GUÍA DE TALLER N°6

“Métodos de tinción para muestras microbiológicas”.

ASIGNATURA:

Técnicas de laboratorio (PCS 4101)

DIRIGIDO A:

Alumnos de Técnico Nivel Superior de Laboratorio Clínico y Banco de Sangre

REQUISITOS:

Sin requisitos.

Docente: Valentina Jara Rosas

INTRODUCCIÓN

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con
el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio
que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas,
cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Competencias Asociadas a la Asignatura

 Aplicar técnicas específicas de apoyo en el análisis clínico de un examen de

laboratorio, de acuerdo a los protocolos descritos por el servicio de salud

Unidades de Competencias Asociadas a la Asignatura

 Realiza técnicas de apoyo microbiológicas, hematológicas y bioquímicas según los

protocolos del servicio de salud.

MARCO DE REFERENCIA TEÓRICO

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación.
Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con
sustancias químicas como Formaldehído, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se
añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La
fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos,
tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de
tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el
contrario, hace que las células aparezcan mayores de lo que son realmente, de manera
que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con
mucha precisión.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares, muchos de ellos son moléculas cargadas
positivamente (cationes). Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el
cristal violeta y la safranina.
Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se
combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la
localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es
el negro Sudán.
Tinciones simples

Docente: Valentina Jara Rosas

Estas tinciones se basan en la acción de un solo colorante sobre la célula bacteriana, en tal
forma que todas ellas presentarán el mismo color. Por este motivo, se emplean
fundamentalmente para observar la forma y la agrupación de las bacterias.

Tinciones diferenciales

Estas tinciones permiten efectuar una agrupación de las bacterias de acuerdo a su diferente
afinidad por los colorantes que se utilizan en ellas. Así, bacterias que quedan teñidas de
diferente color pertenecen a grupos también diferentes. La importancia de estas tinciones,
especialmente la de Gram, es que existe cierta correlación entre la afinidad tintorial de la
bacteria y otras propiedades, como por ejemplo la susceptibilidad o resistencia a
determinados agentes antimicrobianos, basada en diferencias estructurales principalmente
a nivel de la pared bacteriana.

Tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio

bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de
Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM.

Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-

negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-
positivas contienen menos aminoácidos que la gram-negativa; el contenido graso es mucho
más elevado en la gram-negativa que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto
como explicación del mecanismo de la reacción al gram (ver las dos imágenes juntas).

Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano Tiene una capa delgada de peptidoglicano
(mureina) (mureina)

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram:

Docente: Valentina Jara Rosas

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí
solo tiene poca afinidad con las células.
2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las
células grampositivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo
preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos más viejos de 24 horas puede perder su habilidad de retener el complejo cristal
violeta-yodo.

Tinción de Ziehl-Neelsen (Modificación de Kinyou)

Esta tinción, al igual que la de Gram, emplea dos colorantes: La fucsina y el azul de metileno
(o amarillo victoria), con una decoloración intermedia basado en el uso de un decolorante
enérgico (alcohol ácido). Las bacterias capaces de resistir esta decoloración y que, por lo
tanto, se observan de color rojo intenso se denominan alcohol ácido resistente (AAR).

La importancia de esta tinción radica en que algunas bacterias alcohol ácido resistentes
son el agente causal de importantes enfermedades (tuberculosis, lepra).

Bibliografía
 Procedimientos y técnicas de laboratorio .volumen I. Microbiología especial. ISP.
 Manual de laboratorio de microbiología. U. de chile. Sede La Serena.

Taller N°7

Nombre del Taller Tinciones microbiológicas

Requisitos para Realizar lectura de guía de taller
Taller Uso de uniforme de laboratorio
Presentación personal acorde a normativas de taller
Tiempo 2 módulos
N° estudiantes Máximo 10 alumnos
Procedimentales Actitudinales Conceptuales
Realizar distintos Actuar de acuerdo Reconocer
tipos de tinción a los principios de fundamentos de
microbiológica. respeto y dignidad tinción.
del paciente.

Cumplir con las

indicaciones dadas
Objetivos del Taller
por el profesional a
cargo.

Respetar la
normativa vigente
y/o los protocolos
para ejecutar
acciones.

Docente: Valentina Jara Rosas

Escenario: El taller se realiza en laboratorio
de ciencias básicas
Escenario 1: Realización de frotis
Se le proporcionará al estudiante una
muestra para que realice el frotis previo a la
tinción.
Actividad
Estudiantes deberán trabajar en parejas.
Docente distribuirá muestras por parejas,
donde deben realizar la técnica.

Procedimiento para preparar el frotis:

Situación:
La dificultad se presentará en cómo el Delgada capa de bacterias distribuidas en
estudiante realizará el frotis para la tinción. la superficie de un portaobjetos y fijado a
él para que resista las diferentes etapas
de la tinción (adición de colorantes,
lavados, etc.).

1.- Colocar una gota de cultivo líquido en

un portaobjetos limpio o una gota de
emulsión si se tiene un cultivo en medio
sólido.

2.- Extender este material

cuidadosamente en una capa delgada.

3.- Dejar secar a temperatura ambiente o

calentando suavemente a la llama del
mechero. Evite sobrecalentamiento.

4.- Fijar la preparación pasando

rápidamente la cara del portaobjeto que
lleva las bacterias dos o tres veces por la
llama del mechero, evitando
carbonizarlas por sobrecalentamiento.

5.- El frotis queda entonces listo para ser

teñido con la coloración deseada.

El docente orientará que se proceda de

manera correcta.

El docente al final realizará una

Escenario 2: Tinción de Gram
retroalimentación para verificar que todos
manejen la misma información y que
cada estudiante haya realizado toda la
actividad.
Estudiantes deberán trabajar en parejas.

Docente: Valentina Jara Rosas

Se le proporcionará al estudiante una Docente distribuirá muestras por parejas,
muestra para que realice la tinción. donde deben realizar la técnica.
Situación:
Frotis proporcionado para realizar la tinción.
Escenario 3: Tinción de Ziehl Neelsen
Docente: Valentina Jara Rosas
Procedimiento:
 Utilice un frotis para cada colonia
diferente.
 Colorear con violeta de genciana,
o cristal violeta, al 1% durante 60
segundos, cuidando que el
colorante cubra toda la
preparación.
 Eliminar el exceso de colorantes y
lavar rápidamente con agua,
manteniendo el portaobjetos en
posición inclinada.
 Cubrir la preparación con la
solución de Gram o Lugol,
dejándola actuar durante 60
segundos. Lavar nuevamente
con agua.
 Decolorar con alcohol acetona
durante 30 segundos y lavar con
agua (etapa diferencial).
Importante respetar el tiempo.
 Coloración de fondo o de
contraste con safranina durante
20 segundos.
 Lavar con agua, secar y observar
por inmersión.
 La fase de decoloración con
alcohol constituye la etapa más
importante de la tinción de Gram y
en ella reside su carácter
diferencial.
Nota: Si se dispone de tiempo, el docente
le podrá mostrar en el microscopio la
calidad de su tinción.
El docente orientará que se proceda de
manera correcta.
El docente al final realizará una
retroalimentación para verificar que todos
manejen la misma información y que
cada estudiante haya realizado toda la
actividad.
Estudiantes deberán trabajar en parejas.
Se le proporcionará al estudiante una Docente distribuirá muestras por parejas,
muestra para que realice la tinción. donde deben realizar la técnica.

Situación:
Frotis proporcionado para realizar la tinción.
Procedimiento:
 Utilice un frotis para cada colonia
diferente.
 Cubrir la preparación con fuccina
fenicada.
 Enseguida calentar, pasando una
tórula impregnada con alcohol de
quemar y encendida por debajo del
portaobjeto hasta que se produzca
emisión de vapores (sin que hierva la
fuccina)
 Dejar enfriar y repetir el calentamiento
3 0 3 veces durante 5 minutos.
 Lavar con agua de la llave o pizeta
 Decolorara con alcohol clorhídrico,
lavar y volver a repetir este proceso
hasta que no escurra más colorante.
 Cubrir la preparación con verde de
malaquita o azul de metileno por unos
30 segundos
 Lavar y secar la preparación.

Nota: Si se dispone de tiempo, el docente

le podrá mostrar en el microscopio la
calidad de su tinción.

El docente orientará que se proceda de

manera correcta.

El docente al final realizará una

retroalimentación para verificar que todos
manejen la misma información y que
cada estudiante haya realizado toda la
actividad.
Recursos Rol del Docente
Guantes El docente debe dar las instrucciones del taller y distribuir las
Pecheras muestras a los estudiantes de manera previa.
Antiparras
Microscopios ópticos Los estudiantes trabajarán en parejas y analizarán las muestras
(uno por alumno) entregadas por el docente.
Xilol
Aceite de inmersión Todos los estudiantes deben realizar todos los escenarios.
Papel filtro
Papel tisúes El docente debe ir retroalimentando la conducta de los
Portaobjetos estudiantes en cada escenario durante todo el proceso,
Cubreobjetos

Docente: Valentina Jara Rosas

 Asas de punta verificando con preguntas a los otros grupos de las actividades
Pipetas Pasteur realizadas.
estériles y taponadas
Pinzas metálicas El docente debe realizar intervención inmediata en la corrección
Cultivos de y un feedback al finalizar la actividad.
microorganismos
(Cocáceas, bacilos
etc.)
Set de tinción de
Gram.
Muestras Fijadas con
BAAR. Positivos. (
solo para
demostración)
Azul de metileno set
de tinción de Ziehl-
Neelsen
baquetas de vidrio
algodón
alcohol 70%
sustancia simulada de
desgarro
Cultivo líquido
simulado
Mechero
Evaluación Pauta de cotejo
formativa

ANEXOS
Pauta evaluación para “Métodos de tinción para muestras microbiológicas”.

N° Actividad C MC NC
1.- Se lava las manos previo procesamiento de muestras
2.- Usa elementos de protección personal
3.- Aplica criterios de rechazo con las muestras
4.- Realiza frotis para tinción
5.- Realiza tinción microbiológica
6.- Elimina material usado según normativa de bioseguridad
7.- Se lava las manos al terminar
8.- Registra procedimiento

Docente: Valentina Jara Rosas