Resolución mediada por ZATT (ZNF451) de enlaces

cruzados topoisomerasa 2 ADN-proteína

Matthew J. Schellenberg,1* Jenna Ariel Lieberman,2* Andrés Herrero-Ruiz,2 Logan R.
Butler,1 Jason G. Williams,3 Ana M. Muñoz-Cabello,2† Geoffrey A. Mueller,1 Robert E.
London,1 Felipe Cortés-Ledesma,2‡ R. Scott Williams1‡

1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of

Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC 27709, USA. 2Centro
Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), CSIC–Universidad
de Sevilla Universidad Pablo de Olavide, 41092 Sevilla, Spain. 3Epigenetics and Stem
Cell Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Research
Triangle Park, NC 27709, USA.
*These authors contributed equally to this work.
†Present address: Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario
Virgen del Rocío–CSIC–Universidad de Sevilla, Departamento de Fisiología Médica y
Biofísica, CIBERNED, 41013 Sevilla, Spain.
‡Corresponding author. Email: felipe.cortes@cabimer.es (F.C.-L.);
williamsrs@niehs.nih.gov (R.S.W.)

Las transacciones de la topoisomerasa 2 (TOP2) y el AND son esenciales para la vida, y

proceden a través de la formación de un complejo de escisión de la TOP2 (TOP2cc), una
reacción intermedia enzima-ADN covalente que es vulnerable a ser atrapada por las
potentes drogas TOP2 anticáncer. No está claro cómo se resuelven los enlaces cruzados
genotóxicos de TOP2 ADN-proteína Encontramos que la ligasa SUMO ZATT (ZNF451) es
un factor de reparación de ADN multifuncional que controla las respuestas celulares al
daño de TOP2. La unión de ZATT a TOP2cc facilita la actividad de tirosil-ADN
fosfodiesterasa 2 (TDP2), hidrolasa independiente del proteasoma sobre el TOP2cc
atascado. La actividad de la ligasa ZATT SUMO promueve además las interacciones de
TDP2 con la TOP2 SUMOilatada, que regula el reclutamiento eficiente de TDP2 a través
de una plataforma de participación SUMO2 "SIM dividida". Estos hallazgos descubren
una ruta catalizada por ZATT-TDP2 y modulada por SUMO2 para la resolución directa
de TOP2cc.

La topoisomerasa 2 (TOP2α y TOP2β en las células de los mamífero) regulan la

topología del AND a través de la producción de un corte transitorio del AND
bicatenario (DSBs) (1). El intermediario clave en la reacción de la TOP2 es un complejo
de escisión covalente proteína-ADN TOP2 (TOP2cc), un enlace cruzado ADN-proteína
que se forma entre el sitio activo de la tirosina de la TOP2 y el 5’ terminal de el dúplex
de ADN cortado (2) (Fig. 1A). La TOP2 es crítica para facilitar los procesos del ADN tales
como la replicación y la transcripción (3-5). Sin embargo, puede quedar atrapada sobre
el ADN por tóxicos, incluidas las drogas anticáncer como el etopósido, o por unirse a
un sitio dañado del ADN ya existente. La intoxicación da como resultado roturas
estables de ADN bloqueadas por proteína que son impedimentos para elongar ARN y
ADN polimerasas y que causa la muerte celular (1–4, 6, 7).
 La tirosil-ADN fosfodiesterasa 2 de los vertebrados (TDP2, también conocida
como VpG desligasa, TTRAP o EAPII) resuelve directamente los enlaces proteína-ADN
(5'-fosfotirosilo) característicos de los DSB inducidos por la TOP2 (7-11). En este
contexto, la TDP2 modula la supervivencia celular y del organismo (12) después de los
tratamientos con drogas anticáncer dirigidas a la TOP2, y los inhibidores de TDP2 son
prometedores para quimioterapia (13, 14). Una cuestión crítica en la biología de la
TOP2 es cómo TDP2 accede al enlace químico TOP2-fosfotirosil del ADN, que está
protegido dentro de la cubierta de proteína TOP2 (15, 16) (Fig. 1A). Debido a que el
tratamiento con etopósido puede gatillar la degradación de la TOP2 por el proteasoma
(17-19), se hipotetiza que TDP2 procesa los oligopéptidos TOP2-ADN después de la
degradación proteolítica del TOP2cc (20). Sin embargo, las bases moleculares para la
regulación, coordinación y control del metabolismo del TOP2cc aún no están claras.
Para identificar moduladores de la reparación del TOP2cc dependientes de
TDP2, expresamos de forma estable TDP2 marcado con YFP en células HEK293F,
complejos proteicos que contienen TDP2 purificados usando nanocuerpos anti-
GFP/YFP de dominio único de camélido (sdAb), y proteínas copurificantes por LC-
MS/MS (Fig. S1, A a C).
Observamos el enriquecimiento importante de TOP2α, TOP2β y SUMO2
(pequeño modificador tipo ubiquitina 2), pero no de los péptidos SUMO1 en los
inmunoprecipitados (IP) YFP-TDP2 (tablas S1 y S2). El Western-blotting reveló que
TDP2 interactúa con una escalera de TOP2α y TOP2β intactas (no proteolizadas)
(Fig.1B, carril 5), que se modifica postranslacionalmente con SUMO2 (Fig.S1D, carril 4).
TOP2 se conjuga con SUMO2 durante la mitosis o en respuesta a tóxicos de
TOP2 (21-23), y encontramos que el tratamiento con etopósido antes de la IP TDP2
aumentó la cantidad de SUMO2 de alto peso molecular, y el grado de modificación de
TOP2α y TOP2β (fig. S1E, carriles 8-12). Curiosamente, IP llevado a cabo con una
variante catalíticamente inactiva de TDP2H351N (8) estaba casi desprovisto de SUMO2-
TOP2 (Fig. 1B, carril 6), lo que sugiere que se requiere la catálisis TDP2 para liberar
TOP2 SUMOilado intacto de la fracción de cromatina insoluble. Esto nos llevó a evaluar
el vínculo no probado entre el proteosoma y la TDP2 en la reparación del TOP2cc
envenenado mediante el control de la resolución de los focos de fosfohistona H2AX
(γH2AX) después del tratamiento con etopósido. Como se informó anteriormente, los
fibroblastos embrionarios de ratón Tdp2 knockout (Tdp2 -/-) (MEF) muestran una
resolución retardada de los focos γH2AX inducidos por etopósido en relación con las
células Tdp2 +/+ (11), y esto fue severamente afectado por la inhibición del
proteasoma con MG132 (Fig. 1C y fig. S1F). Estos datos son consistentes con un
mecanismo de resolución del TOP2cc dependiente de TDP2 SUMO2 que actúa de
forma independiente o paralela a la reparación TOP2cc mediada por el proteasoma.
Para identificar los factores que regulan la reparación de TOP2cc dependiente
de SUMO2 y TDP2, realizamos purificaciones de afinidad en tándem (TAP) de células
HEK293F que expresan YFP-TDP2 y SUMO2 marcado con His6 (Fig.1D y Fig.S2A). Las
muestras de TAP contenían una escalera de proteínas modificadas con SUMO2 (Fig.
1D, carriles 5). El tratamiento con ULP1 SUMO2 proteasa de esta escalera descubrió
cuatro proteínas (Fig. 1D, carriles 8): TOP2α, TOP2β, SUMO2 y ZNF451 (un miembro
prototipo de una clase recientemente identificada de ligasas SUMO2 E3/E4) (Fig. S2B)
(24, 25). Similar a TDP2, las muestras de IP de ZNF451 endógena o GFP-ZNF451 se
enriquecieron con SUMO2, TOP2α y TOP2β (Figs. S2, C y D, y tablas S1 y S3), lo que
sugiere que estas proteínas forman un complejo funcional en las células. Además,
ZNF451 recombinante se unió a TOP2α y TOP2β (fig. S2E). Se reclutó ZNF451 a la
fracción de cromatina celular después del tratamiento con etopósido cuando se inhibe
el proteasoma (Fig. 1E), pero no mediante DSB inducidos por radiación ionizante (Fig.
S2F). Estos datos indican que ZNF451 se une directamente a TOP2 y se recluta a la
cromatina después de la intoxicación de la TOP2.
TDP2 es incapaz de hidrolizar enlaces cruzados TOP2 ADN-proteína (ScTOP2cc)
de Saccharomyces cerevisiae recombinantes intactos in vitro, pero la actividad es
activada por desnaturalización por calor de ScTOP2cc (20), lo que sugiere que la
resolución del TOP2cc podría ser regulada por mecanismos independientes del
proteasoma. Dada la unión directa de ZNF451 a TOP2 y TDP2 (Figs. S2D y S3A),
planteamos la hipótesis de que ZNF451 podría regular la actividad de TDP2 en TOP2cc.
Para probar esto, generamos TOP2cc reconstituido mediante reacción de TOP2α o
TOP2β con un sustrato de oligonucleótido suicida (20) (Fig.2A), y se ensayó la
resolución TOP2cc dependiente de TDP2 (fig. 2B y fig. S3, B a D). Encontramos que la
TOP2cc de mamíferos es generalmente refractaria a la resolución directa por TDP2,
excepto a altas concentraciones de TDP2 donde observamos la liberación de una
pequeña cantidad de producto de ADN 15nt, indicativo de hidrólisis catalizada por
TDP2 de TOP2cc (Fig. 2B, carriles 7 y 8, y fig. S3B). Sorprendentemente, TDP2 fue más
activo en TOP2cc (α y β) en presencia de ZNF451 en más de tres órdenes de magnitud,
siendo las concentraciones nanomolares de ZNF451 y TDP2 suficientes para catalizar la
hidrólisis TOP2cc (Fig. 2B y Fig. S3, B a E). Ni el ZNF451 solo ni un mutante TDP2H351N
alterado catalíticamente soportaron esta reacción (Fig. S3F, carriles 4 y 6) indicando
que el ZNF451 estimula la hidrólisis TOP2cc catalizada por TDP2. El sondeo de la
estructura TOP2cc sugiere que ZNF451 altera la conformación del TOP2cc para facilitar
la reacción de resolución directa de TDP2 (fig. S3G).
Para evaluar la contribución de ZNF451 a la reparación del TOP2cc en células de
mamíferos, examinamos la sensibilidad celular de ΔZNF451, ΔTDP2, y ΔTDP2/Δ ZNF451
doble knockout en líneas celulares HEK293F a etopósido (Fig. 2C y la Fig. S4, A y B). La
deleción de ZNF451 confería una sensibilidad a etopósido aún más grave que la
deleción de TDP2 (Fig. 2C). De manera similar, la inhibición de ZNF451 mediada por
shRNA sensibilizó a las células HEK293F a etopósido, mientras que la sobre-expresión
de GFP-ZNF451 disminuyó la sensibilidad al etopósido, indicando que la expresión del
ZNF451 se correlaciona directamente con la resistencia al etopósido de manera
dependiente de la dosis (Figs. S4, C y D). Este efecto fue específico para las drogas
TOP2, ya que la caída de ZNF451 no afectó la sensibilidad a la camptotecina, al
metanosulfonato de metilo o a la Zeocina (Fig.S4D). La deleción de TDP2 aumentó aún
más la sensibilidad al etopósido en ΔZNF451, pero en menor grado que en las células
de tipo silvestre, sugiriendo funciones colaborativas y únicas de estas proteínas en la
respuesta al daño de la TOP2.
La precipitación del homólogo de ZNF451 murino (ZFP451) también disminuyó
la supervivencia celular después del tratamiento con etopósido, tanto en MEF de tipo
silvestre como en los transformados con Tdp2 -/- (Fig. 2D y Fig. S4E). Aunque el
agotamiento de ZFP451 por sí solo no confirió un defecto significativo en la resolución
de los focos de γH2AX, causó un retraso en la cinética de reparación cuando se
combinó con la deleción de Tdp2 (Tdp2 -/-) o la inhibición del proteasoma (Fig. 2E). En
línea con los resultados de interacción proteína-proteína, ZFP451 y TDP2 parecen
actuar en la misma vía de reparación de TOP2cc independiente del proteasoma, ya que
la depleción de ZFP451 en células Tdp2 -/- no perjudicó más allá la resolución de focos
γH2AX inducidos por etopósido en células tratadas con MG132. Estos efectos no
fueron el resultado del deterioro global de la reparación de DSB por la inhibición del
proteasoma, ya que MG132 no causó defectos importantes en la resolución de focos
de γH2AX después del tratamiento con radiación ionizante (Fig. S4F). En general,
nuestros resultados identifican a ZNF451 como un componente en la respuesta celular
al daño inducido por TOP2 que opera a través de mecanismos tanto dependientes
como independientes de TDP2.
ZNF451 es una ligasa de SUMO2 E3/E4 (24, 25), por lo que examinamos TOP2
SUMOilación in vitro usando reacciones que contienen SUMO E1 (Sae2/Aos2), E2
(Ubc9), SUMO2 y ZNF451 de longitud completa. ZNF451 exhibió importante auto-
SUMOilación y catalizó poli-SUMOilación de TOP2α recombinante (Fig. 3A, carriles 4 a
8). ZNF451 mostró además una preferencia marcada por SUMOilar a TOP2cc más que
a TOP2 (Fig. 3B, y Fig. S5, A a C), lo que sugiere que TOP2cc es un objetivo preferido y
específico para la actividad de la ligasa de ZNF451 SUMO2. En células HEK293F, los
niveles de estado estable de TOP2α (Fig. 3, C y D) y TOP2β (Fig. S5, D y E) la
SUMOilación con SUMO2 fueron en gran medida dependientes de ZNF451 (Fig. 3C,
carriles 7 y 8), como fue la estimulación inducida por etopósido de la SUMOilación
TOP2 (Fig. 3C, carriles 9 y 10). Curiosamente, la SUMOilación de TOP2 dependiente de
ZNF451 también se desencadenó mediante el tratamiento con ICRF-193, una droga
que induce el pinzamiento de TOP2 en el ADN (Fig. 3C, carriles 11 y 12). Estos
resultados indican que ZNF451 regula la SUMOlación de TOP2 después del tratamiento
con drogas que alteran el ciclo de reacción de TOP2 a través de distintos mecanismos.
La SUMOlación de TOP2 por ZNF451 también aumentó la eficiencia de la
hidrólisis de ZNF451-TDP2 TOP2cc en un ~75% adicional (Fig. S5F). Por lo tanto,
probamos el papel de la SUMOlación en la eliminación catalizada por TDP2 del TOP2cc
con un ensayo ICE (complejos in vivo de la enzima) que monitorea la eliminación de
enlaces cruzados TOP2β y TOP2β ADN-proteína modificados por SUMO2 de la
cromatina (11) (Fig. 3E, Texto suplementario, Fig. S6). Después de la intoxicación TOP2
y la eliminación de etopósido, la renovación de la fracción TOP2β modificada con
SUMO2 se retrasó específicamente en las células Tdp2 -/-, pero únicamente cuando
estaba inhibido el proteasoma (Figs. 3E y S6E). El tratamiento in vitro de TOP2cc a
partir de muestras de ICE con TDP2 recombinante de tipo salvaje también mostró una
eliminación mejorada de la fracción TOP2βcc SUMOlada con relación al TOP2β total
(Fig. S6F), consistente con un modelo donde la SUMOlación del TOP2cc promueve la
resolución directa de TOP2cc catalizada por TDP2.
La SUMOlación mejora las asociaciones proteína-proteína en la respuesta al
daño del ADN (26, 27), y TDP2 se une a SUMO2 (pero no a SUMO1) (28). Por lo tanto,
el marcado covalente de TOP2cc con SUMO2 puede reclutar TDP2 a TOP2cc
envenenado. La proteína de unión a maltosa (MBP) mapea la región de unión de TDP2
a SUMO2 al dominio catalítico (aminoácidos 108 a 362, TDP2cat) (Fig. S7A), que carece
de un patrón de interacción SUMO canónico (SIM) (28). Para definir la base molecular
de esta interacción SUMO no canónica cristalizamos y determinamos las estructuras de
rayos X del TDP2cat de ratón como complejos mTDP2cat-SUMO2 binario y mTDP2cat-
SUMO2-DNA ternarios (Fig. 4A, Fig. S7B y Tabla S4).
 SUMO2 se une distalmente al centro catalítico de TDP2 a través de cinco
elementos de unión de SUMO, SB1-SB5 (Fig. 4, A y B). Confirmamos que esta
arquitectura general de mTDP2cat-SUMO2 es consistente con la de la solución que usa
dispersión de rayos X de ángulo pequeño (Figs. S7, C a H). El núcleo de la interfaz
SUMO2-TDP2 está compuesto por una estructura "SIM dividida", distinta de las
interfaces SUMO-SIM bien caracterizadas. En una configuración triangular, dos
cadenas β (β0 de SB1, y C-terminal β14 de SB5) se aplican a la lámina de SUMO2 β
(Fig. 4B]. Una característica prominente de esta interfaz es la inserción del TDP2 C-
terminal Leu370 en una bolsa hidrofóbica de SUMO2, donde el carboxilato terminal de
Leu370 forma un puente de sal con SUMO2 Lys42 (Fig. 4, B y C). Los bucles SB2, SB3 y
SB4 aumentan este núcleo de SIM dividida, que comprende una interfaz (~ 800 Å2)
que es más grande que las interfaces SUMO-SIM típicas (500-600 Å2) (Figs. S7, I y J). En
consecuencia, la constante de disociación (Kd) para la interacción TDP2-SUMO2 (Fig.
S7, K y L) es 880 nM, colocando a TDP2 entre las proteínas de unión a SUMO más
fuertes (28).
Para probar las funciones de la interacción TDP2-SUMO2 mutamos β0 para
codificar las sustituciones de prolina (TDP2PQ), y/o extendimos el C-terminal Leu370
enterrado por dos residuos (TDP2C-AE) para crear bloques estéricos para la
participación de SUMO2 (Figs. 4C y S7M). En células HEK293, los mutantes dobles YFP-
TDP2 C-AE, PQ o C-AE/PQ no se co-localizan con SUMO2 (Fig. S8A). In vitro, TDP2C-AE
bloqueó la unión de SUMO2 en la cromatografía de exclusión por tamaño y, cuando se
controló mediante RMN, no perjudicó la actividad de la fosfotirosilasa TDP2 (Figs. S8, B
a E). La asociación de YFP-TDP2 con SUMO2-TOP2 se vio afectada por la mutación de la
unión SUMO de C-AE, por la inactivación de ZNF451, o por una combinación de estos
defectos, demostrando que la interfaz TDP2-SUMO2 es importante para la
incorporación de TOP2 SUMOlada (Fig. 4D).
En comparación con los fenotipos fuertes observados con el agotamiento de
ZNF451 y TDP2 (Fig. 2, C y D), encontramos que TDP2C-AE sobreexpresada
complementa a MEFs Tdp2 -/- en la supervivencia clonogénica y los ensayos de
reparación de γH2AX después del tratamiento con etopósido (Fig. S8, F y G).
Deducimos que la SUMOlación de TOP2 por ZNF451 puede así actuar de manera
secundaria a su mejora de la actividad de TOP2cc hidrolasa, con la SUMOlación
actuando para dirigir a TDP2 a complejos estancados de escisión. Así, examinamos la
cinética del reclutamiento de TDP2 para el daño del ADN por TOP2 generado por la
microirradiación UV (10, 29, 30). YFP-TDP2 se acumula dentro de los 150 s después del
tratamiento con UV (Fig. S8H), y tanto la inactivación de ZNF451 como la mutación C-
AE dificultan la movilización de TDP2 al ADN dañado (Figs. 4E y S8I). La mutación
TDP2C-AE también se retrasó, pero no impidió la eliminación de la fracción SUMOilada
de TOP2 del TOP2cc purificado con ICE (Fig. S8J). En conjunto, estos resultados indican
que la interacción de TDP2 con TOP2cc se ve reforzada por las interacciones entre
TDP2 y SUMO2, y depende de ZNF451 SUMO2 ligasa. Además, TDP2 se une
directamente a TOP2 y ZNF451 in vitro (Figs. S3A y S7A), por lo que este conjunto de
interacciones con SUMO2, TOP2 y ZNF451 probablemente facilita el reclutamiento de
TDP2 a SUMO2-TOP2cc en las células.
La vía de resolución directa del TOP2cc modulada por ZNF451-TDP2 (Fig. S9)
puede contribuir a la adaptación del tumor durante la quimioterapia con venenos de
TOP2, y por lo tanto constituye un nuevo objetivo potencial para la intervención
quimioterapéutica. Además de las funciones relacionadas con TDP2, ZNF451 muestra
efectos independientes de TDP2 en la respuesta celular al envenenamiento de TOP2
que requerirá futuras investigaciones. Será importante en futuros trabajos dilucidar la
mecánica de la influencia de ZNF451-TDP2 sobre TOP2 y su potencial para modular la
regulación de TOP2 de la dinámica del genoma y la transcripción (4, 12, 31, 32). Dada
la asociación de ZNF451 con la reparación de TOP2 mediada por TDP2, proponemos
cambiarle el nombre a ZATT (Zinc finger protein Associated with TDP2 and TOP2) para
reflejar adecuadamente estas funciones celulares.

Leyendas de Figuras

Fig. 1: TDP2 se une a TOP2 SUMOlada y a ZNF451. (A) Se desconocen los mecanismos
celulares que regulan la hidrólisis del enlace fosfotirosilo catalizado por TDP2 en
TOP2cc envenenado. (B) Inmunotransferencia de lisados celulares solubles e IP de
células que expresan YFP, YFP-TDP2 o YFP-TDP2H351N (H-N). (C) Resolución de focos
de γH2AX en MEF después de exposición a etopósido (20 μM). Promedio ± s.e.m .; n =
3; ** p <0.01, *** p <0.001 (ANOVA de dos vías con post-test de Bonferroni). (D) SDS-
PAGE teñida con plata de proteínas modificadas con SUMO2 asociadas a YFP-TDP2 (Y-
T) aisladas como en la fig. S2A. (E) Inmunotransferencia de ZNF451 (panel superior) en
extractos de células completas (WCE) o fracción de cromatina. Cuantificación (derecha)
de los niveles de ZNF451 en la cromatina. Promedio ± s.e.m .; N = 3; * p <0.05 (ANOVA
de dos vías con postest de Bonferroni).

Fig. 2. ZNF451 promueve la hidrólisis del enlace fosfotirosilo por TDP2. (A) Síntesis y
purificación de TOP2cc estancado. (B) La hidrólisis TOP2βcc (0,2 nM) por TDP2 se
potencia por ZNF451. Gel representativo de 3 experimentos. (C) Proliferación celular
de células knock-out HEK293F o CRISPR medida por área bajo la curva (AUC) de
confluencia celular después de 6 días de crecimiento con etopósido. Promedio ± s.d., N
= 4. (D) La supervivencia clonogénica de las células MEF en las concentraciones
indicadas de etopósido. nt = no objetivo. Promedio ± s.e.m .; N ≥ 4; * p ≤ 0.05 (prueba
F, log valores de regresión cuadrática). (E) Resolución de DSB marcados por focos
γH2AX en células MEF después de la exposición al etopósido en presencia o ausencia
de MG132. Promedio ± s.e.m .; N = 3; ns p ≥ 0.05, * p <0.05, ** p <0.01 (ANOVA
bidireccional con post-test de Bonferroni).

Fig. 3. ZNF451 preferentemente SUMOla TOP2cc y mejora la actividad de TDP2. (A) El

TOP2α recombinante se incubó con SUMO E1, E2 y concentraciones crecientes de
SUMO2 en presencia o ausencia de ZNF451. (B) Las reacciones con TOP2αcc 2 nM
(marcador DNA-Cy5) y TOP2α libre 75 nM se incubaron con E1, E2, SUMO2, y la
concentración indicada de ZNF451, luego se separaron mediante SDS-PAGE. TOP2cc
SUMOylation se controla mediante el escaneo de la etiqueta Cy5, mientras que la
sumoilación TOP2β libre se controla mediante transferencia de Western. (C)
Inmunoblot de lisados y muestras purificadas con Ni-NTA de células que expresan His6-
SUMO2 pretratadas con los fármacos indicados durante 20 min. (D) Cuantificación de
la señal SUMO2-TOP2α de los carriles 7-12 en (C). N = 3; Promedio ± s.d .; * = p <0.05,
** = p <0.001 (prueba t de 2 colas). (E) Imagen representativa (arriba) y cuantificación
(parte inferior) de TOP2β o SUMO2 unidos covalentemente al ADN genómico en MEF
después de 1 hora de tratamiento con etopósido y recuperación en presencia o
ausencia de 20 μM de MG132. Promedio ± s.e.m .; N ≥ 7; * p <0.05 (ANOVA de dos vías
con post-test de Bonferroni).

Fig. 4. La estructura de SUMO2-mTDP2cat revela la base molecular para el

reclutamiento de TDP2 por SUMOilación. (A) Estructura del complejo DNA / mTDP2 cat /
SUMO2. SUMO2 se une al dominio catalítico TDP2 con un SIM dividido (rojo) y tres
bucles (turquesa) distal del sitio de unión al ADN. (B) Un "β-triángulo" está formado
por las cadenas β0 y β14 de mTDP2cat y β2 de SUMO2. (C) El C-terminal de TDP2 encaja
en un bolsillo en SUMO2. (D) Inmunoblotting de IPs de células que coexpresan YFP,
YFP-TDP2 o YFP-TDP2 C-AE con shRNA. (E) Las células HEK293F que expresan YFP-TDP2
(mutante wt o C-AE) y un control de shRNA sin objetivo (nt) o dirigido a ZNF451 se
microirradian con un láser UV entre las 2 flechas blancas en t = 0. Barra de escala, 10
μm .