HPLC Determinaciones cuantitativas

Alta sensibilidad

Idoneidad para especies no Técnica no destructiva

volátiles o termolábiles
Diversidad de mecanismos
de separación

AUMENTO DE SUS APLICACIONES

 desarrollo de nuevas técnicas y equipos cromatográficos
 demanda de mejores métodos para la separación y caracterización de
componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas
HPLC: Método de separación en el que los componentes de la muestra
interaccionan física y químicamente con una fase móvil (eluyente) y una
fase estacionaria (relleno de la columna).

Muestra (disuelta ) Fase móvil

A+B

B
A
Columna B
de relleno A

B
A B Detector

Señal
del detector
SISTEMA CROMATOGRÁFICO
 Inyector

Bomba

Columna

Recipiente de fase móvil

Sistema de recogida Detector

de datos

Recipiente de salida
 Recipientes de fase móvil

Tapones especiales
Tubos de teflón que
conectan con la
bomba

Sistema de desgasificación

Filtro
 Inyector manual

3 2 3
2
4 4
1 1
6
6 5 5

Inyector de 6 vías
PARAMETROS CROMATOGRÁFICOS
OPTIMIZACIÓN DE UNA SEPARACIÓN

N a-1 1+ k´
Rs =
4 a k´

MODIFICACIÓN

N k´ a

aumentar la longitud de la columna

disminuir tamaño de partícula
modificar caudal de la fase móvil
Modificación k´ : variación de la composición de la fase móvil
H2O + MeOH
Modificación a : variación de la composición química de la fase móvil
Modificación a : variación del relleno de la columna
OPTIMIZACIÓN DE LA RESOLUCIÓN
Señal del detector

Inicial

Aumento de k´

Aumento de a

Aumento de N

Tiempo
COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS
COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS

Elección de una columna cromatográfica: longitud, diámetro, relleno

L Eficacia  L  Eficacia  tiempo de retención

d Resolución y Sensibilidad  d  resolución sensibilidad

Relleno de la columna
Relleno de columna: soporte
Sílice

Parámetros principales de la sílice: geometría, porosidad y diámetro

• Tamaño de partícula: 3 a 10 µm
• Distribución del tamaño de partícula: muy agrupado
• Tamaño de poro: 70 a 300 Å
• Área superficial: 50 a 250 m2/g
• Número de puntos de adsorción por unidad de área: 1 a 5 por 1 nm2 A
 Superficie
de la columna Organoclorosilano

Recubrimiento polar Recubrimiento apolar

Fase normal R = grupo diol, ciano o amino Fase inversa R = C8, C18

 R mayor retención en la columna

MODOS DE CROMATOGRAFÍA
MODOS DE CROMATOGRAFÍA

 Cromatografía de adsorción en fase normal

 Cromatografía de reparto en fase inversa

 Cromatografía de pares iónicos

 Cromatografía de intercambio iónico

 Cromatografía de exclusión por tamaño

 Cromatografía de afinidad

 Cromatografía con fases estacionarias quirales

Cromatografía de adsorción en fase normal

Interacciones
grupos polares o funcionales de la superficie
grupos polares de los analitos
del relleno
Estacionaria polar
Fases
Móvil no polar : isooctano, hexano, cloroformo

polaridad
- +
Cromatografía de reparto en fase inversa

Interacciones tipo hidrofóbico

Distinto reparto del analito entre las 2 fases (en función de la distinta solubilidad)

Estacionaria no polar
Fases
Móvil polar : agua, metanol, acetonitrilo
+ polaridad -
Cromatografía en fase inversa de supresión iónica
Compuestos iónicos que salen a volumen muerto

Control del pH del medio

COOH COO-

 pH Especie menos polar

MAS RETENIDA
 pH

Estacionaria no polar
Fases
Móvil polar : agua, metanol, acetonitrilo
+ tampones: ácido acético, fosfórico
alquilaminas o fosfatos alcalinos

Solo sirve para ácidos y bases débiles por el rango de pH utilizado 2< pH<8
Cromatografía de par iónico

Se emplea para la separación de especies iónicas

Estacionaria no polar
Fases
Móvil polar : disolución acuosa con disolvente orgánico + contraión

Aumenta la retención de compuestos de carga opuesta Aniónico o catiónico

Se forma una especie neutra susceptible de ser retenida por la columna

bases: alquilsulfonatos
Para retener
ácidos: alquilaminas
Cromatografía de intercambio iónico
Se emplea para la separación de compuestos iónicos
Estacionaria con rellenos con carga opuesta a la muestra
Fases
Móvil tamponadas

Resinas de intercambio aniónico: aminas cuaternarias y primarias (NR3+, NH3+)

Resinas de intercambio catiónico: ácido sulfónico y carboxilico ( SO3-, COO- )
Cromatografía de exclusión por tamaño (GEL PERMEACIÓN- GEL FILTRACIÓN)

• Partículas del relleno forman un tamiz

• No se produce retención dentro de la

columna

• Separación basada en tamaño molecular y

tiempo de residencia de las partículas en
los poros

• Partículas grandes eluyen primero

• Bajas eficacias

• Proteínas, polímeros y ácidos nucleicos

Cromatografía de afinidad

Interacciones especificas y reversibles entre moléculas biológicamente activas

Elevada selectividad. Se utiliza como método de purificación

DETECTORES DE HPLC
DETECTORES EN HPLC
Basados en propiedad de la disolución
Detectores de HPLC
Basados en propiedad del soluto

Propiedades de un detector
• Bajo nivel de deriva y ruido (análisis de trazas)
• Alta sensibilidad (discriminación entre concentraciones próximas de analitos)
• Respuesta rápida
• Volumen de la célula de detección mínimo para evitar un ensanchamiento de la
banda
• Respuesta lineal: la diferencia en la respuesta de dos concentraciones de un
compuesto es proporcional a la diferencia de concentración de las dos muestras
• No alterarse por los cambios de tipo de solvente, velocidad del flujo o temperatura
• Reproducibilidad
• Manejo sencillo
• La detección ha de poder ser optimizada para cada compuesto
• No debe ser destructivo de la muestra
DETECTORES EN HPLC

 Detectores de Absorbancia

 Detectores de Fluorescencia

 Detectores de Índice de refracción

 Detectores Electroquímicos

 Detectores por Espectrometría de masas

Detectores de absorbancia

• Son los más utilizados (70%) Name Chromophore Wavelength [nm]

• Se emplean para todos los modos cromatográficos acetylide -C=C 175-180

• Se emplean para casi todos los compuestos aldehyde -CHO 210
amine -NH2 195
azo -N=N- 285-400
bromide -Br 208
1) de longitud de onda fija carboxyl -COOH 200-210
disulphid -S-S- 194
ester -COOR 205
ether -O- 185
ketone >C=O 195
nitrate -ONO2 270
nitrile -C=N 160
nitrite -ONO 220-230
nitro -NO2 210

Se obtiene todo el cromatograma a una  determinada

2) Monocromadores: longitud de onda variable

Espectrofotómetro de barrido
 cromatograma a una 
 diferente  para cada pico
3) DAD: barrido a todas las longitudes de onda
DAD: espectro para cada pico en un tiempo
Representación en 3D
Seleccionar la mejor longitud de onda
Coelución de dos compuestos: Pureza de pico
 Detectores de fluorescencia
Radiación de alta longitud de onda Fluorescencia
Excitación

Compuesto
Radiación de baja longitud de onda
Emisión
 Elevada selectividad
 Elevada sensibilidad
 Solo el 15% de los compuestos fluorescen
 Señal muy pequeña, se necesita fotomultiplicador
Detectores de Índice de refracción
Variación de la refracción cuando la fase móvil lleva un compuesto disuelto respecto a la
fase móvil pura

 Detector universal. Responde a casi todos los solutos

 Sensibilidad limitada
 No se pueden emplear gradientes de fase móvil
 Muy sensible a pulsos de presión
 Se emplean para carbohidratos y polímeros
Detectores por Espectrometría de masas

HPLC MS
 Método muy novedoso
Volumen elevado de efluente de la columna
 Inconvenientes
Necesidad de alto vacío

División del efluente de la columna

Interfases
Volatilización del disolvente sobre una cinta

 Desarrollo de nuevas metodologías de acoplamiento o nuevas interfases

 LCxLC matrices complejas
LC x LC
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS BIDIMENSIONAL COMPLETA
(comprehensive two-dimensional LC)

1° dimensión
Flow

Bomba 2°
dimensión
1
2 10

3 9

20 ml

4 8

20 ml
5 7
6
Residuos Detector

Chromolith
C-18

Flow

2° dimensión
 LCxLC matrices complejas
LC x LC
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS BIDIMENSIONAL COMPLETA
(comprehensive two-dimensional LC)

1° dimensión
Flow

Bomba 2°
dimensión
1
2 10

3 9

20 mL

4 8

20 mL
5 7
6
Residuos Detector

Chromolith
C-18

Flow

2° dimensión
 LCxLC matrices complejas
LC x LC
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS BIDIMENSIONAL COMPLETA
(comprehensive two-dimensional LC)

1° dimensión
Flow

Bomba 2°
dimensión
1
2 10

3 9

20 ml

4 8

20 ml
5 7
6
Residuos Detector

Chromolith
C-18

Flow

2° dimensión
CARACTERÍSTICAS
w Alto poder de separación
w Posibilidad de formación de patrones en función de su clase
química.
w Acoplamientos ortogonales: diferentes mecanismos de separación
L. Montero, E. Ibáñez, M. Prodanov, A. Cifuentes, M. Herrero
 PROANTHOCYANIDINS

Proanthocyanidins are one of the most abundant phenolic compounds

in vegetables. Thus, they are widely consumed through our diet.

Properties
 Food organoleptic characteristics: astringency, bitterness, aroma
and color.
 Some interesting functional and bioactive properties such as
antioxidant, antimicrobial, anti-inflammatory or anti-cancer activities.
 Chemical Structure

The monomers can be linked by:

 A bond: C4-C8 or C4-C6 (B-type proanthocyanidins).

 Two bonds: C-C bond + ether C2-O-C7´ bond

(A-type proanthociynidins).

Flavan-3-ol R1 R2 R3 R4 R5
Afzelechin H OH H H OH
Propelargonidins
Epiafzelechin H OH H OH H
Catechin H OH OH H OH
Procyanidins
Epicatechin H OH OH OH H
Gallocatechin OH OH OH H OH
Prodelphinidins
Epigallocatechin OH OH OH OH H
Epicathechin gallate

Grape seeds (Vitis vinifera) are an important natural source of procyanidins,

consisting in polymers with different DP formed by catechin, epicatechin
and apicatechin 3-O-gallate, linked by B and A type bonds.
 Chemical characterization of procyanidins

Principal technique: high performance liquid chromatography (HPLC)

Separation mode Benefits Disadvantages

 Separation of small oligomers

Reversed phase Hydrophilic  Oligomers with DP > 4 coelute
with the same polymerization
(RP-HPLC) degree.
Interaction Liquid in a large unresolved peak.
Chromatography
 Separation of oligomers
(HILIC)
Normal phase  Elution with toxic solvents.
according to their polymerization
(NP-HPLC)  Oligomers with = DP coelute.
degree.
 Chemical characterization of procyanidins

Uses NP-compatible stationary phases, with RP-compatible mobile

phases.
HILIC The procyanidins are separated according to their polymerization
degree.

Intermediate mode
between
NP-HPLC and RP-HPLC
Diol stationary phase
 Identification

Thus, due to their complex structure, the separation and identification of procyanidins is still
an analytical challenge.

Conventional HPLC  insufficient resolution power. It is

essential to improve the separation capacity  enhance
the peak capacity.

Comprehensive two-dimensional liquid

chromatography
(LCxLC)
 Comprehensive two-dimensional liquid chromatography (LCxLC)

Analysis of a sample which is submitted to two independent and simultaneous separation

procedures.

Interface: collects and re-injects the eluent from

the first dimension in the second dimension  2-
positions 10-port switching valve with two
identical injection loops.

Difficulties
 Immiscibility and incompatibility of solvents between the two dimensions.
 Very fast analysis in the second dimension, since each D2 analysis must finish before
than the next fraction is injected.
 Transfer rate as fast as possible to avoid the loss of resolution already achieved on the
first dimension.
 Data processing
2ªD column

Detector

Separation power of LCxLC

Peak capacity = related to separation power
completely different retention mechanisms between the two dimensions are needed (orthogonality).

HILICxRPLC: ↑orthogonality and mobile phases compatibility.

LCxLC/MS
The benefits of the bidimensional chromatography (increased separation power) are achieved
together with the enhance of the identification capacity of unknown compounds. It is a helpful tool to
the characterization of complex samples such as the grape seed procyanidins.
 Objetives

To develop a new comprehensive two-dimensional liquid chromatography

method coupled to DAD and MS detectors to characterize the procyanidins
present in grape seeds. Thereby, it is intended to increase the available
knowledge about the composition of these interesting bioactive phenolic
compounds in grape seeds.

HILICxRPLC-DAD-MS/MS
 Sample
Grape seeds corresponded to Vitis vinifera, variety Malvar (IMIDRA, Madrid, Spain).

Method
MeOH/H2O Filtration
Ultrasounds Centrifugation Evaporation
(80:20 v/v) (0.45 µm)

300 µL Filtration 50 mg/mL Lyophilization

(0.45 µm) MeOH
Filtration
15 mg/mL
(0.2µm) 700 µL
ACN

Optimization of chormatographic
conditions

Optimization of 1st D

Optimization of 2nd D

Overall optimization of the LCxLC system

 Instrumentation
LC x LC / MS

1 6 2nd Dimension
1st Dimension

3
7
11
2 4
Diode
9 8 Array
Detector
10
Waste

Waste
5 12

Mass
MS Spectrometry

13

(1) 1st dimension mobile phase bottles, (2) 1st dimension

pump, (3) Flow splitter, (4) Injector, (5) 1st dimension column,
(6) 2nd dimension mobile phase bottles, (7) 2nd dimension
pump, (8) Switching valve, (9) Loops, (10) 2nd dimension
column, (11) Diode Array detector, (12) Flow splitter, (13) Mass
Spectrometer ESI/Ion Trap.
 Requirements for the LCxLC separation
1stD

A very low flow rate (ca.15µL/min):

- complete sample distribution
- collection of small fractions on the
injection loops.

Microbore columns: minimization of dilution and use of very low flow

rates.
(Lichrospher diol-5 (150 x 1.0 mm, 5 mm d.p.))

2nd D

A very high flow rate to obtain very fast 2nd D analysis.

Columns which support high pressures or which generate a lower backpressure:

- Partially-porous columns (Ascentis Express C18 (50 x 4.6 mm, 2.7 mm d.p.))
- Monolithic columns (Onyx C18 (100 x 4.6 mm))
 1st D HILIC
Optimization of the 1st dimension (HILIC)
It was employed a microbore column in an HILIC separation mode with diol
stationary phase
Large influence of the sample solvent.

Concentrated solution in
MeOH MeOH and a dilution in
ACN

Sample solvent composition ≈ initial mobile

phase.

monomers Oligomeric
Lichrospher diol-5
(150 x 1.0 mm, 5 mm d.p.)
procyanidins
with increased DP A: ACN/CH3COOH 98:2 (v/v)
B: MeOH/H2O/CH3COOH 95:3:2
(v/v/v)

Gradient: 0 min, 0 %B; 5 min 20%B;

10 min, 30 %B; 30 min, 50 %B; 40
min, 50 %B; 50 min, 80 %B; 75 min,
100 %B; 85 min, 100 %B.

Flow rate: 15µL/min

polymers
Vinj=20µL
 2nd D RP
Optimization of the 2nd dimension (RP)

 Partially-porous column
 Monolithic column

Fast separation in order to limit the

TARGET injection volume in the second
dimension (maximum 20 µL).

1.3 min were available for the second dimension

separation and column re-equilibration, with a first
dimension flow rate of 15 µL/min.
 2nd D RP
Optimization of the 2nd dimension (RP)

 Partially-porous column
 Monolithic column

Parameters Mobile phase ACN MeOH ACN/MeOH (1:1) ACN/2-IPA (8:2)

that affect the
Gradient
separation
Flow rate (mL/min) 2 2.5 3 mL/min 3.5 4 mL/min

Sample solvent Imposed by the 1stD

Temperature (ºC) 30ºC 35 40 45 50 55

Injection volume
20 30 µL 50
(µL)
Abs (280 nm)

Abs (280 nm)

Abs (280 nm)

50 Partially-porous Monolithic column
µL column

30
µL
20
0.25 0.5 0.75 1
µL
1.25min 0.2 0.4 0.6
0.2 0.8
0.4 0.61 0.81.2 min
1 1.2 min
 2nd D RP
Optimization of the 2nd dimension (RP)

 Partially-porous column
 Monolithic column

Mobile phase ACN MeOH ACN/MeOH (1:1) ACN/2-IPA (8:2)

Gradient

Parameters that Flow rate (mL/min) 2 2.5 3 mL/min 3.5 4 mL/min

affect the separation
Sample solvent Imposed by the 1stD

Temperature (ºC) 30ºC 35 40 45 50 55

Injection volume
20 30 µL 50
(µL)

Partially-porous Monolithic column

Abs (280

Abs (280

column
nm)

nm)

0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 min 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 min
 HILICxRP
Overall optimization of the LCxLC system

Separation HILICxRP with monolithic column in

the 2nd D

Separation HILICxRP with partially

porous column in the 2nd D
 Characterization of the procyanidins by HILICxRP-DAD-MS/MS.
D2-RP (s)

D1- HILIC (min)

1G 2G 1G 2G 1G 2G 1G 2G 1G 2G 1G 2G
1 2 3 4 5 6 7 8 DP
 It was possible the
separation of 46
compounds.

Compound nº [M-H]- [M-2H]2- Principal fragments

Monomers 2 289,7 245
Dimers 3 577,4 195, 329, 377, 425, 469, 525
Dimers monogallate 4 729,8 407, 559, 577
Dimers digallate 1 881,1 729
Trimers 4 865,2 739
Trimers monogallate 3 1017,4 441, 577, 729, 847, 865, 891, 999
Trimers digallate 1 584,3 729, 865, 880, 999, 1017
Tetramers 5 1153,3 575, 739, 865, 983, 1027
Tetramers monogallate 5 1305,5 575, 729, 1027, 863, 1017, 1179
Tetramers digallate 1 728,3 575, 729, 879, 1017, 1169, 1331
Pentamers 6 1441,4 441, 577, 863, 1027, 1153, 1316
Pentamers monogallate 1 1593,4 575, 863, 1017, 1179, 1304, 1468
Pentamers digallate 3 873,4 575, 729, 1017, 1169, 1457, 1576
Hexamers 1 865,0 575, 1151, 1314, 1441
Hexamers monogallate 2 940,8 739, 864, 1152, 1303, 1441, 1593
Heptamers 1 1008,8
 Conclusions
 It has been performed the optimization of a method based on a powerful technology:
comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled to diode array dection and
tandem mass spectrometry (LCxLC-DAD-MS), to the grape seed procyanidins characterization by
the whole sample analysis.

 The separation capacity of the conventional monodimensional methods was enhanced by

combining HILICxRP in the two dimensions.

 It has been achieved the separation of the procyanidins according to their polimerization degree
on the first dimension and according to their relative hydrophobicity in the second dimension.

 The use of a diode array detector and a mass spectrometer has allowed to tentatively identify
many of the separate compounds (up to heptamers).

Future perspectives
 It is predicted that in a near future, quantification mechanisms of the maximum
number of procyanidins can be developed, also the extension of the application of
this methodology to the comparative study of the procyanidins composition of
different grapes varieties, and other complex samples.