Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Transferencias Soutehen y Northen

Southern blot

Hace referencia a un método sensible de detección de uno o más fragmentos específicos

de DNA dentro de una mezcla de fragmentos de DNA compleja y aleatoria.
El procedimiento recibió su nombre en honor a E. M. Soutern, quien desarrolló este método
en 1975. (1)

1. Extracción del ADN

Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la
escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del
folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios"
biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas
conocidas, habitualmente de la sangre.

2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción

El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una
enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia característica. La
enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en
la secuencia 5'-GGCC-3'.

3. Electroforesis en gel de agarosa

Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño
mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de
ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las
moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa.
Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de
mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de
ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la
mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")

Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras

permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la
neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una
membrana de nailon, realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés
blot, conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y
transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó,
Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda
transfiere una réplica de la imagen del papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la
membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida
en el gel como resultado de la electroforesis.

5. Hibridación con sonda radioactiva

Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es
decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de
restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria
(dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de
la sonda y del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus único se marcan
habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que
detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de
Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda
radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que
favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de sonda no unido, de
modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al
ADN del locus diana.

6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía

Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de

Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se
coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la
luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su
exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se
conoce como autorradiografía