PRACTICA N°10

RECUPERACIÓN DE PRODUCTO EXTRACELULAR:

Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides
PRODUCTOR DE EXOPOLIZACARIDO DEXTRANO

NOMBRE: CHERO NUNURA ANDY NÚMERO: #12

I. INTRODUCCIÓN:

La pérdida de sacarosa y la formación de dextrano están asociadas con el deterioro

de la caña de azúcar. El azúcar producido con caña deteriorada contiene un alto
contenido de dextrano y no reúne las condiciones de aceptabilidad para su empleo
como materia prima en la elaboración de algunos alimentos. Durante años este ha
sido un problema que la industria azucarera ha enfrentado, convirtiéndose en un
reto para el mejoramiento de la calidad y producción del azúcar. Las
características físicas y químicas del jugo de caña de azúcar hacen de éste un
excelente sustrato para el desarrollo de microorganismos. Uno de estos
microorganismos es Leuconostoc mesenteroides el cual degrada la sacarosa
presente en el jugo y forma de incorporar al mismo tiempo, metabolitos como el
ácido láctico, acético, etanol, manitol y polisacáridos como dextrano y lévanos.
El dextrano es una goma soluble en agua que se utiliza ampliamente como
espesante, gelificante, agente de suspensión y coloide protector en distintos
productos de consumo humano. Este polisacárido muestra características propias
aplicables en productos alimenticios como estabilizador de jarabes azucarados,
helados, dulces y clínicamente como expansor del plasma sanguíneo. Leuconostoc
mesenteroides ssp. mesenteroides es una bacteria constituyente de la microbiota
del jugo de la caña de azúcar que procede de la molienda en las empresas
azucareras y es la subespecie de mayor interés industrial como productor de
dextrano.

II. OBJETIVOS:

 Reconocer y aislar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides.

 Identificar el tipo de cultivo que permita identificar Leuconostoc
mesenteroides ssp. mesenteroides.
 Familiarizarnos con las condiciones necesarias para poder mantener
Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides productor de dextrano.
III. METODOLOGÍA:

Aislamiento e identificación de Leuconostoc mesenteroides ssp.

mesenteroides.

MUESTRA

 La muestra en la cual encontraremos la bacteria será jugo primario de la molienda

de caña de azúcar.

PROCESAMIENTO DE MUESTRA

 La muestra contiene una concentración elevada de bacterias es por eso que se

realizara una dilución de 1ml de la muestra en 9 ml de solución salina esterilizada
la cual contiene 0.85 % V/V de NaCl.
AISLAMIENTO DE LEUCONOSTOC

 De la muestra anteriormente diluida tomamos con un asa de siembra esterilizada

una pequeña alícuota.

 Sembramos la muestra en una placa de Petri con agar hipersacarosado (10 %

sacarosa) mediante la técnica de agotamiento y estría.

 Llevamos a incubar a 30°C por 48 horas y observamos.

  Las colonias anteriormente seleccionadas las sembramos con ayuda de un asa en
una nueva placa de Petri que contenga como medio de cultivo de agar
hipersacarosado modificado (carece de sacarosa).

 La placa de Petri anteriormente sembrada se lleva a incubar a 30°C por 24 horas

y observamos.

IDENTIFICACIÓN DE LA SUBESPECIE

Para identificar la especie y subespecie, utilizar las colonias desarrolladas sobre agar
hipersacarosado modificado y tomar en cuenta la morfología y fisiología celular.

Para determinar la morfología observar las colonias características sin dextrano:

Realizar una tinción de Gram y reconocer la morfología celular: cocos Gram positivos,
dispuestos en pares y en cadenas cortas sin formas esporuladas. Para determinar la
fisiología realizar las pruebas de catalasa (negativo), la fermentación de carbohidratos
(Glucosa: acidez +, gas +; Arabinosa (acidez +); Fructosa, sucrosa o trehalosa (acidez +)
y formación de dextrano a partir de sacarosa (+).

 Subcultivar la especie identificada en dos viales, uno conteniendo agar

hipersacarosado y otro con agar hipersacarosado modificado.

 Acondicionamos e incubamos a 30°C por 24 horas y obtenemos un cultivo puro

de Leuconostoc mesenteroides.

 Para identificar la subespecie sembramos una muestra del vial que contiene el agar
hipersacarosado modificado en un tubo de ensayo que contiene caldo arabinosa.
  Incubar por 24 horas a 30 °C y observamos. Si la muestra es rosada es la
subespecie dextranium, pero si es de color amarillo pertenecerá a la subespecie
mesenteroides.

L. mesenteroides ssp. Mesenteroides L. mesenteroides ssp. dextranium

IV. CONCLUSIONES:

 La siembra de aislamiento nos permite estudiar con más precisión a la

bacteria que en sus colonias no son tan abundantes.
 Cuando sembramos un agar hipersacarosado modificado nos damos
cuenta que crece la bacteria, pero no se produce dextrano, esto es, gracias
a que dicho agar no contiene sacarosa.
 La transformación de la sacarosa a azucares reductores, ácidos y otros, por
acción de la enzima invertasa proviene principalmente de la bacteria.

V. BIBLIOGRAFÍA:

Tortora,G.J., Funke, B.R., y Case,C.L.(2007).Introducción a la Microbiología(9a.ed.).

Buenos Aires, Argentina: Editorial Médica Panamericana.

E. Valenzuela, E.E (2006). Producción De Dextrán, A Nivel Laboratorio, Como

Derivado De La Sacaros, Usando Jugo De Caña (tesis no publicada). Universidad
de San Carlos de Guatemala. Guatemala.
 PRACTICA N°13
Aspergillus niger PRODUCTOR DE ÁCIDO CÍTRICO

NOMBRE: CHERO NUNURA ANDY NÚMERO: #12

I. INTRODUCCIÓN:

El ácido cítrico tiene un fuerte sabor ácido no desagradable. Este ácido se obtiene
por un proceso de fermentación. El ácido cítrico se obtenía originalmente por
tracción física del ácido del zumo de limón. Hoy en día la producción comercial
de ácido cítrico se realiza sobre todo por procesos de fermentación que utilizan
dextrosa o melaza de caña de azúcar como materia prima y Aspergillus
niger como organismo de fermentación. La fermentación puede llevarse a cabo
en tanques profundos (fermentación sumergida, que es el método más común) o
en tanques no profundos (fermentación de superficie). La fermentación produce
ácido cítrico líquido que luego se purifica, concentra y cristaliza.

El ácido cítrico es obtenido principalmente en la industria gracias a

la fermentación de azúcares como la sacarosa o la glucosa, realizada por un
microorganismo llamado Aspergillus niger. El proceso de obtención tiene varias
fases como la preparación del sustrato de melaza, la fermentación aeróbica de la
sacarosa por el Aspergillus, la separación del ácido cítrico del sustrato por
precipitación al añadir hidróxido de calcio o cal apagada para formar citrato de
calcio. Después se añade ácido sulfúrico para descomponer el citrato de calcio. La
eliminación de impurezas se realiza con carbón activado o resinas de intercambio
iónico, se continúa con la cristalización del ácido cítrico, el secado o
deshidratación y el empaquetado del producto.

II. OBJETIVOS:

 Reconocer Aspergillus niger.

 Conocer y familiarizar los diferentes elementos que componen la
producción de ácido acético a través de Aspergillus niger.
 Seleccionar el medio de cultivo, condiciones de crecimiento y producción
de Aspergillus niger.
III. METODOLOGÍA:

Aislamiento e identificación de A. niger

MUESTRA

 Recoger 100 g de suelo radicular.

TRATAMIENTO DE LA MUESTRA

 Tamizar 10 g de la muestra con ayuda de una malla de 1,6mm.

 Diluir la muestra tamizada en 90 ml de solución salina esterilizada y
homogeneizar por 20 minutos aproximadamente.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

 Con ayuda de un asa tomamos una alícuota de la muestra diluida y sembramos en

una placa de Petri que contenga agar Sabouraud y antibiótico con la técnica de
agotamiento y estría.

 Incubamos la placa de Petri a 30 °C por 5 días.

 Con ayuda de un asa cogemos una pequeña muestra de una colonia característica
de Aspergillus niger y luego sembramos en un vial con agar Sabouraud.

 Incubamos por 5 días a 30°C y tenemos un cultivo puro de Aspergillus niger.

CARACTERÍSTICAS
MACROSCÓPICAS

Aspecto pulverulenta y uniforme

Las colonias son inicialmente
amarillas, pero rápidamente se
desarrollan y se vuelven negras.

Superficie rugosa
Borde irregular
Detección y selección de A. niger productor de ácidos orgánicos
 DETECCIÓN:
SCREENING PRIMARIO

 Tomamos un pequeño fragmento de colonia del cultivo puro de A. niger y lo

colocamos en una placa de Petri que contenga agar carbonato de calcio.

 Acondicionamos la placa de Petri e incubamos por 5 días a 30°C. luego

reconocemos la producción de acidez a través de la formación de halo traslucido
alrededor de la colonia.
 MANTENIMIENTO DE A.
NIGER

 Después de la incubación mantener refrigerado

IV. CONCLUSIONES:

 A grandes rasgos el desarrollo morfológico de A. niger sigue los siguientes

pasos: las esposas una vez inoculadas en el medio de cultivo comienzan a
hincharse y a adherirse entre sí, luego emiten al primer tuvo generando la
hifa, se ramifica.
 El ácido cítrico se obtiene por un proceso de fermentación que utilizan
dextrosa o melaza de caña de azúcar como en esta práctica y A. niger como
organismo de fermentación.

V. BIBLIOGRAFÍA:

Prats, G. (2006). Microbiología Clínica. Madrid, España: Editorial Médica

Panamericana.
Klages, F. (2006). Tratado de química orgánica: Química orgánica sistemática.
Barcelona, España.
 PRACTICA N°11
BACTERIAS ACÉTICAS PRODUCTORAS DE VINAGRE:
Acetobacter y Gluconobacter

NOMBRE: CHERO NUNURA ANDY NÚMERO: #12

I. INTRODUCCIÓN:

Las acetobacterias son el conjunto heterogéneo de bacterias que son capaces de

transformar el alcohol en ácido acético. Todas ellas tienen características
comunes. Todas ellas son Gram negativas y tolerantes al ácido, puesto que de otra
forma su propio metabolismo del ácido acético las mataría. Son capaces de vivir
en unas concentraciones de pH ácidas que va desde el pH 5,5 al pH 6,3. Además
para llevar a cabo la transformación del alcohol emplean oxígeno, por lo que son
aerobias, es más para crecer necesitan oxígeno, por lo que son aerobias estrictas.
Por otra parte, son todas flageladas, aunque unas tienen flagelación polar y otras
peritrica. Las de flagelación polar no son capaces de oxidar el alcohol
completamente, mientras que las de flagelación peritrica, como las del
género Acetobacter, pueden oxidar completamente el ácido acético hasta dióxido
de carbono (CO2).

La distribución de estas bacterias es mundial. Se pueden encontrar en asociación

a las bacterias fermentadoras que se encuentran de manera natural en todos
aquellos lugares que puedan contener alcoholes, como encima de las frutas y
flores, en los panales de las abejas y en el agua o el suelo. A diferencia de las
bacterias fermentadoras las bacterias del ácido acético necesitan de la presencia
de aire para llevar a cabo el metabolismo de este compuesto. Las acetobacterias
tienen su óptimo de crecimiento en un rango de temperatura comprendido entre
los 25 y los 30 ºC.

II. OBJETIVOS:

 Identificar el medio de crecimiento de las bacterias acéticas.

 Aislar las bacterias acéticas en un medio de cultivo adecuado.
 Mantener adecuadamente los cultivos de las bacterias acéticas
productoras de acidez.
III. METODOLOGÍA:

Aislamiento e identificación de bacterias acéticas.

MUESTRA

 Las bacterias acéticas las podemos encontrar en frutas ácidas: Agaymanto,

naranja, limón, uva, etc.

ENRIQUECIMIENTO

 Depositamos 25 ml de cerveza en frascos de boca ancha previamente

esterilizados.
 Sumergimos las frutas ácidas por separados en los frascos con cerveza y agitamos
por 20 minutos aproximadamente.

 Retiramos las frutas con ayuda de una pinza y acondicionamos los frascos con
gasa e hilo pabilo.

 Incubamos a 30 oC (temperatura ambiente) por 4 o 5 días.

 Luego del tiempo de incubación podemos observar una película blanquecina sobre
la superficie la cual indica el crecimiento bacteriano. En nuestro caso solo se
observó en la muestra de la NARANJA.

AISLAMIENTO

 Tomamos una muestra de la película blanquecina cerca del mechero para evitar
contaminación.

 Sembramos la muestra en agar Lee mediante la técnica de agotamiento y estría.

 Incubamos en aerobiosis a 30 o C por 24 horas.

 Seleccionamos las colonias amarillas. Por otra parte, se puede hacer una tinción
de Gram para observar los bacilos pleomórficos G (-)

 Sembramos la colonia seleccionada en un vial que contenga agar Lee con la

técnica de estría e incubamos a 30 oC por 24 horas.
IDENTIFICACIÓN

Tipos

Acetobacter Gluconobacter

Alcohol
Ácido Acético Ácido Acético
Se acaba
el alcohol
CO2 + H2O ----------

Superoxidante Suboxidante

 Luego de la incubación observamos el vial de color amarillo lo cual indica la

formación de ácido acético.

 Incubamos a 30 o C por 72 horas.

  Si las colonias siguen amarillas se tratará de Gluconobacter pero si se observa de
color verde entonces será Acetobacter.

Gluconobacter Acetobacter

IV. CONCLUSIONES:

 Las bacterias acéticas son usadas en la producción del ácido acético.

 Las bacterias acéticas necesitan oxígeno en su medio para poder
desarrollarse.
 Este grupo de microorganismos necesita del oxígeno como aceptor final
de electrones, por lo que tienen un metabolismo aerobio obligado.
 El ácido acético también es mejor conocido como ácido
metilencarboxílico, se puede encontrar en forma de ion acetato. Éste es un
ácido que se encuentra en el vinagre, siendo el principal responsable de su
sabor y olor agrios.

V. BIBLIOGRAFÍA:

Morcillo, G. (2013). Biotecnología y alimentación. Madrid, España: UNED.

Tortora,G.J., Funke, B.R., y Case,C.L.(2007).Introducción a la Microbiología(9a.ed.).

Buenos Aires, Argentina: Editorial Médica Panamericana.