Amplificar una secuencia de genes desconocida

1. Tamaño de Primers
2. Secuencia de Primers
3. TM, Temperatura de melting de los primers
4. Cantidad G y C, menor a 55%
5. Tamaño del producto PCR? =1018, 1001
6. Condiciones del termo-ciclador

Primer 16S-F

5’-GGAGGCAGCAGTAGGGAATA-3’

Primer 16S-R

5’-TGACGGGCGGTGAGTACAAG-3’

Realizamos un BLAST, con el primers 16S-F, usamos un kit: GoTag Green Master Mix (promega
Corp. USA).

Premisas

- Tiempo de extensión 1 min cada 2kb

- Tm: menos de 5°C del oligo con menos Tm
- ADn molde debe ser al 10% del Vf
- Primers deben ser el 5% del Vf
- 100000 nM = 100 microM

Reacción para 25 microlitros Lab mañana (G6 BL = 100 uL, 2uL del adn molde, 19,5
añadirle 5,5 uL de agua libre de nucleasa)

- GoTaq 12,5 um Cf: 1x

- Primer Fwd 0,25 – 2,5 ul Cf: 0,1 - 1,0 uM
- Primer Rev 0,25 – 2,5 ul Cf: 0,1 – 1,0 uM
- Dan templeta <250ng
- Nucleasa libre de agua < 250 uL