UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA II

DOCENTE: Ing. Cecilia Carpio

AYUDANTE: Egda. Ximena González
ESTUDIANTE: Daniela Aguas
SEMESTRE: Sétimo “U” Bioquímica
PRACTICA: 1

TEMA: “AISLAMIENTO DE LEVADURAS”

1. INTRODUCCIÓN:

Las levaduras son reconocidas como hongos unicelulares que se reproducen principalmente por
gemación y, ocasionalmente, por fisión. Las especies de levaduras pueden ser identificadas y
caracterizadas de acuerdo a diversos criterios basados en la morfología celular (por ejemplo, el
modo de la división celular y la forma de esporas), fisiología (por ejemplo, las pruebas de
fermentación de azúcares), inmunología (por ejemplo, la aglutinación de anticuerpos y de
inmunofluorescencia), y la biología molecular (Valenzuela, 1998).

Su aislamiento requiere de tiempo ya que las diferentes especies de levaduras se encuentran

entremezcladas, de modo que integran comunidades mixtas. Por esta razón, para poder estudiar
un tipo de levadura, especifico es necesario producir un cultivo puro, es decir, un cultivo en el que
solo haya una especie, en el laboratorio es posible cultivar levaduras en un medio enriquecido con
nutrientes apropiados. Ese medio puede ser vertido en un tubo de ensayo o caja Petri
(Schaechter, 2004).

Las levaduras son capaces de crecer en ambientes anaerobios facultativos. Las levaduras pueden
utilizar el oxígeno o un compuesto orgánico como aceptor final de electrones, lo que es un
atributo valioso porque permite que estos hongos sobrevivan en ambientes diversos. Si se les da
acceso al oxígeno, las levaduras realizan la respiración aeróbica para metabolizar los hidratos de
carbono en dióxido de carbono y el agua, sin oxígeno, realizan la fermentación de carbohidratos y
la producción de etanol y dióxido de carbono. Esta fermentación se utiliza en la elaboración de la
cerveza, vino, y las industrias de panadería. La especie Saccharomyces puede producir etanol en
las bebidas elaboradas y de dióxido de carbono para el leudado de masa de pan (Tortora, 2010).

2. OBJETIVOS:

Objetivo General:

 Aislar una cepa de levadura de panificación para lo obtención de un cultivo puro en medio
YEPD (dextrosa) y YEPS (sacarosa).
Objetivos Específicos:

 Cuantificar el número de colonias formadas en PDA y YED en función de la dilución

sembrada.
 Establecer la relación entre el peso seco y UFC mediante procesos de centrifugación y
siembra por vertido respectivamente.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:

Medio 1: extracto de levadura- Medio 2: extracto de levadura- Materiales

peptona-dextrosa (YEPD)/l peptona-sacarosa (YEPS)/l
Extracto de levadura, 10,0 g Extracto de levadura, 10,0 g - Asas de vidrio; Asa metálica
Peptona, 20,0 g Peptona, 20,0 g - Medidor de pH o papel para
Dextrosa, 20,0 g Sacarosa, 20,0 g medir pH
Agar, 17,5 g Agar, 17,5 g - Pipetas estériles
Agua destilada 950 ml Agua destilada 950 ml - Gradillas
- Mechero bunsen
- Levadura de panificación en pasta ó liofilizada - Estufa para incubación a
- HCl 0,1M y 1M; 30°C
- Etanol al 70% - Microscopio
- Cajas petri;
- tubos bacteriológicos
- Tubos de centrífuga tarados

4. PROCEDIMIENTO:

Preparación de los medios YEPD y YEPS (200 ml de cada uno):

Se pesó por separado los componentes del medio de cultivo. Se hirvió el
agua destilada y se disolvió los componentes de cada medio a excepción del
agar. Se tomó 20 ml de este medio y se reguló el pH a 5,4, seguidamente se
colocó 9 ml del medio en dos tubos de tapa rosca.

Se añadió el agar al resto del medio de cultivo y se reguló el pH final del

medio a 5,4. Se vertió 16 ml del medio en 6 tubos de tapa rosca, se tapó sin
apretar y se esterilizó en un autoclave por 15 min a 121°C. Se dejó los tubos
en una incubadora a 55°C hasta el momento de utilizarlo.

Agua para dilución: cSe colocó 9,0 ml en cuatro tubos y 9,9 ml agua
destilada en seis tubos bacteriológicos y se esterilizó.
Se esterilizó 16-20 cajas petri.
Se Taró 4 tubos de centrífuga
 Se preparó una suspensión de 1 g levadura en pasta o liofilizada con 9 ml de agua estéril.

Se tomó 1 ml de la suspensión e inoculó a cada tubo que contiene el medio de cultivo líquido (YEPD y YEPS; por
duplicado), se mezcló e incubó bajo agitación (magnética) hasta el día siguiente a temperatura ambiente.

De estos cultivos se realizó diluciones hasta 10-8 en agua destilada estéril después de extraer las muestras para
determinar el peso seco. Las diluciones 10-1 y 10-2 en los tubos que contienen 9,0 ml de agua estéril y las diluciones
restantes en los tubos con 9,9 ml de agua estéril.

Determinación del peso seco

Sembrado en estría Sembrado por vertido
celular

Se pesó los tubos de centrífuga Se añadió 1 ml de la

vacíos. Se tomó 5 ml del
cultivo líquido,se añadío a los
tubos y pesó. Se hervió los
tubos por 5 minutos, se enfrió
y centrifugó a 5950 rpm.
Se flameó el asa de siembra y
se enfrió suficientemente
antes de introducirla en el
cultivo líquido.
suspensión de levadura de las
diluciones 10-4 a 10-8 a la caja
petri estéril y se añadió 15 ml
del agar estéril contenido en
los tubos.

Se eliminó el sobrenadante y Se tomó una muestra del Se mezcló la suspensión de

lavó el precipitado con 5ml de cultivo líquido con el asa, se levadura con el medio con
agua destilada y volvió a tocó la superficie del medio movimientos en sentido
centrifugar. Se eliminó el agua sólido con el asa y deslizarlo vertical, horizontal y con
de lavado y secó en una estufa con un movimiento continuo movimientos. Se dejó
hasta peso constante, a 60C. en zigzag. solidificar el medio inoculado,
invetidas en la estufa a 30°C
por 48 h.

Se esterilizó el asa tras cada

inoculación.
Se repitió el procedimiento
hasta completar las cajas y se
flameó el asa al finalizar el
proceso.
5. DATOS OBTENIDOS:

Tabla N.- 1 “Pesos de los tubos antes y después de centrifugación”

Soluciones Tubo vacío (g) Tubo vacío + muestra (g) Tubo vacío + residuo (g)
1 sacarosa 5,4910 14,3070 5,5318
2 sacarosa 5,5159 14,4994 5,5553
1 glucosa 5,4785 14,4938 5,5114
2 glucosa 5,5100 14,5083 5,5429

Elaborado por: Daniela Aguas (2013)

Fuente: Laboratorio de Bioquímica (UTA. FCIAL)

Tabla N.- 2 “Número de colonias de Levadura”

Soluciones Dilución # de Colonias

1 sacarosa 10-6 40
2 sacarosa 10-6 20
1 glucosa 10-6 46
2 glucosa 10-8 3

Elaborado por: Daniela Aguas (2013)

Fuente: Laboratorio de Bioquímica (UTA. FCIAL)

Tabla N.- 3 “Gráficos de Levadura en medios de Sacarosa y Glucosa”

GLUCOSA
DILUCIONES ESTRÍA COMPUESTA

1X10-8
1X10-6
1X10-4

VERTIDO EN PLACA

1X104
1X106
1X108
 SACAROSA
DILUCIONES ESTRÍA COMPUESTA

1X10-4
1X10-6
1X10-6

VERTIDO EN PLACA

1X10-4
1X10-6
1X10-8

Elaborado por: Daniela Aguas (2013)

Fuente: Laboratorio de Bioquímica (UTA. FCIAL)

6. CÁLCULOS Y RESULTADOS:

1. Calculo de la masa y residuo celular.

1er Tubo Sacarosa

Masa= (Tubo vacío + muestra) - (Tubo vacío)

Masa= 14,3070- 5,4910
Masa= 8,8160

Residuo= (Tubo v + residuo) - (Tubo vacío)

Residuo= 5,5318 – 5,4910
Residuo= 0,0408

UFC= Fdilución* Ncolonia/ Vinoculado

UFC= 1x106 x (40)/1
UFC= 4,0 x 107
Tabla N.- 4 “Resultados de UFC, masa y residuo celular “

Soluciones MASA (g) RESIDUO (g) UFC/ml

1 sacarosa 8,8160 0,0408 4,0x107
2 sacarosa 8,9835 0,0399 2,0x107
1 glucosa 9,0154 0,0329 4,6x107
2 glucosa 8,9923 0,0329 3x108

Elaborado por: Daniela Aguas (2013)

Fuente: Laboratorio de Bioquímica (UTA. FCIAL)

2. Calculo de la masa celular seca.

1er Tubo Sacarosa

R
[X] =
M

0,0408 g de x 1000 𝑔
[X] = ( )( )
8,8160 g 1 𝑘𝑔(𝑙)

[X] = 4,627 g/l

Tabla N.- 5 “Resultados de masa celular seca “

Soluciones Masa c. seca (g/l) x͞ (promedio) Desv. Estandár

1 sacarosa 4,6279
2 sacarosa 4,4414 4,5346 0,1318
1 glucosa 3,6493
2 glucosa 3,6586 3,6539 6,57E-3

Elaborado por: Daniela Aguas (2013)

Fuente: Laboratorio de Bioquímica (UTA. FCIAL)

7. DISCUSIÓN:

La utilización de diferentes medios de cultivo para el aislamiento de levadura de panificación

permitió observar la eficiencia de cada uno de ellos en función del crecimiento de colonias en el
momento de realizar vertido en placa y sembrado por estrías. Se presentaron varios problemas
debido a que luego de incubado la levadura presentó gran contaminación, de todas maneras al
repetir la inoculación se tomaron como referencias el número de colonias de vertido en placa con
diluciones 10-6 y 10-6 con 40 y 20 levaduras respectivamente en el medio de sacarosa y para el
medio de glucosa 10-6 y 10-8 con 46 y 3 levaduras respectivamente. Así pues según los UFC
calculados (ver tabla 4.) el medio que aporta mejores condiciones para el desarrollo de las
levaduras es el de glucosa a pesar de que este medio es el que presente mayor contaminación;
posiblemente debido a varios factores como la falta de esterilización de puntas, contaminación en
la cámara de flujo, mala esterilización de asas, e incluso el inconveniente con la solidificación del
agar entre otros.
En cuanto al cálculo del peso celular seco se centrifugó varias veces la suspensión de levadura
hasta poseer un residuo consistente, según los valores (tabla 5.) al relacionar el residuo para la
masa, el medio de sacarosa en promedio es que mayor masa celular tiene con un valor de 4,5346g
pero el medio de sacarosa a pesar de poseer un promedio inferior, su desviación estándar es
menor lo que indica la cercanía que guardan los datos experimentales en cuanto a precisión en el
trabajo realizado. Al relacionar el peso seco celular con los UFC se tiene que para la primera replica
de sacarosa por ejemplo por cada 4,62 mg/ml se obtendrá 4,0x10-7 UFC/ml de levadura y así
respectivamente para cada solución.
Con respecto al aislamiento de levaduras es importante poseer colonias puras debido a su gran
importancia industrial y para esto se han desarrollado técnicas selectivas empleando medios que
permiten a dichos organismos crecer suprimiendo el crecimiento de otros microorganismos que
no sean parte del estudio (Valenzuela, 1998).

8. CUESTIONARIO:

¿Qué otros métodos para determinar la pureza de un cultivo conoce?

 Tinción de Gram
 Tinción de Cápsulas
 Tinción de Endosporas
 Caracterización Macroscópica
 Caracterización Microscópica
 PCR
 Conteo en hemocitómetro
(Prescott, 2002)

9. CONCLUSIONES:

 Se aisló una cepa de levadura de panificación para lo obtención de un cultivo puro en YEPS
y YEPD, de esta manera se apreció el mejor medio para que la levadura se desarrolle, el
medio con mayor número de colonias fue la glucosa.
 Se cuantificó el número de colonias formadas en ambos medios en función de la dilución
realizada y el número de UFC calculado por replica de solución; se presentaron problemas
en la pureza del medio posiblemente debido a falta de asepsia y esterilización lo que
dificultó el conteo.
 Se estableció la relación de los UFC y el peso celular seco de las levaduras a partir del
número de colonias y de la masa para el residuo después de la centrifugación
respectivamente, además de calcular la desviación estándar y el promedio de cada
suspensión lo que confirma que la mejor fuente de carbono para el desarrollo de la
levadura es la glucosa.
10. BIBLIOGRAFÍA:

 Prescott, L. 2002. “Microbiología”. Quinta Edición. McGraw-Hill Interamericana S.A.

Madrid, España.
 Schaechter, M. 2004. “The Desk Encyclopedia of Microbiology”. First Edition. Elsevier
Academic Press. San Diego-USA.
 Tortora, G. “Microbiology: An Introduction”. Tenth Edition. Pearson Benjamin
Cummings. San Francisco-USA, 2010.
 Valenzuela, C. 1998. “Introducción a la Microbiología”. Ediciones Universidad de
Salamanca. Primera Edición. Salamanca- España. Pág. 360- 372