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BIOTECOLOGÍA
Grupo 602
TURNO VESPERTINO
FECHA:
Chilpancingo de los Bravo, GRO., 18 Junio del 2018.
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA EDUCATIVO DE BIOTECNOLOGÍA
EXTRACCIÒN Y PURIFICACIÒN DE PRODUCTOS BIOTECNOLÒGICOS
OBJETIVOS:
Aplicar la teoría de la extrusión de solido a líquidos para la obtención del
aceite a partir de la cascara de naranja.
Obtener a nivel de laboratorio el aceite esencial de naranja, haciendo uso
de proceso extracción.
FUNDAMENTO TEÓRICO:
NARANJA
La naranja dulce (Citrus sinensis) es una de las frutas más populares y saludables
del mundo. Tiene un alto contenido de vitamina C. Su sabor, especialmente de
algunas variedades es realmente soberbio por su acidez y dulzura. Como todas
las frutas cítricas contienen de un cuarenta a cincuenta por ciento de zumo, veinte
a cuarenta por cien de piel y un veinte a treinta por cien de pulpa y semillas.
Aproximadamente un 90 por ciento de su contenido es agua con un cinco por
ciento de azúcares. La naranja es el fruto obtenido del naranjo dulce (Citrus ×
sinensis), un antiguo árbol híbrido originario de India, Vietnam o el sureste de
China (Nicolosi et al., 2000).
AZUFAITA
Ziziphus jujuba, el azufaifo o jinjolero, entre otros nombres comunes, es una
especie de planta arbórea del género Ziziphus en la familia de las Rhamnaceae.
Su tamaño depende directamente de la humedad que haya tenido el arbusto de
porte arbóreo. Es una planta caducifolia que puede llegar a medir más de diez
metros de altura, aunque habitualmente alcanza unos dos metros y medio de
altura. El tronco es recto con bultos y corteza muy arrugada.
Posee hojas escasamente pecioladas, alternadas, coriáceas, de 2 a 7 cm de
longitud, de forma oblonga a oval-lanceolada con el margen finamente dentado y
el ápice agudo o redondeado. La hoja tiene tres nervios principales longitudinales
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y presenta dos estípulas espinosas en su base. Son color verde claro brillante con
el haz de color verde brillante.
La ramificación es muy densa, y está dotada de fuertes espinas, como resultado
de su adaptación natural para protegerse de los herbívoros. Presenta ramillas de
color verdoso, zigzagueantes y colgantes (Kirkbride, et al., 2006).
Flor
En el hemisferio norte florece entre abril y agosto. Las flores son pequeñas, poco
llamativas, pentámeras, verdosas y situadas en grupos de dos o tres a lo largo de
las ramas. Produce inflorescencias cimosas, de 2 a 5 sobre un pequeño
pedúnculo común a la axila de las hojas. Flores axilares de color amarillo verdoso
de 3 a 4 mm de diámetro (Flora of China Editorial Committee, 2007).
Fruto
El fruto es la azufaifa, azofeifa, o jínjol (jínjoles en plural) una drupa comestible con
aspecto de aceituna, de unos 2 o 3 cm de longitud, de forma elipsoidal o globosa,
con una sola semilla. La piel del fruto es inicialmente de color verde claro y toma
un color marrón rojizo cuando está maduro. Cuando está fresco, la pulpa es verde
claro a amarillento pálido, de textura harinosa —parecida a la de la manzana— y
dulzona. Existen variedades injertadas que producen frutos de 5 o 6 cm de
longitud.
Se recolectan a finales de verano o principios de otoño. Son ricos en azúcares y
mucílagos y con una importante cantidad de vitamina C por eso se han consumido
por su valor nutritivo como una fruta, natural o desecada (Flora of China Editorial
Committee, 2007).
Distribución geográfica
Es un árbol originario del sur y este de Asia (China) y es cultivada en otras partes
del mundo de clima tropical o templado, incluido España, por su fruto comestible.
El género Citrus es nativo del sureste de Asia y del archipiélago Indo-Malayo
(Avilán et al., 1989). La naranja dulce pertenece a la familia de las Rutáceas, una
familia muy amplia que contiene unas 1700 especies de plantas que crecen en
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Los aceites esenciales de cítricos son insolubles en agua, pero se hacen más
solubles cuando se emplean en bajas concentraciones usando alcohol como
disolvente.
Los aceites esenciales se caracterizan por sus propiedades físicas, como
densidad, viscosidad, índice de refracción y actividad óptica. La mayoría de los
aceites esenciales tienen una densidad menor a la del agua excepto los aceites de
almendras, mostaza canela entre otros. El índice de refracción es una propiedad
característica de cada aceite esencial y cambia cuando éste se diluye o mezcla
con otras sustancias (Ortuño, 2006).
Una técnica muy utilizada es la extracción por arrastre de vapor de agua se lleva a
cabo la vaporización selectiva del componente volátil de una mezcla formada por
éste y otros no volátiles. Se lleva a cabo por medio de la inyección de vapor de
agua directamente en el seno de la mezcla, denominándose vapor de arrastre, con
la finalidad de condensarse formando otra fase inmiscible que cederá su calor
latente a la mezcla a destilar para lograr su evaporación obteniendo la presencia
de dos fases inmiscibles a lo largo de la destilación (orgánica y acuosa), por lo
tanto cada líquido de ejercerá su propia presión de vapor y corresponderá a la del
líquido puro a una temperatura de referencia (Wankat, 1988).
ACEITES ESENCIALES
Los componentes volátiles provenientes de plantas, atrajeron la atención del
hombre desde la antigüedad como principios aromáticos. Los aceites esenciales
son sustancias odoríferas de naturaleza oleosa encontradas prácticamente en
todos los vegetales; son muy numerosas y están ampliamente distribuidos las
raíces, tallos, hojas, flores y frutos, estos aceites esenciales son componentes
heterogéneos de terpenos, sesquiterpenos, ácidos, esteres, fenoles, lactonas;
todos ellos fácilmente separables ya sean por métodos químicos o fiscos, como la
destilación, refrigeración, centrifugación, etc. En su gran mayoría son de olor
agradable, aunque existen algunos de olor relativamente desagradable como los
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componentes que forman parte de la fracción aromática del ajo y la cebolla, los
cuales contienen compuestos azufrados.
Los aceites pueden estar asociados formando mezclas con otros productos
naturales como es el caso de las resinas y productos relacionados. Los aceites
esenciales se utilizan para dar sabor y aroma al café, el té, los vinos y las bebidas
alcohólicas. Son los integrantes básicos en la industria de los perfumes y se
utilizan en jabones, desinfectantes y productos similares. También importancia en
medicina, tanto por su sabor como por su efecto calmante del dolor y su valor
fisiológico.
CLOROFILA DE LAS PLANTAS
La clorofila absorbe la energía solar necesaria para iniciar el ciclo fotosintético de
muchas plantas y bacterias. La principal propiedad fisicoquímica responsable de
este hecho es la elevada absorbancia que presenta la clorofila en el intervalo de
longitudes de onda entre 400 nm y 700 nm. La molécula de clorofila puede
absorber un fotón de estas longitudes de onda al excitar un electrón de los que
ocupan los orbitales moleculares que forman los dobles enlaces conjugados C=C
y C=N de la estructura central que rodea al átomo de magnesio (Reece et al.,
2011).
Existen dos tipos principales de clorofila, la clorofila a y la clorofila b, que se
diferencian por la presencia de un grupo CH3 o CHO, respectivamente, en uno de
los anillos C4N. La presencia de este grupo funcional altera ligeramente la
estructura y energía de los dobles enlaces conjugados, dando lugar a espectros
de absorción distintos para cada tipo de clorofila. Así, la clorofila a en disolución
alcohólica presenta máximos de absorción en 430 nm y 662 nm, mientras que la
clorofila b los presenta en 453 nm y 642 nm. La posición exacta de estos máximos
depende del disolvente que se utilice (Purves et al., 2004).
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JUSTIFICACIÓN
La naranja que es destinada como insumo para la agroindustria es utilizada para
la producción de jugos principalmente, cuyo proceso con lleva una generación
considerable de desechos como cáscaras, pulpa y semillas, que se han vuelto una
carga sustancial para el medio ambiente. Estos desechos pueden ser empleados
para obtener otros productos como aceites esenciales, buscando incrementar su
“valor agregado” con el proceso de agro-industrialización y al mismo tiempo de
disminuir el impacto ambiental que estos producen.
La extracción de aceite se produce sometiendo la materia prima a una serie de
procesos y las técnicas, siendo la primera de ellas la destilación por arrastre de
vapor, que consiste en separar sustancias insolubles en agua y ligeramente
volátiles, de otros productos no volátiles de esta forma, compuestos orgánicos de
alto punto de ebullición son destilados con cierta rapidez por debajo del punto de
ebullición del agua, al lograr ser arrastrados por el vapor generado. de la planta
Azufaita la cuales se establecen hojas como ligeramente dentadas, de un verde
especialmente brillante, y sus discretas flores, de unos 5 milímetros de diámetro,
tienen 5 pétalos de color amarillo-verdoso. La extracción podrían ser utilizados
como antidiarreico, hipoglucemiante suave y para tratar el asma y la fiebre. Una de
las aplicaciones de extracción de clorofila podría ser para el control de urticaria y
controlarla de manera natural.
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MATERIAL Y MÉTODOS
Tubos de ensaye 13x100
Cubetas para espectrofotómetro
Pipetas 5 mL y 10 mL
Placas de silica
Vasos de precipitado
Papel filtro
Embudo de buchner
Hielo
Contenedores para agua
Mecheros
Matraz kitasato
Tubos capilares
Equipos
Triturador
Sistema de destilación por reflujo “solido-liquido”
Espectrofotómetro
Tamiz
Transiluminador
Bomba de vacío
Bomba de agua
Rotavapor
Material vegetal
Naranja
Cucurbitáceas
Semillas de calabaza
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Solventes
Metanol
Acetato de etilo
Ácido acético
Ácido fórmico
Agua
PROCESO
Preparación de la materia vegetal
1.- Obtener la cascara de la naranja y retirar el exocarpo.
2.- Triturar las muestras a 200 rpm Tamiz.
1.- De las muestras trituradas, pasarlas a través de un cribado
2.- Recuperar las muestras obtenidas en cada matiz y guardar hasta su uso
Extracto de Cucurbitácea
1.- Homogenizar la muestra Cucurbitácea previamente triturada con Metanol.
2.- Ensamblar el matraz kitasato con la bomba de vacío, colocar papel filtro sobre
el embudo de buchner.
3.- Ya instalada el sistema, encender la bomba de vacío y verter el extracto
4.- Recuperar el extracto que ha quedado en el matraz.
Medición de clorofila
1.- La muestra previamente triturada de Cucurbitácea, se pesara 0.05g y colocara
en un tubo de ensaye de 13x100 y se agregara 5 mL de etanol.
2.- Homogenizar la muestra y dejar reposar la muestra
3.- Centrifugar a 2000 r.pm. Durante 10 minutos, recuperar sobrenadante.
4.- Agregar 1mL de la muestra en una celda y realizar lectura en el
espectrofotómetro en las absorbancias de 645-660 nm.
Extracción solido-liquido
1.- Elaborar los cartuchos con el papel filtro para la muestra de Cucurbitácea.
2.- Introducir el cartucho dentro del sistema soxhlet.
3.- Agregar 200 mL de metanol en el matraz.
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RESULTADOS
Se llevó a cabo el análisis de clorofila de los integrantes del grupo:
Para el calcular la concentración de clorofilas fue mediante las siguientes
ecuaciones:
Clorofila a = (Lectura de la Abs. X longitud de onda 660 nm ) - (Lectura de la Abs. X longitud de onda 645 nm)
Clorofila b = (Lectura de la Abs. X longitud de onda 645 nm ) - (Lectura de la Abs. X longitud de onda 660 nm)
ANÁLISIS DE VARIANZA
Valor
Origen de las Suma de Grados de Promedio de los Probabilida crítico para
variaciones cuadrados libertad cuadrados F d F
13.816272 12.401022 4.4939984
Entre grupos 2 1 13.8162722 7 0.00283193 8
Dentro de los 17.825977
grupos 8 16 1.11412361
Total 31.64225 17
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MUESTRAS DE LA CLOROFILA A
Abs. Linear (Abs.) y = -0.151x + 4.2028
6 R² = 0.2392
5
ABS. 645 NM
4
3
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
MUESTRAS
Fig 1. La siguiente gráfica muestra la curva de calibración de la muestra de Clorofila A, en una absorbancia de
645 nm, mostrando su R² de la curva de las muestras.
MUESTRAS DE LA CLOROFILA B
Series2
5
y = 0.2468x
4 R² = -0.704
ABS. 645 NM
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
MUESTRAS
Fig 2. La siguiente gráfica muestra la curva de calibración de la muestra de Clorofila B, en una absorbancia de
660 nm, mostrando su R² de la curva de las muestras.
Matriz biológica Rf
Cucurbitácea 0.00
NARANJA 0.74
SEMILLAS 0.82
Tabla 3. En la siguiente tabla se muestra la determinación de las distintas matrices biológicas por
cromatografía para Fenoles. Rf = L1 (distancia recorrida por la muestra) / L2(distancia del frente del solvente)
4.1 en experimento.
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A B C
A
Fig 3. En la siguientes imágenes se muestran las cromatografías a las diferentes matrices biológicas donde
en recuadro A se muestra la cromatografía para Fenoles, en el B para Flavonoides y en el C fue realizada
para Taninos. Donde podemos observar que en Fenoles mostro un corrimiento muy lineal.
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DISCUSIÓN
La extracción de compuestos (metabolitos) por solvente dependerá de la
solubilidad del compuesto a extraer, de la volatilidad, inflamabilidad y toxicidad de
los posibles disolventes a emplear. “Lo semejante disuelve a lo semejante”,
cuando mayor sea la afinidad de la muestra orgánica por el disolvente de
extracción elegido, más fácil se extraerá. Esto aumentara la fuerza iónica de la
misma, haciendo descender el valor de la solubilidad de la muestra orgánica en
dicha fase, lo cual contribuirá al pasaje de la misma a la fase del disolvente
orgánico de extracción. Una implicación importante es que el disolvente de
extracción debe ser inerte, no debe de alterar la estructura del compuesto a
extraer.
El uso del sistema Soxhlet permite la extracción exhaustiva de componentes
orgánicos, llevando a cabo un reflujo a través de la muestra contenida en un
cartucho poroso de celulosa, permitiendo un contacto continuo de la muestra con
una porción fresca de disolvente. Muhammad et al., 2016, reportaron que el uso
de metanol acidificado incremento el rendimiento de extracción de compuestos
fenólicos de la Cucurbitaceae y de acuerdo con Venturini et al., 2014¸ la
extracción de aceite esencial de Citrus medical con el solvente acetato de etilo, la
variedad de compuestos estaba dominado por hidrocarburos monoterpénicos
(66.8-82.5%). El limoneno fue el compuesto principal (54.2-60.6%) seguido de γ-
terpineno (6.7-15.2%). Los monoterpenos oxigenados nerol, neral, geraniol y
geranial estuvieron presentes en concentraciones relativamente altas (2.9-8.2, 2.1-
6.6, 1.8-5.9 y 2.1-5.7%, respectivamente).
La presencia de saponinas en semilla de calabaza, no fue muy presencial por la
parte cualitativa, la persistencia de las burbujas no eran muy consistentes, una
descripción por Barrón et al., 2009, describen que hay una menor presencia de
saponinas en semillas secas, en una comparación cuando se encuentra en un
proceso de germinación. Lo cual incide con la característica que se presentó.
Mientras que en los resultados obtenidos en esta práctica la presencia de
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saponinas fue muy pequeña, se logró presencia una ligera producción en semilla
semi-trituradas.
CONCLUSIONES:
Ningún aceite esencial ha sido reproducido con éxito. Sin embargo, los métodos
sintéticos han logrado la producción comercial de componentes importantes de los
aceites esenciales como linalol, acetato de linalilo, nerodilol y citral. Hay que tener
muy en cuenta sobre cual proceso es el más adecuado para obtener un aceite de
mayor calidad. La mayor parte de los aceites se obtienen por destilación,
generalmente con vapor, pero ciertos aceites se pueden dañar con altas
temperaturas. De los procesos de exprimir a mano, ya que produce el aceite de
mayor calidad. Este proceso es aplicado generalmente para la obtención de
aceites cítricos.
A partir de la corteza del naranja se obtiene la esencia, que es empleada
en perfumería. El aceite esencial del naranja es uno de los aceites más ricos en
vitaminas, contienen sobre todo vitamina C y caroteno, que es una forma de
vitamina A. También tienen importancia en medicina, por su sabor como por su
efecto calmante del dolor y su valor fisiológico. En caso de utilizarlo como aditivo,
es combinado con los alimentos para producir ciertas modificaciones que
impliquen conservación, color, reforzamiento del sabor y estabilización, los cuales
van a ayudar a efectuar una mejora sorprendente en nuestros suministros
alimenticios, así como a disminuir el trabajo en la cocina.
El método empleado para la extracción del aceite esencial del naranja aunque
muy tedioso, es efectivo ya que se logra la obtención del producto de la corteza.
Para la separación del aceite del naranja del solvente, no se logró una buena
separación, pués la destilación al vacío fue imposible efectuarla
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completamente por fallas en la bomba de vacío por lo que tuvo que hacerse una
destilación simple a baja presión.
REFERENCIAS
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Ziziphus jujuba en USDA, GRIN Taxonomy for Plants, U.S. National Plant
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