PCR Y RT PCR

PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común
utilizada para hacer muchas copias (millones o miles de millones) de una región
particular de ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que le interese al
experimentador. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función quiere entender un
investigador o un marcador genético usado por científicos forenses para relacionar el
ADN de la escena del crimen con los sospechosos.

Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco

para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN
amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en
gel o clonar en un plásmido para otros experimentos.

La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación

en biología molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.

La Taq polimerasa
Al igual que la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una enzima
ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas
existentes como molde. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se
llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló
(Thermus aquaticus).

T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es

muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70°C(temperatura a la
que la ADN polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq polimerasa
es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos, la PCR utiliza
altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus
cadenas.

Cebadores para PCR

Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si hay
un cebador, una corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de partida
para la síntesis de ADN. En una reacción de PCR, la región de ADN que será copiada, o
amplificada, se determina por los cebadores que el o la investigadora elija.

Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla, generalmente
de unos 202020 nucleótidos de longitud. En cada reacción de PCR se utilizan dos
cebadores que están diseñados para flanquear la región blanca (la región que debe ser
copiada). Es decir, les agregan secuencias que harán que se unan a cadenas opuestas del
molde de ADN solo en los extremos de la región a copiar. Los cebadores se unen al
molde mediante complementariedad de bases.
 Los pasos de la PCR
Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores, ADN
molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los ingredientes se colocan en un
tubo, junto con los cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de
calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del ADN.
Los pasos básicos son:

1. Desnaturalización: (96°C): la reacción se calienta bastante para separar, o

desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla
para el siguiente paso.
2. Templado: (55 - 65°C): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a sus
secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
3. Extensión: (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa
extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN

Este ciclo se repite 25 - 35 veces en una reacción de PCR típica, que generalmente
tarda 2 - 4 horas, según la longitud de la región de ADN que se copia. Si la reacción es
eficiente (funciona bien), puede producir miles de millones de copias a partir de una o
unas cuantas copias de la región blanco.
Eso es porque no solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo. En realidad, el
nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente
ronda de síntesis de ADN. Hay muchas copias de los cebadores y muchas moléculas
de Taq polimerasa flotando en la reacción, por lo que el número de moléculas de ADN
casi puede duplicarse en cada ciclo. La siguiente imagen muestra este patrón de
crecimiento exponencial.

Detección por PCR de Escherichia coli O157: H7 directamente a partir de heces:

evaluación de métodos de extracción comercial para purificar ADN fecal
La PCR se ha convertido en una herramienta muy rápida y confiable para el diagnóstico
basado en la biología molecular de una variedad de enfermedades infecciosas. La PCR se
ha aplicado para la detección de microorganismos de cultivos y tejidos microbianos y
directamente de muestras clínicas. Las muestras de heces se encuentran entre las muestras
más complejas para la prueba de PCR directa debido a la presencia de inhibidores de la
PCR inherentes que a menudo se extraen conjuntamente con el ADN bacteriano. Los
posibles inhibidores de la PCR que se encuentran en las muestras de heces incluyen
hemo, bilirrubinas, sales biliares y carbohidratos complejos Pocos estudios han evaluado
o comparado métodos simples de extracción de ADN que facilitarían y mejorarían la
sensibilidad de la detección por PCR de patógenos entéricos de muestras fecales.
Material y método
Cepas bacterianas y muestras clínicas de heces
La cepa CL8, una cepa de E. coli O157: H7 bien caracterizada, se usó para los
experimentos de siembra y como control positivo para PCR. Se recogieron muestras de
heces que cultivaron colonias de E. coli que no fermentaban con sorbitol en SMAC y que
se sospechaba que eran positivas para E. coli O157: H7 de muestras de pacientes
sometidas a tratamiento para gastroenteritis. Se excluyeron muestras duplicadas del
mismo paciente en el mismo día. Cada muestra de heces se mezcló suavemente, se
alicuotó en volúmenes de 500 μl y se almacenó a -70 ° C antes de la prueba.
Prueba de sensibilidad
El taburete sembrado se centrifugó a 16,000g durante 5 min, y el sobrenadante se
eliminó. El crecimiento de las colonias que no fermentan con sorbitol y sorbitol se
cuantificó como, 1+, 2+ o 3+, dependiendo del grado de crecimiento por cuadrante Se
recogieron varias colonias aisladas que no fermentaban con sorbitol y se subcultivaron en
placas de agar con sangre de oveja al 5% para una incubación durante la noche a
37C.Organismos que fueron identificados como E. colicon la tarjeta Vitek GNI luego se
probaron con antisueros O157 y H7 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los
kits comerciales incluyeron el kit de extracción de ácidos nucleicos IsoQuick , el kit
NucliSens y el mini kit QIAamp DNA .

La posterior amplificación por PCR con las plantillas de ADN se realizó a ciegas para
minimizar el sesgo a partir de los resultados del cultivo. Se inoculó una muestra de heces
en 2 ml de caldo de soja tríptico y se incubó mediante agitación a 250 rpm y 37C durante
4 h. Se centrifugó una muestra de heces a 16,000 xgdurante 5 minutos, y se separó el
sobrenadante. La muestra se lisó durante 20 minutos, seguido de separación de ADN y
precipitación con alcohol.
Se añadió una muestra de heces a 900 μl de tampón de lisis y los componentes se
mezclaron mediante agitación vorticial. La muestra se dejó lisar durante 1,5 h, con la
inversión del tubo de microcentrífuga cada 0,5 h, y se centrifugó a 300 g durante 1 min
para separar el material sin lisar y grueso del resto de la muestra. Luego se añadió sílice
libre a la muestra, y el ADN unido se lavó. Se lisó una muestra de heces con tampón ATL
y proteinasa K durante 2 ha 55C y luego con tampón AL durante 10 minutos a 70C. La
mezcla de muestra se pasó luego a través de la columna del kit QIAamp, seguido de dos
lavados con tampones AW1 y AW2 .

Amplificación por PCR

Las secuencias de los cebadores utilizados para la PCR se muestran en la Tabla Tabla1.1
. Los cebadores VT1 amplifican el ADN de las cepas de E. coli productoras de VT1 ,
mientras que los cebadores VT2 amplifican el ADN de las cepas de E. coli productoras
de la variante VT2 y VT2 . Los cebadores eaeA específicos de serotipo O157 se basan en
el extremo 3 'único de la secuencia del gen eaeA de E. coli O157 . Se realizaron PCR
multiplexadas en un volumen de reacción final de 25 μl, que fue el siguiente: cebadores
VT1, VT2 y eaeA a concentraciones de 0,2, 0,2 y 0,8 μM, respectivamente; cada
desoxinucleósido trifosfato a una concentración de 200 μM; Tampón de PCR 1x ; 1,5
mM de MgCl 2 ; 2,5 U de polimerasa Taq ; y 1 μl de plantilla de ADN. Los amplicones
de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio y se
visualizaron bajo iluminación UV.
Estudios de inhibición.
Las muestras positivas para E. coli O157: H7 y negativas para PCR se analizaron para
inhibidores de PCR derivados de heces mediante un ensayo de PCR que amplificó una
secuencia de gen de ARN bacteriano 16S conservado . Plantillas de ADN que produjeron
un producto del gen 16S rDNA positivo fuerte pero que fueron PCR multiplex negativas
para E. coliSe supuso que O157: H7 era negativo por razones distintas a la inhibición y
no se probó más. Plantillas de ADN que produjeron negativos PCRs de 16S rDNA se
diluyeron 1:10 con H destilada estéril 2 O, y PCRs para E. coli O157: H7 y 16S rDNA se
repitieron.
Inhibición de la PCR por flora entérica normal.
Para ver si el crecimiento excesivo de la flora entérica interfirió con el rendimiento del
ADN amplificable de E. coli O157: H7, se determinó la sensibilidad de cada método para
las muestras agrupadas por el crecimiento relativo de las colonias fermentadoras de
sorbitol en comparación con las fermentaciones sin sorbitol colonias como sigue:
crecimiento de colonias fermentadoras de sorbitol> crecimiento de colonias que no
fermentan sorbitol, crecimiento de colonias fermentadoras de sorbitol
Resultado:
Especímenes clínicos

La detección de genes solo de verotoxina podría indicar la presencia de otros serotipos de

E. coli productores de verotoxina, que de otro modo no serían detectados por cultivo
convencional. La misma combinación de genes amplificados se mostró cuando dos o más
métodos de extracción de ADN produjeron un resultado positivo de PCR múltiplex.De
las muestras con cultivo positivo, 67 muestras fueron positivas para PCR y 6 negativas
para PCR por los cuatro métodos de extracción de ADN. De los restantes 34 muestras
positivas para el cultivo, no todos los métodos de extracción arrojaron resultados de PCR
positivos para los mismos especímenes.

De las 10 muestras de heces positivas para cultivo, teñidas con sangre, 7 fueron PCR
positivas por los cuatro métodos sin la necesidad de diluir la plantilla de ADN. Para una
muestra de heces teñida con sangre con crecimiento 3+ de colonias que no fermentan
sorbitol y crecimiento de colonias fermentadoras de sorbitol, los kits IsoQuick y QIAamp
pudieron detectar los tres genes, los genes VT1, VT2 y eaeA . Hemos encontrado que, en
general, el ensayo de PCR múltiple descrito aquí produjo bandas más intensas para el gen
VT2, seguidas por bandas respectivamente menos intensas para el gen VT1 y el gen
eaeA . Para cada uno de los métodos de extracción de ADN, se obtuvieron las más altas
sensibilidades cuando las colonias no sorbitol-fermentación estaban presentes en cultivo
puro Tabla La dilución del ADN molde no fue necesaria para el kit
QIAamp,independientemente del crecimiento relativo de las colonias fermentadoras de
sorbitol y las que no fermentan el sorbitol.

El método de enriquecimiento interno tardó más en completarse debido al paso de

crecimiento de enriquecimiento, pero tuvo el tiempo más corto de práctica y el costo
asociado más bajo.

DISCUSIÓN

En este estudio, varios métodos comerciales y un método interno se evaluaron

sistemáticamente por su rendimiento de ADN amplificable. El kit IsoQuick utiliza las
propiedades caotrópicas del tiocianato de guanidina para la lisis celular y para la
inactivación de las nucleasas celulares. Luego, el ADN se extrae con un reactivo
patentado, no corrosivo y precipitación con alcohol. El kit QIAamp utiliza lisis de
proteinasa K seguida de un aislamiento de ADN basado en columna de sílice. El kit
NucliSens utiliza lisis de tiocianato de guanidina-Triton X-100 seguido de aislamiento de
ADN libre de sílice. El método de enriquecimiento interno incluye un enriquecimiento de
heces con caldo de soja tríptico de 4 h, seguido de lisis térmica con tampón de lisis Triton
X-100.
La falta de uniformidad de las muestras de heces en términos de materia física,
organismos diana y flora fecal de fondo asociada hace que la extracción de ADN de las
muestras fecales sea altamente variable de muestra a muestra en términos de rendimiento
y pureza del ADN . Los resultados de PCR falsos negativos pueden deberse a la presencia
de un pequeño número de organismos diana en el volumen de heces muestreadas y a la
disminución de la estabilidad de las células con almacenamiento En este estudio, se
realizaron esfuerzos para mezclar a fondo cada alícuota de las heces para cada método de
extracción de ADN. En nuestro estudio, la incorporación de un tampón de lavado
adicional según lo recomendado por Qiagen podría haber ayudado a la eliminación de
inhibidores. Otros estudios también han observado que la detección directa por PCR de
organismos a partir de muestras fecales requiere una mayor dilución de la plantilla
original de ADN .
La mejora del límite de detección por cada uno de estos métodos aún podría mejorarse
mediante una serie de otras variables. Las sensibilidades de PCR pueden haberse
mejorado para los kits comerciales si el enriquecimiento en caldo para E. coli O157: H7
en heces se realizó antes de la extracción de ADN. La incorporación de agentes selectivos
e inhibidores para E. coli O157: H7 y otra flora fecal, respectivamente, podría aumentar
aún más el rendimiento del ADN diana deseado tras la extracción. Los estudios también
han demostrado que el enriquecimiento selectivo por cultivo del microorganismo diana,
con o sin separación inmunomagnética, aumenta el rendimiento global de ADN deseable
y, en consecuencia, mejora la recuperación mediante PCR Otra consideración es la
adición de ácido nucleico transportador, como ARNt de levadura, durante el proceso de
extracción para aumentar la recuperación de pequeñas cantidades de ADN . Otros
estudios han demostrado que el límite de detección de productos de PCR amplificados
mejoraba de 10 a 100 veces cuando se usaba hibridación de transferencia Southern con
sondas marcadas en comparación con el límite de detección mediante visualización de
productos amplificados mediante tinción con bromuro de etidio de geles de agarosa . En
otro estudio, Shetab et al. utilizaron un método de extracción de fenol-cloroformo seguido
de PCR y detectaron 10 2 a 10 3 Bacteroides fragiliscélulas / g de heces, utilizando un
volumen de plantilla de ADN de 10 μl en lugar de 1 μl. La eficacia de la PCR del ADNr
16S fue mayor que la de la PCR de E. coli O157: H7 debido al objetivo de ADNr
expansivo proporcionado por la microflora de fondo coextraída. Como resultado, la
inhibición podría haber interferido con la amplificación de los genes VT1, VT2 y eaeA ,
pero aún permitía una amplificación de rDNA 16S exitosa.
No se hicieron intentos para determinar qué componentes inhibidores específicos en las
muestras de heces contribuyeron a las PCR falsas negativas en general. Para varias
muestras, la dilución de la plantilla de ADN final todavía era necesaria para reducir los
efectos de los inhibidores inherentes. Es importante continuar el trabajo sobre la
identificación de estas sustancias inhibitorias y el desarrollo de métodos para su
eliminación. También se necesita más trabajo para optimizar el proceso de extracción
para aumentar el rendimiento del ADN bacteriano deseado y para reducir la presencia de
ADN competidor a partir de la microflora coexistente.
Otras consideraciones para elegir un método de procesamiento fecal para PCR incluyen
la facilidad de uso, el costo y el tiempo hasta la finalización. Como se muestra en la Tabla
Tabla 5,5 , el método de enriquecimiento de la casa podría realizarse fácil y
económicamente con práctica en un mínimo de tiempo, aunque la etapa de caldo de
enriquecimiento 4-h aumentó el tiempo total para la terminación.