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Σ=96 tests #3144-16

MICROWELL ELISA

TRIIODOTHYRONINE (T3)
ENZYME IMMUNOASSAY
TEST KIT
Inmunoensayo Enzimático para la Determinación Cuantitativa de Triyodotironina
(T3) en Suero Humano

Uso

Para la medición cuantitativa de Triyodotironina total (T3) en suero humano.

Introducción

La glándula tiroidea humana es el mayor componente del sistema endocrino. Las

hormonas tiroideas ejecutan muchas funciones importantes. Estas ejercen poderosas y
esenciales influencias regulatorias en el crecimiento, diferenciación, metabolismo célular y
balance hormonal general del cuerpo, al igual que en el mantenimiento de la actividad
metabólica y el desarrollo del sistema esquelético y orgánico.

Las hormona tiroxina (T4) y 3, 5, 3 Triyodotironina (T3) circulan en el torrente

sanguíneo, generalmente unidas a las proteínas del plasma, globulina fijadora de tiroxina
(TBG). La concentración de T3 es mucho menor que la de T4, pero su potencia metabólica
es mucho mayor.

La T3 determina un factor importante en el diagnóstico de enfermedades de la tiroide.

Su medición ha develado una variante de hipertiroidismo en pacientes tirotóxicos con
valores elevados de T3 y valores normales de T4. Un incremento de T3 sin un incremento
de T4 es frecuentemente un precursor de tirotoxicosis en pacientes tratados previamente. El
significado clínico de la T3 es también evidente en pacientes en quienes el eutiroidismo es
atribuible solo a valores normales de T3, aunque sus valores de T4 sean subnormales. La
determinación de T3 es también útil en el monitoreo de pacientes bajo tratamiento por
hipertiroidismo y pacientes que han descontinuado la terapia anti-tiroide con drogas.
También es especialmente valiosa en la distinción entre pacientes con eutiroidismo y
pacientes con hipertiroidismo.

Adicional al hipertiroidismo, los niveles de T3 se elevan en mujeres embarazadas, y en

mujeres que están recibiendo anticonceptivos vía oral o tratamiento con estrógeno,
paralelamente la TBG se incrementa de manera análoga con los valores de T4. Del mismo
modo, una disminución en las concentración de TBG disminuye la concentración de T3.
Estos cambios en los niveles de T3, sin embargo, no son un reflejo verdadero del estatus de
la tiroide.

Principio de la Prueba

En el EIA de T3, una cierta cantidad de anticuerpo anti-T3 recubre los pozos de
microtitulación. Una cantidad medida de suero del paciente y una cantidad constante de
conjugado T3 con peroxidasa de rábano picante son añadidos en los pozos de
microtitulación. Durante la incubación, el anticuerpo anti-T3 se une al segundo anticuerpo
en los pozos y la T3 y el conjugado T3 compiten por los sitios de unión limitados del
anticuerpo anti-T3. Después de 60 minutos de incubación a temperatura ambiente, los
pozos son lavados 5 veces con agua para remover el conjugado T3 no unido. Luego se
añade una solución de TMB y se incuba por 20 minutos, dando como resultado la
formación de un color azul. La formación del color es detenida con la adición de HCL 2N y
la absorbancia es medida espectrofotométricamente a 450 nm. La intensidad del color
formada es proporcional a la cantidad de enzima presente y está inversamente relacionada a
la cantidad de T3 no marcado en la muestra. Por una serie de estándares referencia de T3
analizados de la misma manera, se cuantifica la concentración de T3 en las muestras
desconocidas.

Condiciones de Almacenamiento
 1. Almacene el kit de 2°C a 8°C una vez recibido y cuando no esté en uso.
2. Mantenga los pozos de microtitulación en una bolsa sellada con desecantes.

Instrumentación

Un lector de pozos de microtitulación con un ancho de bando de 10 nm o menos y un

rango de densidad óptica de 0 a 2 D.O. o superior a una longitud de onda de 450 nm es
aceptable para la medición de la absorbancia.

Preparación y Recolección de las Muestras

El suero deberá ser preparado de una misma muestra de sangre obtenida a través de
técnicas médicas aceptables. Este kit es solo para ser usado con muestras de suero sin
aditivos.

Materiales Proporcionados con el Kit de Prueba

1. Pozos de microtitulación recubiertos con anticuerpo anti-T3, 96 pozos.

2. Conjugado de T3 Concentrado HRPO, 0,8 ml.
3. Diluente de Conjugado T3 HRPO, 15 ml.
4. Estándar de referencia, 1 set. Listo para usar.
5. Substrato TMB, 12 ml.
6. Solución de parada, 12 ml.

Materiales Requeridos pero no Proporcionados

1. Agua destilada
2. Pipetas de precisión: 0.05ml, 0.1ml, 0.2ml.
3. Puntas desechables para pipetas.
4. Lector de pozos de microtitulación
5. Mezclador Vortex o su equivalente.
6. Papel absorbente.
7. Papel milimetrado

Preparación de los Reactivos

1. Se les debería permitir a todos los reactivos alcanzar la temperatura ambiente (18-22
°C) antes de su uso.
 2. Para reactivar el reactivo conjugado de T3-HRPO, añada 1 ml de conjugado
concentrado de T3-HRPO a 2 ml de conjugado diluente T3 (dilución 1:20) y mezcle
bien. La cantidad de conjugado diluido dependerá del tamaño de su ensayo. El
reactivo conjugado es estable a 4 °C al menos por 2 semanas.

Nota: El ensayo T3 es sensible a la temperatura. La mejor condición de temperatura para

este ensayo va de 19 °C a 22 °C. si en las condiciones ambientales del ensayo, la
temperatura es más alta de lo esperado, recomendamos incrementar la dilución del
conjugado T3 a 1:40.

Procedimiento del Ensayo

1. Asegure el número deseado de pozos recubiertos en el mezclador. Haga una hoja de

datos con la identificación de la muestra.
2. Dispense 50 μl de estándar, muestras y controles en los pozos apropiados.
3. Mezcle completamente por 10 segundos, luego dispense 100 μl de reactivo de
conjugado enzimático en cada pozo.
4. Mezcle completamente por 30 segundos. Es importante tener un mezclado completo
en este paso.
5. Incube a temperatura ambiente por 60 minutos.
6. Remueva la mezcla de incubación sacudiendo los contenidos de la placa sobre el
contenedor de desechos.
7. Enjuague y sacuda los pozos de microtitulación 5 veces con agua destilada.
8. Agite los pozos firmemente sobre el papel absorbente para remover gotas de agua
residuales.
9. Dispense 100 μl de solución de TMB en cada pozo. Mezcle suavemente por 5
segundos.
10. Incube a temperatura ambiente en la oscuridad por 20 minutos.
11. Detenga la reacción añadiendo 100 μl de solución de parada en cada pozo.
12. Mezcle suavemente por 15 segundos.
 Es muy importante asegurarse de que el color azul cambie a amarillo
completamente.
13. Lea la D.O. a 450 nm con un lector de microtitulación dentro de los próximos 15
minutos.

Calculo de los Resultados

1. Calcule los valores promedios de la absorbancia (A450) para cada set de estándares
de referencia, controles y muestras.
2. Recomendamos usar el software apropiado para calcular los resultados. Si el
software no está disponible, en un papel milimetrado construya una curva de
calibración graficando la media de la absorbancia obtenida para cada estándar de
referencia contra su concentración en ng/ml, con la absorbancia en el eje vertical
(Y) y la concentración en el eje horizontal (X).
 3. Usando el valor de la media de la absorbancia para cada muestra, determine la
concentración correspondiente de T3 in ng/ml de la curva de calibración.

Ejemplo de una Curva de Calibración

1. Resultados de una corrida estándar típica se muestran abajo.

T3 D.O. 450 nm
(ng/ml) I II Promedio
0.0 2.91 2.83 2.87
0.5 2.23 2.22 2.22
1.0 1.80 1.74 1.77
2.5 1.20 1.12 1.16
5.0 0.70 0.66 0.68
10.0 0.41 0.32 0.37

2. Curva de Calibración:

Nota: Esta curva estándar es solo para propósitos de ilustración y no deberá ser usada
para calcular muestras desconocidas. Cada laboratorio debe proveer sus propios datos y
curva de calibración.

Valores Esperados y Sensibilidad:

Rango Normal: 0.8 ~ 1.90 ng/ml

Se estima que la concentración mínima detectable de T3 para este ensayo sea de 2.0
ng/ml.
Referencias

1. Walker W.H.C. Introduction: An Approach to Immunoassay. Clin. Chem. 1977; 23: 384
2. Kirkegaard C., Friis T. and Siersback-Nielsen K. Acta Endocrinol. 1974; 77: 71
3. Wisdom G.B. Enzyme-Immunoassay. Clin. Chem. 1976; 22: 1243
4. Hoffenberg R. Medicine 1978; 8: 392
5. Lieblich J., Utiger R.D. J. Clin. Invest. 1972; 51: 1939

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ISO 13485-2003
Revision
Fecha de Revisión: 4/4/06