)2 en su artículo sobre el mecanismo y la cinética de crecimiento de
microorganismos filamentosos.
Cada ensayo y análisis se realizó por duplicado, aplicando una prueba de ANOVA,
definiendo un margen de error • = 0.05 con una confiabilidad del 95%.
Las tablas que contienen los datos de la tasa crecimiento radial y la tasa de crecimiento
específico (peso seco de biomasa) determinados para las cepas de hongos filamentosos
estudiadas, se encuentran en el Laboratorio de Bioensayos del Departamento de
Química de la Pontificia Universidad Javeriana.
De acuerdo con los resultados obtenidos se determinó que para la medición de la tasa de
crecimiento radial de hongos filamentosos en medio sólido, puede emplearse tanto
Carragenan X-4910 como Agar, como factor solidificante de los medios de cultivo. El
empleo de Carragenan X-4910 resultó ser realmente apropiado para la determinación
del peso seco de los hongos estudiados, ya que como se corrobora en los reportes de
Reeslev (1995)3, en su estudio sobre la comparación del peso seco de biomasa y el
crecimiento radial en medios solidificados con diferentes compuestos gelificantes, la
carragenina posee característica hidrofílicas, requiriendo una temperatura de 60ºC para
disolverse en solución acuosa, lo que resulta bastante práctico en la determinación de la
tasa de crecimiento específico de hongos filamentosos.
Al correlacionar los datos obtenidos en la tasa de crecimiento radial, respecto a la tasa

de peso seco, se determinó que de los dos métodos empleados son útiles para hallar el
promedio de biomasa total que puede producir un hongo filamentoso.
2
PROSSER J.I, and TOUGHT A.J. 1991. Growth mechanism and growth kinetics of filamentous
microorganism. Review Biotechnology. 10:253-274.
3
REESLEV M., and KJOLLER A. 1995. Comparison of biomass dry weights and radial growth rates of
fungal colonies on media solidified with different gelling compounds. Applied and Environmental
Microbiology.0
ANEXO 9.
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA DE LA CEPA

NATIVA DE Fusarium oxysporum EK-14, SOBRE EL β-D–GLUCOPIRANOSIL -
ÉSTER DEL ÁCIDO (-) 17 - ( β - GLUCOPIRANOSILOXIL) – 16 – OL –
KAURAN – 19 – OICO E IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS
SECUNDARIOS.
Ana Mercedes Medina, Rubén Torrenegra.
Grupo de Investigación en Biotransformación, Departamento de Química, Pontificia Universidad
Javeriana.
INTRODUCCION.
El β-D–glucopiranosil - éster del Ácido (-) 17 - (β - glucopiranosiloxil) – 16 – ol –

kauran – 19 – oico, es un diterpeno glicosilado, aislado de hojas y flores de Ageratina
vacciniaefolia por el GIFUJ.
Hongos filamentosos como Giberella fujikuroi, Fusarium sp., Aspergillus sp. y Mucor
sp. han sido reportados como transformadores de diferentes diterpenos. El género
Fusarium tiene una amplia importancia biotecnológica en la producción de metabolitos
secundarios con propiedades antibacterianas, antifúngicas y anti-inflamatorias. En los
últimos años la búsqueda de nuevas sustancias antimicrobianas a partir de fuentes
naturales ha aumentado por la gran biodiversidad que ofrecen, además debido al
desarrollo de patógenos resistentes; por tal motivo, el GIBUJ quiso, a partir del presente
trabajo, ampliar sus objetivos hacia la búsqueda de estas sustancias, durante los ensayos
de biotransformación.
En este trabajo se evaluó la capacidad transformadora de la cepa nativa de Fusarium

oxysporum EK–14 sobre el β-D–glucopiranosil - éster del Ácido (-) 17 - (β -
glucopiranosiloxil) – 16 – ol – kauran – 19 – oico, en un medio de transformación para
diterpenos y paralelamente se aisló, purificó e identificó el metabolito secundario
mayoritario, producido por la cepa de Fusarium oxysporum, durante el proceso de
biotransformación. Posteriormente se evaluó la actividad antibacteriana y antifúngica
del la sustancia obtenida.
EXPERIMENTACIÓN.
El desarrollo de esta investigación se llevó a cabo con cepas fúngicas pertenecientes al

cepario del GIBUJ, aisladas de Espeletia killipii (EK) y Espeletia barclayanaCuatr.
(EB), las cuales pertenecen a géneros reportados en literatura como transformadores de
diterpenos:
- Fusarium sp. EK-14, EK-8.1, EK-16

- Aspergillus sp. EB-019-04, EB-407-01
- Penicillium sp. EB-404-01, EB-405-01
- Curvularia sp EK-9
- Mucor sp. EB-321g, EB-509
Se realizó el cultivo y esporulación de las cepas y se obtuvo el stock de inóculo con 1 x

107 conidios/ml, por recuento en cámara de Neubauer.. Posteriormente se evaluó la
capacidad transformadora de las cepas en 10ml de un medio de transformación para
diterpenos descrito por Hanson (1992) (Anexo 1) con 60ppm de CCC. Pasadas 48 horas
de cultivo, se adicionó 3mg del sustrato disuelto en metanol y se continuó la incubación
durante 9 días, al cabo de los cuales se midió pH para verificar la acidez y se realizó
filtración. Los micelios obtenidos se lavaron, se secaron y se extrajeron con acetato de
etilo, los caldos de filtrado se extrajeron también con acetato de etilo y los extractos
obtenidos fueron secados y concentrados. Para la selección de la cepa se realizó CCD
con diclorometano – metanol 7:3 y se reveló con vainillina.
La cepa seleccionada fue sometida a evaluación de su capacidad biotransformadora,

realizando un monitoreo del sustrato por CCD a partir de una fermentación en 50ml del
medio de transformación adicionado con 20mg del sustrato. En los días 3, 4 y 5 se
tomaron 15ml del cultivo para ser filtrados; el micelio se lavó y se siguió el mismo
procedimiento que en el ensayo anterior. Se realizó CCD de los extractos, micelio y
caldo de fermentación en placas de sílica gel RP18 con metanol – agua 7:3.
Posteriormente se realizó evaluación en 1000ml del medio de transformación,

adicionando 160mg del sustrato a las 48 horas de fermentación. Después de 7 días se
filtró el cultivo y se lavó el micelio. Se realizó extracción del micelio por maceración y
del caldo en sistema continuo L/L con acetato de etilo. Los extractos se secaron y se
concentraron. Se corrió CCD en placas RP18 con metanol – agua 7:3 para la separación
del sustrato y para la separación de metabolitos secundarios en sílica gel 60G con
diclorometano – metanol 9:1 y 7:3, se reveló con luz UV.
Los extractos obtenidos del micelio y del caldo de fermentación se lavaron con éter de
petróleo y se eluyeron por separado en una columna fase reversa con metanol – agua
7:3; se unieron las fracciones donde se encontraba el sustrato y se eluyeron en columna
de sílica gel con diclorometano, diclorometano – metanol 9:1, 8:2 y 7:3; nuevamente se
unieron las fracciones que contenían el sustrato y se realizó CCD con diclorometano –
metanol 7:3, revelándose con vainillina. Una vez separado el sustrato se unieron las
fracciones restantes y se separaron tres fracciones: diclorometano, cloroformo y
acetona; ésta última se eluyó en una columna de sílica gel con diclorometano – metanol
9.5:0.5 para la purificación del metabolito mayoritario; luego se corrió CCD en sílica
gel con diclorometano – metanol 9:1, se reveló con luz UV para confirmar pureza.
Posteriormente se realizó una fermentación en 1L de medio de transformación con un

inóculo de 107conidios/ml, con el fin de determinar si el metabolito mayoritario
producido por el hongo era inducido o no por el sustrato y para obtener mayor cantidad
del metabolito.
Se realizaron las correspondientes pruebas para la identificación y la evaluación de la

actividad antibacteriana del metabolito secundario mayoritario obtenido. Se determinó
la concentración mínima inhibitoria (CMI) y mínima bactericida (CMB) por la prueba
de sensibilidad en caldo (Koneman, 1999) frente a las bacterias Bacillus subtilis,
Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Adicionalmente, se realizó la prueba de
sensibilidad por difusión con discos (Hammond, 1977) y por la técnica de siembra en
estrías (Brock, 1991), ya que permite testificar un mayor número de bacterias en una
misma caja de medio. Se probaron Gram positivos como Bacillus cereus, Streptococcus
mutans, S. pyogenes, y Staphylococcus epidermidis; y Gram negativos como
Citrobacter freundii, Salmonella tiphy, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa y Proteus sp. De igual forma, se realizó evaluación de la actividad
antifúngica se realizó con los dermatofitos Trichophyton rubrum y Trichophyton
mentagrophytes.
RESULTADOS
Las cepas Fusarium sp. EK-14, EK-8.1 y EK-16; Aspergillus sp. EB-019-04; EB-407-
01; Penicillium sp. EB-404-01, EB-405-01, se preseleccionaron para evaluación, por la
facilidad para recuperar esporas de ellas.
En la selección de la cepa transformadora, las CCD realizadas a los extractos del

micelio y del caldo de cultivo, no mostraron ninguna mancha similar al patrón,
posiblemente por degradación del sustrato. Se escogió la cepa EK-14 identificada
previamente como Fusarium oxysporum por Rueda (2001), en su trabajo sobre
determinación del perfil de ácidos grasos como criterio quimio - taxonómico para la
clasificación de cepas nativas de Fusarium sp (Ver Anexo 11).
En el monitoreo por CCD del sustrato y de la fermentación a 1L, para evaluar la

capacidad biotransformadora de la cepa de F. oxysporum EK-14, el sustrato no presentó
cambios. La cromatoplaca para metabolitos secundarios reveló una sustancia de
mediana polaridad, en alta concentración, que decidió aislarse y purificarse.
La CCD de los productos purificados reveló manchas a la misma altura del patrón del
sustrato (Figura A.), con base en lo cual se determinó que la cepa de Fusarium
oxysporum EK-14 no presenta capacidad biotransformadora en el medio de
transformación para diterpenos reportado por Hanson (1992). Se purificó el metabolito
mayoritario producido por el hongo durante el proceso de biotransformación y al
producto resultante se le denominó sustancia F1, se confirmó su pureza en sílica por
CCD.
Figura A. Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa de Fusarium

oxysporum EK-14 por CCD
1 2 3 4 5 6 7 8 9
MONITOREO DEL SUSTRATO
Extracto 3er día de fermentación: 1 y 2 Control: medio+sustrato: 7

Extracto 4to día de fermentación: 3 y 4 Patrón : 8
Extracto 5to día de fermentación: 5 y 6 Control hongo: 9
Los resultados de las pruebas de identificación demostraron que la sustancia F1 forma

cristales blancos en forma de agujas a partir de diclorometano, es soluble en metanol y
acetona, tiene un punto de fusión de 150ºC, posee un Rf en diclorometano – metanol 9:1
de 0.5 en CCD bajo luz UV de onda corta, contiene nitrógeno, rotación óptica αD25 =
0.0, absorción ultravioleta a una longitud de onda máxima de 273λ. De acuerdo con el
espectro infrarrojo de la sustancia F1 (Figura B), se observan señales en las posiciones
3263 y 3080cm-1 que nos indican la presencia de grupos OH; en 1689cm-1 un grupo
carbonilo; en 1562cm-1 en éster; en 1521cm-1 un C-N; en la posición 1350cm-1 un grupo
O-C, y en 1064cm-1 un C-O; la asignación por analogía se presenta en la tabla.
Figura B. Espectro infrarrojo de la sustancia F1 producida por Fusarium oxysporum EK-

14.
75.0
%T
50.0
25.0
1562.2
3263.3
0.0 1350.1
1521.7 1064.6
1689.5
3000.0 2000.0 1500.0 1000.0 500.0

A.M. 1/cm
POS(1/cm) Asignación
1064.6 C-O
1350.1 O-C
1521.7 C-N
1562.2 C-O
1689.5 C=O
3080.1 O-H
3263.4 O-H
En el espectro de 1HMNR (Figura C), se observan señales múltiples en 2.1 que hacen
referencia al solvente; en 3.8 y 5.3 multipletes que representan H unidos a C-O ó C-N;
en 6.4 se observan dobletes correspondientes a H muy desplazados a campos bajos; en
7.2 y 8.2 dobletes que representan grupos aromáticos con sustitución para. El espectro
de 13CMNR de la Figura D. presenta señales para 1 grupo CH2 en la posición 62; 5
grupos CH en las posiciones 58, 68, 72, 122 y 126, siendo uno de éstos un C-N y 3
grupos C en las posiciones 140, 149, 162; para un total de 9 átomos de C. De acuerdo
con los espectros, se deduce una fórmula molecular de C9H9O5N.
Figura C. Espectro de 1HMNR de la sustancia F1 producida por Fusarium oxysporum EK-

14.
RMN1H
δppm Multiplicidad
3.8 m
5.3 m
6.4 d
7.7 d
8.2 d
Figura D. Espectro de 13CMNR de la sustancia F1 producida por Fusarium oxysporum

EK-14.
RMN13C
δppm C
58 (+) CH
62 (−) CH2
68 (+) CH
72 (+) CH
122 (+) =CH-
126 (+) =CH-
140 (−) =C=
149 (−) =C=
162 (−) -C=0
Para la determinación de rendimiento se obtuvieron los siguientes datos: Biomasa

3.214g/L; 250mg de sustancia F1 a partir de caldo de fermentación y 171mg a partir del
micelio, para un total de 421.3mg; extracto total 862mg.
Respecto a la evaluación de la actividad antibacteriana de la sustancia F1, en la prueba

de sensibilidad por difusión en agar, se presentaron halos de inhibición de 24mm frente
a S. aureus y 18mm frente a E. coli, a una concentración de 62.5υg de la sustancia. Los
datos de la CMI y CMB frente a estas bacterias se presentan en la siguiente tabla.
MICROORGANISMO µg/ml)
CMI (µ µg/ml)
CMB (µ
Staphylococcus aureus 25 37
Escherichia coli 37 >50
En la técnica de sensibilidad por siembra en estrías frente a las otras bacterias

evaluadas, todas las bacterias Gram positivas evaluadas fueron sensibles a 200µg de la
sustancia F1. Entre las bacterias Gram negativas evaluadas, Pseudomonas aeruginosa
mostró resistencia a 200µg de la sustancia F1, los datos de los halos de inhibición se
muestran a continuación en la tabla.
Gram Positivas Gram Negativas

BACTERIA mm BACTERIAS mm
Bacillus cereus 13 Citrobacter freundii 14
Bacillus subtilis 10 Escherichia coli 10
Streptococcus mutans 14 Salmonella tiphy 14
Staphylococcus epidermidis 13 Klebsiella pneumoniae 11
Streptococcus pyogenes 20 Pseudomona 2
aeruginosa
Staphylococcus aureus 13 Proteus sp 10
Los resultados de la evaluación de la actividad antifúngica demostraron que hasta

400µg/ml la sustancia F1 no tiene actividad frente a los dermatofitos testificados T.
rubrum y T. memtagrophytes.
DISCUSIONES
El β−D-glucopiranosil-ester del ácido (-)17-(β-glucopiranosil)-16-ol-kauran-19-oico,

fue seleccionado para los ensayos de biotransformación, por la considerable
concentración producidas por la Ageratina vaccinaefolia.
Aunque se realizó un ensayo preliminar con cepas de los géneros Penicillium,

Aspergillus y Fusarium, no fue posible realizar la selección por CCD probablemente
debido a la degradación del sustrato. La selección de la cepa nativa Fusarium
oxysporum EK-14 para los ensayos de biotransformación, se basó en los reportes de
literatura, ya que es un género relacionado con Giberella fujikuroi (estado sexual de
Fusarium verticilloides), hongo transformador de una gran variedad de diterpenos
kaurenoides (Fraga, 2000; Alam, 19914) y como transformador de glucósidos (Yue,
1998), además Fusarium sp. transforma kauranos y beyeranos, hidroxilando el C7 y el
C12β de igual forma que Giberella fujikuroi (Oliveira, 1996).
Desde los primeros reportes en biotransformación se ha utilizado la CCD para detectar

posibles transformaciones por comparación con controles (Anderson, 19755; Ipsen,
4
ALAM M., HANSON J., SARAH E. 1991. The biotransformation of some 6-subtituted ent-kaur-enes by Giberella
fujikuroi. Phytochemistry. 30(3):807-809.
5
ANDERSON A. 1975. Microbial transformation of 17-norkauran-16-one, ent-17-norkauran-16-one by Aspergillus
niger. Canadian Journal of Chemistry. 53:1181-1188.
19826) y aún en la última década todavía es utilizado el método (Tapia, 1997); la
posibilidad que el hongo genere sustancias con polaridades iguales o similares al
sustrato e interfiera en la interpretación de resultados, es superada con la fermentación
del hongo sin adición de la sustancia a transformar.
En las CCD de los extractos obtenidos del monitoreo del sustrato y de la fermentación a
1L no se observa transformación del sustrato. La cromatografía del sustrato purificado
tampoco reflejó cambios, por lo cual la cepa nativa de Fusarium oxysporum EK-14 no
presenta capacidad de transformar el β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-)17-(β-
glucopiranosil)-16-ol-kauran-19-oico en el medio de transformación para diterpenos.
Durante el proceso de biotransformación se aisló, purificó e identificó el metabolito

secundario mayoritario producido por la cepa nativa de Fusarium oxysporum EK-14,
sustancia denominada F1, la cual según datos espectrales, se identifica como un
metabolito nitrogenado que tiene en su estructura molecular un anillo aromático con
sustitución en para, grupos ésteres y alcohol, con una posible fórmula molecular
C9H9O5N, no siendo esta estructura similar a estructuras de metabolitos secundarios
reportados (Barrero, 1991; Medentsev, 1998; Fernández, 2000; Tudzynky, 1999;
Saxena, 2001).
Se realizó un posterior ensayo sin adición de sustrato, para determinar si la sustancia F1

era inducida por el β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-)17-(β-glucopiranosil)-16-ol-
kauran-19-oico, pero se obtuvo la misma sustancia F1 en el ensayos con y sin sustrato.
El rendimiento de la sustancia F1 fue de 400mg en un litro del medio de
biotransformación para diterpenos, con un inóculo de 107 conidios/ml; esta cantidad es
relevante comparada con la obtención de otros metabolitos producidos por Fusarium
sp., como el ácido fusárico 77.8mg/L (Cappaso, 1996) y Nmetilsansalvamida 3.1mg/L
(Cueto, 2000).
CONCLUSIONES
- El β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-)17-(β-glucopiranosil)-16-ol-kauran-19-oico

no es transformado por la cepa nativa de Fusarium oxysporum EK-14, en el medio
de transformación para diterpenos.
- La cepa nativa Fusarium oxysporum EK-14 produce un metabolito secundario
nitrogenado que tiene en su estructura molecular un anillo aromático con sustitución
para, grupos ésteres y alcohol, con una posible fórmula molecular C9H9O5N.
- La sustancia F1 aislada de Fusarium oxysporum EK-14 presentó actividad
antibacteriana para Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Escherichia coli,
Bacillus subilis, B. cereus, Streptococcus mutans, S. pyogenes, Citrobacter freundii,
Salmonella tiphy, Klebsiella pneumoniae, y Proteus sp; Pseudomonas aeruginosa
fue la única bacteria evaluada que presentó resistencia.
- La sustancia F1 hasta 400µg no tiene actividad antifúngica contra los dermatofitos
T. rubrum y T. mentagrophytes.
6
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ANEXO 10.
EVALUACIÓN DE ACIDOS GRASOS EN SEIS CEPAS NATIVAS DE Fusarium

sp. Y SU UTILIDAD COMO CRITERIO TAXONÓMICO PARA ESTE
GÉNERO.
Ludis Samira Rueda, Rubén Torrenegra.

Grupo de Investigación en Biotransformación, Departamento de Química, Pontificia
Universidad Javeriana.
INTRODUCCIÓN
Aunque existen diversas herramientas para la identificación y clasificación de

microorganismos, más de 70.000 especies de hongos han sido identificados sobre bases
morfológicas. Sin embargo, en recientes trabajos se ha considerado que el análisis del
contenido de ácidos grasos a nivel celular, asociado con características morfológicas, se
puede utilizar como un método diferenciación y una guía valiosa en la identificación de
hongos filamentosos. Estos estudios fueron anteriormente aplicados solo en bacterias y
levaduras y actualmente se utiliza en la caracterización y diferenciación de especies en
general.
La identificación de especies del género Fusarium es complicada debido a su

inestabilidad en respuesta a factores ambientales, en donde se desarrolla afectando su
morfología constantemente. Por esta razón se ha reportado más de 1250 especies de
este género identificadas sobre bases morfológicas, creando confusión para su
clasificación. La composición lipídica y en especial, la determinación de ácidos grasos
permiten diferenciar especies y líneas celulares. Fusarium sp. es un hongo de gran
distribución como fitopatógeno y reconocido a nivel industrial por la producción de
sustancias como ácido fusárico y ácido giberílico, además es fuente de micoproteína,
micotoxinas y metabolitos secundarios. Así mismo, es utilizado por su capacidad de
degradar la celulosa y compuestos de tipo fenol en biorremediación.
El GIFUJ, viene realizando análisis de plantas del género Espeletia, donde se han
encontrado compuestos de tipo terpenoides, kaurenoides, flavonoides y alcaloides.
Por esta razón, el GIBUJ desarrolla estudios con el fin de modificar
enzimáticamente estos compuestos por hongos nativos aislados de estas plantas y
posteriormente identificarlos morfológica y bioquímicamente.
El presente estudio se basa en la determinación de ácidos grasos a partir de seis

cepas de Fusarium sp., como una característica quimiotaxonómica que contribuye
a la diferenciación de las cepas aisladas. Este proyecto se encuentra enmarcado
dentro de la línea de investigación en biotransformación de terpenoides, obtenidos
de Asteraceas por hongos nativos.
EXPERIMENTACIÓN
Para el desarrollo del proyecto se comenzó con la activación e identificación de las

cepas; extracción de los ácidos grasos a partir del tejido fúngico con su posterior
análisis por cromatografía de gases (CG).
Las seis cepas de Fusarium sp. utilizadas en el estudio se obtuvieron del cepario
GIBUJ, donde se encuentran clasificadas como cepa EK-8, EK-11, EK-14, EK-17, EK-
502 y EK-7, aisladas de Espeletia killipii del páramo de Guasca ubicado en el
departamento de Cundinamarca. Las condiciones de cultivo se tomaron uniformemente
para minimizar la variación en la composición de ácidos grasos.
Cultivo e identificación de Fusarium sp

Para la activación de las cepas se toman granos del suelo conservado y con una pinza se
esparcieron sobre agar papa suplementado con cloramfenicol (Anexo 1) luego, se
incubaron durante dos días a 24-26ºC/10 horas luz (Booth,19717, Soroa, 19838). A partir
de las cepas recuperadas se realizaron cultivos monospóricos. Para la identificación de
las seis cepas se tuvieron en cuenta los siguientes aspectos:
- El buen crecimiento y desarrollo de estructuras en Fusarium sp se dio en agar papa.
- Las observaciones macroscópicas se realizaron diariamente hasta los 15 días de
cultivo. Se tuvieron en cuenta aspectos del micelio en su situación aérea como
profunda (algodonoso, flocuoso, polvoriento o rugoso, pigmentos difusibles y
formación de gotas de condensación).
- Microscópicamente se observaron células típicas del género, como macroconidias,
microconidias, clamidosporas y fiálides.
7
Booth, C. 1971. The genus Fusarium. Commonwealth Mycological Institute.kew; Surrey England:
Printed in Great Britain by the Eastern Press Limited.
8
Soroa, J.1983. Bacterias y Hongos Fitopatógenos. Editoral Puebla por Educación La Habana Cuba.
- La formación de estructuras fúngicas y la germinación de las esporas se evidenció
realizando microcultivos.
- Para la identificación taxonómica de especies se realizaron mediciones de las
estructuras fúngicas.
Obtención y purificación de ácidos grasos.

La extracción de los ácidos grasos se realizó a partir de la biomasa fúngica en las
condiciones específicas de crecimiento para cada cepa de Fusarium sp. Como punto de
referencia comparativa se consideró una cepa de Paecilomyces lilacinum SG10, aislada
por Chitiva (2001)9. El método empleado fue una modificación realizada por el autor a
la técnica de Stahl10 en 1996, la cual se describe a continuación.
Se obtuvo el inóculo de esporas para la producción de la biomasa fúngica y

posteriormente la masa micelial fue removida del caldo de cultivo por filtración al vacío
y lavada con 300 ml de agua destilada estéril. El micelio obtenido se dejó secar a
temperatura ambiente durante 12 horas. Dos gramos del micelio recuperado se
adicionaron con 4 ml de una solución cloroformo / hexano (3:1), se maceró
vigorosamente durante 3 minutos y el extracto se recuperó con pipeta Pasteur; este paso
se repite hasta completar un volumen de 24 ml. El extracto (que contenía los lípidos) se
dejó evaporar a 35ºC para el proceso de saponificación. Al extracto lipídico se
adicionaron 4 ml de solución saponificadora (150g de NaOH /L en metanol al 50%) en
un balón de 50 ml y se calientó en reflujo a 180 ºC durante 1 ½ hora al baño maría para
mantener la temperatura constante.
Los ácidos grasos liberados en la saponificación se metilaron, adicionando a la fase

superior 8 mL de una solución al 54% de HCl 6N /metanol y nuevamente calentado a
80ºC por 30 minutos. Para la extracción de los ésteres metílicos se utilizaron 6 mL de
una solución hexano-di-isopropil éter 1:1. La suspensión se agitó vigorosamente durante
10 minutos y la fase acuosa se dejó decantar y se descartó cuidadosamente. Al extracto
resultante, se le adicionaron 8 ml de NaOH al 1,2% y se agitó nuevamente, la fase
superior que contenía los ésteres metílicos de ácidos grasos se separó cuidadosamente
(Stahl, 1996). A cada una de los extractos finales se le adicionaron 5g de sulfato de
sodio anhidro para eliminar los residuos de agua y se sometió posteriormente a una
purificación por CC con sílica gel (60µm -200µm), utilizando como eluyente
cloroformo-hexano 3:1. Los extractos se sometieron a análisis.
Análisis de ácidos grasos

Las muestras fueron analizadas en un cromatógrafo de gases (GC) acoplado a un
instrumento VARIANT 3350 con una columna capilar MET-WAX SS (Supelco) de
30 metros de longitud, con un diámetro interno de 0,53 mm con un detector de
ionización de llama. Los perfiles de ácidos grasos fueron analizados según el tiempo de
retención relativo para lo cual se inyecta 1µl de la muestra; utilizando como gas
9
Chitiva, Adriana; Cabrera, Constanza. 2001. Aislamiento e Identificación de hongos del suelo del
páramo de Guasca – Colombia, en la zona de vegetación de frailejones. Trabajo de grado en
Microbiología Industrial. Departamento de Química, Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá.
10
Stahl, Peter D and Klug, Michael J. 1996. Characterization and Differentiation of Filamentous Fungi
based on fatty acid composition. Applied and Environmental Microbiology, Vol 62, no 11; p. 4136-4146.
portador Helio y como gas comburente Hidrógeno. Tanto los patrones estándar como
las muestras, se analizaron bajo las mismas condiciones.
El programa empleado en este análisis tiene una temperatura inicial de 35 ºC que se

incrementa hasta 120ºC con una tasa de 7ºC/ minuto y se mantiene 3 minutos, luego se
incrementa hasta 190ºC con una tasa de 10ºC/ minuto y se mantiene 2 minutos;
finalmente asciende hasta 220ºC con una tasa de 10ºC/ minuto y se mantiene un minuto.
La temperatura inicial del inyector es de 260ºC, del detector 270ºC con una temperatura
límite de 300ºC.Los ácidos grasos se identificaron según el tiempo de retención relativo
para las condiciones establecidas y analizados por duplicado donde se obtienen los
promedios respectivos para cada sustancia. Se realizaron cuadros comparativos de los
tipos y porcentajes de ácidos grasos relativos al cromatograma y a las condiciones
establecidas en las muestras analizadas.
RESULTADOS
Identificación de las cepas de Fusarium sp.

La identificación de las seis cepas de Fusarium sp. se realizó utilizando claves
taxonómicas. Teniendo en cuenta los aspectos morfológicos, se obtuvo la descripción e
identificación de las seis cepas de Fusarium sp. aisladas de Espeletia killipii, resumida
en la tabla A.
Tabla A. Descripción y Clasificación de las cepas nativas de Fusarium sp.
Cepa Características Macroscópicas Características Microscópicas Especie

Correspondiente
Colonia de crecimiento micelial rápido con diámetro de 4.6 cm a Microconidias ovales y en forma de pera. Tienen de 0 a 1 septo y
los 6 días, aspecto flocuoso y denso, inicialmente blanco a opaco miden 7µm de largo por 2.5µm de ancho. Fusarium
EK – 8 con manchas rojas emergentes desde el fondo del medio. sporotrichioides.
Macroconidias escasas y aparecen solo en conidióforos con
polifiálides, levemente curvadas, de 3 septos no apediceladas. Sherbakoff.
Colonia inicialmente blanca, con micelio esparcido en hifas Conidias típicas: macroconidias hialinas, pequeñas y fusiformes,
individuales o irregulares, presenta crecimiento lento y a los 7 días alunadas con extremos redondeados, aseptadas, miden 12µm de Fusarium
EK – 17 la colonia mide 4.5 cm de diámetro con la formación de pigmentos largo por 3.5µm de ancho Clamidosporas ausentes. nivale.(Fr.) Ces.
difusibles en el revez del medio. El micelio tiende hacia una
tonalidad rosa intenso con borde blanco opaco.
Micelio aéreo inicialmente blanco de apariencia delicada; cambia Macroconidias escasas y solo se presentan en cultivo en caldo, sin
de color rosa pálido hasta violeta intenso y en ocasiones toma un uniformidad, de 3-4 septos. Microconidias ovales, elipsoidales,
color café opaco o crema, así mismo la formación de masas formando largas cadenas a partir de falsas cabezas que
EK - 502 naranjas se hace evidente en gran cantidad, de aspecto grumoso y generalmente se forman en monofiálides. Con 1 septo, miden Fusarium
compacto (esporodoquios). Revés del medio color violeta intenso 2,8µm de largo por 2µm de ancho. moniliforme.
con zonas marrón. Su tasa de crecimiento es de 6,2 cm de diámetro Sheldon.
a los 8 días.
Micelio aéreo delicado, denso algodonoso y blanco que usualmente Formación de macroconidias y microconidias abundante.
tiende a teñirse de rosado claro a lila suave en el centro del cultivo, Macroconidias en forma de hoz típicas del género, fusiformes y
el revés puede ser melón o crema opaco con un diámetro 4,4 cm. un poco curvadas; poseen 3-5 septos y 34µm de longitud por
EK – 14 4,3µm de ancho. Microconidias falcadas, fusiformes hasta Fusarium
cilíndricas y miden de 8µm de longitud por 2.7µm de ancho. oxysporum.
Fiálides simples, conidióforos cortos ramificados. Presencia de Schlecht.
clamidosporas evidente en todos los cultivos.
Colonia inicialmente blanca, algodonosa, densa; con la edad se Macroconidias sútil y fuertemente curvadas, elongadas, anchas en
torna de un color tostado a marrón claro. Presenta un crecimiento el centro con una célula basal apedicelada notoria. Presentan de
rápido de 3.8 cm de diámetro a los 4 días de cultivo, con una 4-6 septos, la mayoría de 30-38µm por 3µm, que se forman a Fusarium
EK - 11 pigmentación melón en el revés del medio. partir de conidióforos ramificados. Producción de microconidias acuminatum. Ellis
escasa y se ven usualmente esparcidas. Clamidosporas ovales, & Everhart.
globosas e indistintamente ubicadas miden de 10-15µm de
diámetro.
Micelio aéreo flocuoso, en penachos de aspecto inicialmente Macroconidias en forma de hoz, con una célula basal elongada y
delicado que tiende a compactarse con la edad, su crecimiento es de levemente apedicelada, característica que desaparece con la edad
5,3 cm de diámetro y el color varía desde rosado pálido que cambia del cultivo; tienen 3 septos y miden de 45µm de longitud por Fusarium equiseti.
a amarillo cremoso y tostado en zonas circulares evidentes. 3.3µm de ancho. Microconidias falcadas y generalmente (Corda) Sacc.
EK – 7 esparcidas en el micelio aéreo, de 0-2 septos y 10µm de longitud
por 4µm de ancho.Formación de clamidosporas abundante, se
encuentran en las hifas como en las macroconidias formando
agregados o solitarias.
Obtención de perfiles de los patrones estándar de metíl ésteres de ácidos grasos.
Se obtuvieron los datos correspondientes a los tiempos de retención relativos de cada
uno de los 15 patrones realizando inyecciones tanto individualmente como la mezcla de
ellos en una concentración conocida; con lo cual se determinó un límite mínimo de
detección de 200 ppm (Figura A, Tabla B).
Figura A. Cromatograma de patrones de ésteres metílicos de ácidos grasos obtenidos por GC de
alta resolución en una Columna MET WAX SS (Supelco) de 30 m x 0,53mm.
Tabla B. Tiempos de retención del cromatograma de los patrones de ésteres metílicos de ácidos
grasos.
PICO NUMERO PATRON TIEMPO DE RETENCIÓN
1 Metíl hexanoato (caproico) 6.77
2 Metíl heptanoato (enantico) 9.30
3 Metíl octanoato (caprylico) 11.51
4 Metíl nonanoato (pelargonico) 13.44
5 Metíl decanoato (capricho) 15.21
6 Metíl hendecanoato(undecanoico) 16.84
7 Metíl 10-hendecanoato 17.72
8 Metíl dodecanoato (laurico) 18.61
9 Metíl tetradecanoato (mirístico) 22.76
10 Metíl hexadecanoato (palmítico) 25.34
11 Metíl octadecanoato (esteárico) 27.34
12 Metíl oleato ( oleico) 27.55
13 Metíl linoleato (linoleico) 28.08
14 Metíl eicosanoato (araquídico) 29.65
15 Metíl docosanoato (behenico) 31.76
Obtención de los ácidos grasos de las 6 cepas de Fusarium sp.

Los extractos de cada una de las muestras, se inyectaron en el cromatógrafo de gases
bajo las condiciones establecidas, en una cantidad de 1µl con un tiempo total de corrido
de 37,142 minutos; los resultados se resumen en la tabla C.
Tabla C. Äcidos Grasos presentes en las cepas nativas de Fusarium sp.
Cepa Ácido Graso Tiempo de Retención Porcentaje

Palmítico 25.46 9.18
No identificado 27.86 11.45
Oleico 27.66 9.71
Fusarium sporotrichioides EK - 8 Linoléico 28.31 8.22
Fusarium nivale EK -17 Esteárico 27.38 8.29
Oleico 27.50 23.22
Linoléico 28.08 41.27
Esteárico 27.19 7.45
Fusarium moniliforme EK – 502 Oleico 27.42 19.39
Behenico 32.34 1.53
Fusarium oxysporum EK-14 Oleico 27.67 44.72
Linoleico 28.23 34.90
Fusarium acuminatum EK-11 Esteárico 27.17 10.73
Oleico 27.41 32.14
Esteárico 27.21 9.55
Oleico 27.43 15.10
Fusarium equiseti EK – 7 Linoléico 28.00 23.11
Behenico 32.31 10.08
Paecilomyces lilacinum SG-10 Palmítico 25.28 10.05
Comparación de los perfiles de ácidos grasos obtenidos en cada una de las cepas.
Se realizó un cuadro comparativo con los porcentajes y los tipos de ácidos grasos
obtenidos en los perfiles de cada una de las cepas analizadas según las condiciones
establecidas para Fusarium sp y Paecilomyces lilacinum, especie tomada como
referencia en cuanto al género (Tabla D).
Tabla D. Porcentajes relativos y tipos de ácidos grasos obtenidos en cada una de las especies analizadas.
Porcentaje de ácidos grasos*
Palmitico
Esteárico
Linoleico
Behenico
Oléico
Hongo A B C D E F G H I J K L
Fusarium sporotrichioides 9,19 9,71 8,22 11,45 16,54 10,87 27,19 6,80
Fusarium nivale 27,21 8,30 41,27
Fusarium acuminatum 20,71 10,74 32,14 31,25 5,15
Fusarium oxysporum 20,38 44,72 34,90
Fusarium equiseti 17,03 15,10 23,11 10,08 8,71 8,03 8,36
Fusarium moniliforme 17,36 7,46 19,39 46,70 1,53 3,44 1,72 2,58
Paecilomyces lilacinum 10,06 41,01 13,68
*Porcentaje de ácido graso relativo a la muestra y a las condiciones establecidas

Los ácidos grasos que predominaron en cinco de las especies de Fusarium identificadas fueron
palmítico, oleico y linoleico los cuales se consideraron característicos para el género.
Fusarium nivale EK-17 no presentó el ácido oleico pero sí palmítico y linoleico. El ácido
esteárico se encontró en F. nivale EK-17, F acuminatum EK-11 y F. moniliforme EK-502 con
diferentes proporciones entre ellos; al igual que el behenico en F. equiseti EK-7 y
F.moniliforme EK-502. También se encontraron ácidos grasos con tiempos de retención
mayores a los patrones analizados que fueron reportados como no identificados en F.
sporotrichioides EK-8 con un tiempo de retención de 27.86, 32.62, 35.52, 36.09 y 36.91. En
F. acuminatum EK-11 un ácido graso con un tiempo de retención de 25.48 y para F.
moniliforme con un tiempo de retención de 25.48, 28.76 y 36.27.
En cuanto a las diferencias entre los géneros, sobre esta base, se encontró que Paecilomyces
lilacinum presentó un ácido graso con un tiempo de retención de 25,56 y otro ácido graso con
un tiempo de retención de 26,05 que no estaban presentes en ninguna de las especies de
Fusarium.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
En la identificación de Fusarium sporotrichioides EK-8, se consideró la poca formación de

macroconidias como una característica relevante, según lo descrito por Booth y Domsch;
aunque Nelson reporta lo contrario. Así mismo la presencia de microconidias en forma de pera
lo separa de F. clamidosporum y la presencia de polifiálides lo separa de F. poae y F.
tricinctum (Nelson, 1983)11.
En Fusarium nivale EK-17 se compararon las características observadas con los reportes de
esta especie realizados por Booth y Nelson quienes no dan una descripción amplia de
diferenciación ya que la colonia macroscópicamente se parece a F. oxysporum. Sin embargo la
presencia abundante de esporas pequeñas y la no-formación aparente de las típicas
macroconidias en forma de hoz de otras especies, hizo su identificación más acertada; esta
especie tiende a ser excluida del género por la formación de fiálides diferentes y a ser
considerada como Microdochium nivale (Fuskey, 1996)12.
Para Fusarium moniliforme EK-502 la identificación puede dar lugar a controversias, debido a
la formación de falsas cabezas y microconidias pequeñas muy similares a Acremonium sp. Sin
embargo, en este caso el color de la colonia es un aspecto de gran ayuda ya que ésta especie
presenta una colonia de color púrpura estable en todos los cultivos así como la ausencia de
clamidosporas.
En Fusarium acuminatum EK-11, la presencia de clamidosporas y la forma de la

macroconidia con la base apedicelada fueron carácteres relevantes de identificación, ya que el
11
Nelson, P.E.,T.A. Toussoun and W.F.O. Marassas. Fusarium species. An Illustrated Manual for Identification.
Pennsylvania State University: Press, University Park and London. 1983.
12
Fuskey, 1996: www.http:// sis.agr.gc.cal/brd/fusarium/pda-e.htm/
color del cultivo no es el usualmente reportado para la especie por Booth (1971)13 y
Nelson(1983) quienes describen esta pigmentación como carmín. Sin embargo, mencionan
que el cultivo puede tornar hacia melón, beige o marrón claro con la edad.
En la identificación de Fusarium oxysporum EK-14 y Fusarium equiseti EK-7, la forma de la

macroconidia se consideró una característica fácil de identificación para estas especies si se
comparada con otras dentro de este género ya que estas especies presentan macroconidias
septadas, en forma de hoz y elongadas.
La extracción de los ácidos grasos se realizó mediante una modificación realizada a la técnica
descrita por Stalh en 1996. Esta modificación permitió obtener en un menor número de pasos
los ácidos grasos, por la implementación de una extracción inicial de los lípidos totales
utilizando cloroformo-metanol en una proporción 3:1. Este paso evitó que los restos celulares
estuvieran presentes en todo el proceso de extracción; igualmente esta extracción preliminar
contribuyó de cierto modo con una purificación preliminar del extracto utilizado en la
saponificación.
Los resultados obtenidos en las comparaciones de los cromatogramas demostraron que sí

existen diferencias en cuanto a los tipos de ácidos grasos obtenidos en cada perfil bajo las
condiciones establecidas y el método utilizado; diferencias que se presentaron entre las
especies del mismo género y para el tomado como referencia Paecilomyces lilacinum SG-10.
Estos datos coinciden con la literatura reportada para F. oxysporum ya que este hongo produjo
ácido oleico en mayor cantidad (Azeem, 1999)14.
Los ácidos grasos que predominaron en un 80% para las especies analizadas fueron el
palmítico, oleico y linoleico; Fusarium nivale EK-17 no presentó ácido oleico, característica
que corrobora lo anteriormente expuesto sobre su posible exclusión de este género.
Los ácidos grasos no identificados (clasificados desde A hasta L), presentes de forma
específica en las especies analizadas en este estudio, reflejan que la formación de ácidos
grasos esta determinada por su condición genética. Así mismo, los porcentajes obtenidos
reflejan que la formación de ácidos grasos está condicionada por los factores ambientales y las
condiciones establecidas en este estudio. De igual manera, las condiciones ambientales se
mantuvieron relativamente estables para obtener una formación de ácidos grasos uniforme y
que permitiera un poca variabilidad en las cepas.
Se encontraron también diferencias en cuanto al género, ya que Paecilomyces lilacinum SG-10
presentó ácidos grasos que están ausentes en las seis cepas de Fusarium sp analizadas; esta
característica es importante porque permite diferenciar géneros y especies sobre esta base.
Estos análisis son de gran utilidad para estudios taxonómicos de microorganismos en general y
de hongos que no pueden ser diferenciados e identificados por métodos convencionales; como
13
Booth, C. The genus Fusarium. Commonwealth Mycological Institute.kew; Surrey England: Printed in Great
Britain by the Eastern Press Limited. 1971.
14
Azeem-A; et al. Biotechnological production of oil: fatty acid composition of microbial oil. 1999; 53 (4): 381-
386.
cepas de Micelia sterilia, Mucorales y micorrizas. En bacterias y levaduras las investigaciones
se han extendido con tan buenos resultados que se ha considerado el análisis de ácidos grasos
como un método con un 98% de confiabilidad en la identificación de estos microorganismos.
CONCLUSIONES
Las especies identificadas morfológicamente fueron: Fusarium moniliforme, Fusarium

acuminatum, Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti, Fusarium sporotrichioides y Fusarium
nivale. El análisis de tipos de ácidos grasos es útil para la diferenciación quimiotaxonómica
del género Fusarium y sus especies, asociados con estudios morfológicos. Los ácidos grasos
palmítico, oleico y linoleico son una característica genérica en Fusarium sp. En todas las
especies de Fusarium analizadas; se presentaron ácidos grasos de alto peso molecular desde
C:16 hasta C:18 y otros no identificados con tiempos de retención desde 25.48 hasta 36.91. El
análisis de ácidos grasos contribuye a la diferenciación de las seis cepas analizadas sobre esta
base quimiotaxonómica asociadas con características morfológicas.

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ANEXO 1

MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS.

Fórmula por Litro

Medio de Transformación de Hanson (1992).

Fórmula por Litro.

2 mililitros de una solución de elementos traza preparada en 100ml.

Sulfato ferroso 0.1g

Medio de Transformación de Hanson (1993).

Fórmula por Litro.

2 mililitros de una solución de elementos traza preparada en 100ml.

Sulfato ferroso 0.1g

Medio De Biotransformación de Fraga (2000; 2000b).

Fórmula por litro

Solución de elementos traza 0.2%

Medio de Transformación de Mitchel y Jackson (1982).

Formula por litro

Extracto de malta 17g

MATERIALES Y PROTOCOLO EN LA DETERMINACIÓN DE AZUCARES

Reactivo Somogyi I (Para 250ml).

Se mezcla, se lleva al volumen y se guarda.

Reactivo Somogyi II (Para 250ml)

Mezclar y llevar al volumen.

Reactivo de Nelson (Para 500ml)

Se mezcla, se lleva al volumen y se incuba a 37ºC por 24horas. Se almacena en botellas

BIORREACTORES CONSTRUIDOS PARA EL CULTIVO A UN LITRO DE

CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS SELECCIONADAS COMO

Esta curva de crecimiento permitió conocer el comportamiento de la cepa en el medio

Adicionalmente, se observa un descenso significativo en la concentración de glucosa,

2. Cinética de crecimiento de la cepa nativa Penicillium sp. EB-406-05 en el medio

COMPARACIÓN DE LOS DATOS DE 1HMNR DE LA SUSTANCIA Mc2

CORRELACIÓN DE LA TASA DE CRECIMIENTO RADIAL Y LA TASA DE

Zulma Astrid Moreno, Rubén Torrenegra.

Para la valoración del crecimiento específico y del crecimiento radial de un hongo

En este trabajo se realizó la determinación de la tasa de crecimiento radial y la tasa de

Se evaluaron 22 cepas de hongos pertenecientes a los géneros Curvularia, Mucor,

Al correlacionar los datos obtenidos en la tasa de crecimiento radial, respecto a la tasa

EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA DE LA CEPA

El β-D–glucopiranosil - éster del Ácido (-) 17 - (β - glucopiranosiloxil) – 16 – ol –

En este trabajo se evaluó la capacidad transformadora de la cepa nativa de Fusarium

El desarrollo de esta investigación se llevó a cabo con cepas fúngicas pertenecientes al

- Fusarium sp. EK-14, EK-8.1, EK-16

Se realizó el cultivo y esporulación de las cepas y se obtuvo el stock de inóculo con 1 x

La cepa seleccionada fue sometida a evaluación de su capacidad biotransformadora,

Posteriormente se realizó evaluación en 1000ml del medio de transformación,

Posteriormente se realizó una fermentación en 1L de medio de transformación con un

Se realizaron las correspondientes pruebas para la identificación y la evaluación de la

En la selección de la cepa transformadora, las CCD realizadas a los extractos del

En el monitoreo por CCD del sustrato y de la fermentación a 1L, para evaluar la

Figura A. Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa de Fusarium

MONITOREO DEL SUSTRATO

Extracto 3er día de fermentación: 1 y 2 Control: medio+sustrato: 7

Los resultados de las pruebas de identificación demostraron que la sustancia F1 forma

Figura B. Espectro infrarrojo de la sustancia F1 producida por Fusarium oxysporum EK-

3000.0 2000.0 1500.0 1000.0 500.0

Figura C. Espectro de 1HMNR de la sustancia F1 producida por Fusarium oxysporum EK-

Figura D. Espectro de 13CMNR de la sustancia F1 producida por Fusarium oxysporum

Para la determinación de rendimiento se obtuvieron los siguientes datos: Biomasa

Respecto a la evaluación de la actividad antibacteriana de la sustancia F1, en la prueba

En la técnica de sensibilidad por siembra en estrías frente a las otras bacterias

Gram Positivas Gram Negativas

Los resultados de la evaluación de la actividad antifúngica demostraron que hasta

El β−D-glucopiranosil-ester del ácido (-)17-(β-glucopiranosil)-16-ol-kauran-19-oico,

Aunque se realizó un ensayo preliminar con cepas de los géneros Penicillium,

Desde los primeros reportes en biotransformación se ha utilizado la CCD para detectar