Cinética de crecimiento en biorreactor

Octubre 31, 2017

_________________________________________________________________________________
Resumen

Los biorreactores son importantes instrumentos de un bioproceso, a nivel industrial el mejor modelo es el de
tanque agitado mecánicamente. Para poder establecer el diseño de una fermentación, es necesario conocer algunos
parámetros claves de la cinética del crecimiento celular del organismo de trabajo, así como un modelo matemático
que permita predecir el comportamiento y optimizar el proceso. El objetivo de este trabajo es evaluar el
crecimiento celular, el consumo de sustrato y el coeficiente de transferencia de oxígeno (k La) para la fermentación
de una levadura con posible actividad pectinolítica creciendo en un medio sintético en un biorreactor de tanque
agitado de 3L, con volumen de operación de 1,5 L. Se encontró, en este caso, que la velocidad específica de
crecimiento de la levadura fue de 0,056 h-1, mientras el rendimiento global biomasa sustrato fue de 0,54 y, por
último, un valor de kLa de 60,48 h-1.

Palabras Clave: biorreactor, tanque agitado, biomasa, rendimiento, k La

__________________________________________________________________________________

1. Introducción

Los biorreactores son el centro del proceso de cultivo, pues son el lugar donde ocurren las reacciones
implicadas en los procesos específicos de conversión del sustrato por parte del microorganismo. Su
diseño debe proporcionar un sistema homogéneo al interior para todos los componentes, así como las
condiciones óptimas para el crecimiento microbiano y la obtención del producto objetivo. Unos de los
parámetros más relevantes en el diseño son la transferencia de calor y la de oxígeno, dado que de ellas
depende en gran medida la supervivencia de las células necesarias en el proceso que se va a desarrollar.
Adicionalmente, la agitación es relevante en la medida en que provee homogeneidad al medio, sin
embargo, se debe prestar atención a los efectos de cizalladura que pueden ocurrir en las células [1].

Los biorreactores se pueden clasificar por el tipo de operación tanto como por la geometría y tipo de
agitación, como los fermentadores agitados por aire (Air-lift), los de torre y los de agitación mecánica.
Comúnmente, se pueden distinguir tres tipos de procesos en un biorreactor: en batch, continuo y semi-
continuo; llevados a cabo, principalmente en tanques con agitación mecánica, que son el tipo de
biorreactor más usado, mientras el tipo de operación depende mayormente del objetivo del proceso,
como tipo y cantidad de producto esperado, tiempo de reacción, espacio y los costos asociados, entre
otros [2].

El crecimiento de los microorganismos en los biorreactores debe ocurrir de manera ordenada para que
la producción de metabolitos pueda ser controlada, de forma indirecta, mediante la manipulación las
condiciones de crecimiento elegidas como las óptimas para cumplir el objetivo del proceso. En este
orden de ideas, se pueden distinguir cuatro fases bien definidas durante el crecimiento celular: la fase
de latencia, posterior a la inoculación; la fase exponencial, donde el crecimiento celular se acelera; la
fase estacionaria, que ocurre cuando el sustrato del medio se agota y la tasa de crecimiento iguala a la
tasa de muerte; por último, la fase de muerte [3]. Entonces, dependiendo de los requerimientos del
proceso, se puede mantener a las células en la etapa exponencia, si se necesita producir biomasa, o en
la etapa estacionaria, si ofrece las condiciones necesarias para que el organismo desempeñe un tipo de
metabolismo que genere el producto de interés [4].
La información sobre las características del microorganismo es, así, indispensable para decidir sobre la
viabilidad de un proceso que se está diseñando y se pretende implementar, de modo que los estudios
cinéticos sobre el comportamiento del mismo bajo unas ciertas condiciones dadas ayudan a predecir si
la fermentación es propicia. Dichos estudios arrojan parámetros tales como curvas de crecimiento
microbiano, los rendimientos obtenidos a partir del sustrato usado tanto para la biomasa como para el
producto, lo mismo que los rendimientos respecto al consumo de oxígeno, en caso de ser éste un sustrato
limitante en el proceso [5].

Los parámetros evaluados durante la cinética microbiana se miden, principalmente, mediante técnicas
analíticas y sensores equipados en el biorreactor. Por ejemplo, usando lecturas de densidad óptica y
mediciones de peso seco, se puede conocer el comportamiento del crecimiento celular; el consumo de
sustrato y la generación de producto se pueden hallar por técnicas como el DNS para medir azúcares
reductores y mediciones de actividad enzimática si el producto esperado es una enzima [6][7][8].

Al final, con toda la información recolectada, se pueden desarrollar modelos matemáticos para el
proceso que permitan predecir el comportamiento de la fermentación y la optimización del mismo [3].
Por tanto, en este trabajo se pretendió obtener las curvas de crecimiento de biomasa, el consumo de
sustrato y generación de producto, así como la transferencia de oxígeno en un biorreactor de tanque
agitado de 3 L operando a una capacidad de 1,5 L para un cultivo de levaduras desconocidas aisladas
previamente por sus posibles capacidades pectinolíticas usando un medio de cultivo sintético de
formulación conocida.

2. Antecedentes

Tabla 1. Matriz bibliográfica cinética microbiana

Título Revista Objetivo Sustrato Producto Microorganismo
Caracterización Estudiar el
fermentativa de comportamiento
levaduras cinético de
productoras de Rev. Mex. Ing. Quím biomasa y etanol
Jugo de Agave Kluyveromyces
etanol a partir de vol.12 no.3 México nivel matraz y Etanol
cupreata. marxianus
jugo de Agave dic. 2013 nivel biorreactor
cupreata en la durante la
elaboración de fermentación
mezcal [8] alcohólica.
Estudiar la
Bioprocessing of producción de
citrus waste peel Journal of Radiation pectinasas a partir
for induced Research and Applied de fermentación de
pectinase residuos
Sciences Cáscara de
production by agroindustriales Pectinasas Aspergillus niger
Aspergillus niger; Volume 9, Issue 2, cítricos
como la cáscara de
its purification and April 2016, Pages naranja por
characterization 148-154 microorganismos
[9] como Aspergillus
niger.
Biodegradation and Evaluar la eficacia
kinetic study of de especies
Bioresource
benzene in microbianas con
Technology Benceno
bioreactor packed potencial para Benceno Bacillus sp. M3
242, pp. 92-100 degradado
with PUF and degradación de
alginate beads and benceno. Además,
immobilized with maximizar la tasa
 Bacillus sp. M3 de biodegradación
por optimización
[10]
de parámetros del
proceso como el
pH, la temperatura
y la concentración
del benceno y el
tamaño de los
inóculos usando las
especies más
eficientes.
Construcción de un
Multi-substrate modelo cinético no
growth kinetics of Applied lineal de doble
Pseudomonas Microbiology and sustrato, fenol y
Biotechnology oxígeno Fenol Pseudomonas
putida for phenol Fenol
May 1997, Volume disuelto,para el degradado putida
removal 47, Issue 5, pp 610– crecimiento de P.
[11] 614 putida en un
fermentador
continuo.
Examinar la
cinética del uso del
Kinetics of
APPLIED AND pentaclorofenol en
Microbial Growth
ENVIRONMENTAL cultivo batch y fed- Pentaclorofenol
on Pentaclorofenol NN
MICROBIOLOGY, batch por un degrado
Pentachlorophenol
Jan. 1985, p. 46-53 microorganismo
[12]
degradador de
pentaclorofenol

Tabla 2. Matriz bibliográfica determinación del kLa

Título Revista Objetivo Sistema Método

Development of a Heliyon Presentar un modelo Tanques de Se desarrolló el

model to February 2017 mecánico validado aireación modelo matemático:
determine mass Volume 3, Issue experimentalmente para (Biorreactor).
transfer 2. predecir el coeficiente
coefficient and de transferencia de que evalúa el efecto
oxygen solubility oxígeno (kLa) en de la temperatura en
in bioreactors tanques de aireación el kLa.
para diferentes
[13] temperaturas del agua.

Dynamic pressure Biotechnology Proponer un método Biorreactores Método dinámico

method for kLa and dinámico para medir el de gran escala estándar, método
measurement in Bioengineering kLa en reactores dinámico con cambio
large-scale May, 1989. aireados y agitados, de presión, y método
bioreactors Volume 33, Issue donde el cambio en la de sulfito en estado
[14] 11. Pages 1406 – presión total lleva a un estacionario.
1412. cambio en la
concentración de
oxígeno de todas las
burbujas de dispersión.

Comparison of Applied Presentar las Biorreactor de Método de oxidación

growth properties Microbiology propiedades de paletas de del sulfito simulación
of carrot hairy and crecimiento de raíz turbina de oxígeno disuelto
root in various Biotechnology peluda de zanahoria en dinámico (OD)e sodio
 bioreactors December, 1989 diferentes biorreactores,
[15] Volume 32, Issue y proponer el kLa como
3. Pages 291 - un criterio importante.
294.

Determinación Revista peruana Determinar Biorreactor Métodos de balance

experimental del de química e experimentalmente el batch de oxígeno en el
coeficiente de ingeniería kLa en un biorreactor isotérmico sistema o la técnica
transferencia de química. (2001). batch inicialmente sin (BIOFLO III) dinámica
oxígeno (kLa) en Vol 4, Número 2. microorganismos, y
un biorreactor Páginas 22- 27. observar el efecto del
batch nivel de aireación, el
[16] grado de agitación y la
viscosidad en diferentes
medios.

Dynamic DO Huagong Construir un modelo de Sequencing Método de simulación

simulation for Xuebao/CIESC nitrificación para batch reactor dinámica de oxígeno
aerobic Journal obtener datos dinámicos (SBR) disuelto (OD)
nitrification 63(12), pp. 4048- de OD del proceso en
process in SBR 4054 aireación constante, a
with constant partir de la cual los
aeration intensity: valores de kLa podrían
Model determinarse mediante
identification and análisis teóricos.
KLa
determination
[17]

3. Metodología

3.1. Preparación del medio de cultivo

Se utilizó un medio de cultivo de composición conocida (5g/L Glucosa, 0.1g/L CaCl2, 0.6g/L
MgSO4.7H2O, 0.78 g/L KH2PO4, 0.45 g/L ácido cítrico, 0.3 mL/L solución de Urea, 1.0mL/L solución
de vitaminas, 1.0mL/L solución de cationes) pH 4,7. Solución de vitaminas: Inositol 70 g/L, Acido p-
amino benzoico 1.0 g/L, Pantotenato de calcio 4,0 g/L, D-Biotina 0.06g/L, Piridoxina 1.0g/L, Acido
nicotínico 12 g/L, Tiamina 0.6 g/L. Solución de cationes: FeSO4 .7H2O 0.2mg/L, ZnSO4 .7H2O, 60
μg/L. Se preparó suficiente medio para un volumen final de operación de 1,5 L.

3.2. Preparación del inóculo

Se dejó creciendo una muestra del microorganismo en un erlenmeyer de 1 L con un volumen de medio
de 100 mL durante 24 horas a 30 °C y con agitación orbital de 200 rpm. Dicho medio se inoculó a partir
de la levadura crecida enmedio sólido y resuspendida en un pequeño volumen de agua destilada estéril.

3.3. Montaje de la fermentación

El cultivo se realizó en un biorreactor de tanque agitado a escala de laboratorio, con una capacidad de
3 L, operando a 1,5 L de volumen. Se llenó inicialmente con 1,4 L de medio (previamente descrito)
estéril y se procedió al montaje del tanque, tal como se muestra en la figura 1; una vez preparado el
arreglo del sistema se procedió a inocular con los 100 mL de medio con microorganismo crecido por
24 horas y se encendió el biorreactor. Se mantuvo una agitación 400 rpm, un flujo de aire de 0.8 L/min
y una temperatura de 30 °C para un tiempo de fermentación de 30 horas y 25 minutos.

Figura 1. Montaje del biorreactor.

3.4. Mediciones experimentales

Se tomaron muestras regulares durante el tiempo de fermentación de un volumen de 15 a 20 mL de

medio para evaluar algunos parámetros cinéticos relevantes.
El crecimiento microbiano se determinó por densidad óptica, mediante lecturas de absorbancia a 600
nm en un espectrofotómetro con celdas plásticas con capacidad 1 mL. Así mismo se midió el peso seco
de la biomasa en estas muestras, mediante un proceso de filtración de un volumen de 5 mL y el posterior
secado del mismo en un horno a 50 °C durante 48 horas. Se registró previamente el peso de los filtros
y después se contrastó con el peso de los mismos más la biomasa posterior al secado.

Se evaluó el consumo de sustrato del medio por el microorganismo mediante un análisis de

azúcapresentes en la muestra recolectada, para ello se usó el método de DNS y se recolectaron datos de
absorbancia a 540 nm, tal como se trabajó en estudios cinéticos en Erlenmeyer previamente.

Adicionalmente, se evaluó la transferencia de oxígeno al sistema mediante el método directo de

determinación del kLa.

3.5. Determinación de kLa por el método dinámico

La determinación del kLa por este método se basa en la técnica propuesta por Taguchi y Humphrey [6],
en el cual primero se realiza una medición de la actividad respiratoria de microorganismos que crecen
activamente en un biorreactor. Luego, al cultivo se le suspende el suministro de gas, y este se verá
sometido a que la concentración de oxígeno disuelto disminuirá a una velocidad igual al consumo de
oxígeno por parte de la respiración de los microorganismos (OUR). Luego de llegar a un porcentaje
bajo de oxígeno, se reanuda la aireación hasta que la concentración permanezca constante. Así, un
balance de masa para el oxígeno disuelto en un medio de cultivo estará dado por la siguiente ecuación:
 Ecuación 1

Para hallar el valor de kLa se toma la ecuación 1 como lineal, y se gráfica ΔOD/Δt vs OD utilizando los
valores de OD y tiempo obtenidos en la región OTR (después de reanudar la aireación), la pendiente de
esta recta será el valor de kLa.

Teniendo en cuenta lo anterior se procedió de la siguiente manera: pasadas 4 horas de cultivo se

suspendió la aireación, ésta sería el tiempo cero (t=0) en la aplicación de método. Se suministró un flujo
de nitrógeno con el fin de acelerar el proceso de desplazamiento del oxígeno. Lo anterior permitió que
se alcanzará un nivel de concentración de oxígeno disuelto de 18,7 % al pasar un minuto. Luego, se
volvió a activar el sistema de aireación, y se tomó datos de porcentaje de oxígeno disuelto (%OD) hasta
valores cercanos al valor inicial de OD=88% (valor previo a la iniciación del desplazamiento).

Para hallar el valor de ΔOD/Δt se encontró un polinomio de grado 3 que se ajuste a la curva que resulta
luego de reanudar la aireación. Teniendo la ecuación del polinomio, se halló su función derivada cuyas
imágenes serían los valores de dOD/dt con respecto al tiempo. Con esto, se tiene un sistema de
ecuaciones paramétricas (f(t)=dOD/dt ; g(t)=OD) cuya gráfica es una línea recta de pendiente -kLa.

4. Resultados y discusión

Las condiciones de operación del biorreactor se fijaron de la siguiente manera:

T = 30 °C
Agitación = 400 rpm
Flujo de aire = 0,8 L/min

4.1 Crecimiento microbiano

La tabla 3 resume los resultados de densidad óptica y peso seco obtenidos para cada muestra. Con estos
datos se construyó la curva de crecimiento microbiano presentado en la figura 2.

Tabla 3. Datos para crecimiento microbiano

Muestra Tiempo (h) DO (Absorbancia) Peso seco (g/L)
1 0 0,531 0,30
2 4 0,868 0,38
3 7 1,197 0,80
4 9 1,585 1,40
5 11 1,735 1,86
6 22 1,782 2,04
7 24 1,803 2,14
8 28 1,926 2,50
9 31 1,938 2,64
 Figura 2. Crecimiento microbiano en biorreactor determinado por la densidad óptica y peso seco

En la figura 2 la curva de crecimiento microbiano medido por peso seco, muestra claramente las fases
de latencia, exponencial y estacionaria, típicas de una curva de crecimiento microbiano. En la curva de
crecimiento microbiano medido por densidad óptica, también se observan las fases pero no son tan
distinguibles. Por lo tanto, se evidencia que el método de peso seco es un más confiable para medir el
crecimiento microbiano, que midiendo la densidad óptica. Así mismo, para ambos casos, luego de la
fase estacionaria se observa un pequeño crecimiento donde debería encontrarse la fase de muerte. Se
asume que en las últimas muestras hubo un problema de contaminación, pues no es lógico que haya
crecimiento de biomasa cuando el sustrato ha disminuido casi por completo, como lo muestra la figura
3. Adicionalmente, la incertidumbre en el comportamiento de la gráfica se ve apoyado por un vacío de
los datos presentado entre la quinta y la sexta medición, correspondiente a once horas donde no se tiene
claridad de lo que ocurrió, y en la gráfica se muestra como la fase estacionaria.

4.2 Consumo de sustrato

La concentración de glucosa, medida por el método DNS, muestra el consumo de sustrato de la levadura
durante la fermentación. Utilizando los datos de la tabla 4, se superpuso el consumo de sustrato sobre
el crecimiento microbiano, obteniendo la figura 3. Se observa que ambas variables están
proporcionalmente relacionadas indicando que una parte significativa del sustrato es utilizado por las
células para crecer. Sin embargo, al observar las pendientes de las gráficas se infiere que la razón a la
que disminuye el sustrato es mayor que la razón a la que aumenta la biomasa, esto se ve reflejado en un
valor de rendimiento global, Yx/s, menor que uno (0.54).
 Figura 3. Consumo de sustrato y crecimiento microbiano en el tiempo

Adicionalmente, dada la fase exponencial es posible conocer la velocidad específica de crecimiento de

biomasa, μm, la cual es una medida importante a la hora de estudiar el crecimiento de los
microorganismos. A partir de la definición de μ (ecuación 3) se obtiene un valor de μm igual a 0.056 h-
1
resolviendo la ecuación diferencial para la fase exponencial (ecuación 4).

Tabla 4. Datos para medición de azúcares reductores.

Tiempo (h) Factor de dilución Abs Azúcares reductores (g/L)
0 0,0333 0,879 4,378
4 0,0500 1,068 3,550
7 0,0667 1,127 2,810
9 0,1250 1,261 1,678
11 0,2000 0,256 0,209
22 1,0000 0,794 0,132
24 1,0000 0,679 0,113
28 1,0000 0,576 0,095
31 1,0000 0,067 0,010

4.4 Determinación del kLa

El método dinámico inició a las 4 horas de cultivo, esperando que en ese momento las células estuvieran
por comenzar la fase exponencial de crecimiento. La figura 4 muestra como al interrumpir el flujo de
aire, se observa un consumo muy rápido de oxígeno ya que las células están creciendo a una tasa muy
alta. Adicionalmente, antes de alcanzar el punto crítico, cuando se abre el flujo de aire nuevamente, se
observa el aumento del oxígeno disuelto a lo largo del tiempo, y es allí donde se halla el coeficiente de
transferencia de oxígeno, según el balance de materia presentado en la ecuación 2.
La función que mejor se ajustó al tramo utilizado para hallar el kLa fue el polinomio cúbico presentado
en la ecuación 5 cuya derivada es la ecuación 6.

Figura 4. Comportamiento del oxígeno disuelto por el método dinámico

La figura 5 representa el balance de materia (ecuación 2) que es una línea recta cuya pendiente es el kLa
= 0,0168 s-1 o 60,48 h-1. Dicho valor es más bajo al obtenido en experimentos de estimación del
coeficiente de transferencia de oxígeno por métodos como el de la oxidación del sulfito, puesto que éste
último tiende a sobreestimar el valor, debido a que no considera el consumo de oxígeno por parte de las
células, así como también, que la reacción de oxidación ocurre mucho más rápido gastando a mayor
velocidad el oxígeno disuelto de o que lo haría el metabolismo celular. En el trabajo anterior, los valores
de kLa para un Erlenmeyer de 1L y 250 mL operando con 100 mL de medio con agitación orbital de
200 rpm arrojó valores entre 60 y 286 h-1 para diferentes arreglos geométricos, correspondiendo el más
bajo a un Erlenmeyer pequeño y sin bafles. Por estas razones, se esperaba que la mayor agitación del
tanque, sumada a la aireación del medio se tradujera en un valor del coeficiente mucho mayor; aún así
cabe mencionar que ésta característica también está ligada a la especie en particular del organismo
usado y, en este caso, se carece de la certeza de que las levaduras usadas en ambos estudios
correspondan a la misma especie.
 Figura 5. Balance de materia de forma gráfica para hallar el kLa

5. Bibliografía

[1] H.A Ruiz Leza, R. R. (2007). Diseño de Biorreactores para fermentación en medio sólido. Revista
Mexicana de Ingeniería Química, 6(001), 33-40.

[2] Rodríguez Arévalo A.C, C. L. (Marzo de 2003). Diseño y construcción de los instrumentos de
medición para un Biorreactor prototipo. Revista Mexicana de Ingeniería Biomédica, 24(1), 55-70.

[3] Doran, P. M. (1995). Bioprocess engineering principles. Academic press.

[4] Penfold, W. J. (1914). On the nature of bacterial lag. The Journal of hygiene, 14(2), 215.

[5] Mohamad, N. L., Kamal, S. M. M., Mokhtar, M. N., Husain, S. A., & Abdullah, N. (2016).
Dynamic mathematical modelling of reaction kinetics for xylitol fermentation using Candida tropicalis.
Biochemical Engineering Journal, 111, 10-17.

[6] Harms, P., Kostov, Y., & Rao, G. (2002). Bioprocess monitoring. Current opinion in
biotechnology, 13(2), 124-127.

[7] Damtew, W., Emire, S. A., & Aber, A. B. (2012). Evaluation of growth kinetics and biomass
yield efficiency of industrial yeast strains. Appl Sci Res, 4(5), 1938-48.

[8] Pérez, E., González-Hernández, J. C., Chávez-Parga, M. C., & Cortés-Penagos, C. (2013).
Caracterización fermentativa de levaduras productoras de etanol a partir de jugo de Agave cupreata
en la elaboración de mezcal. Revista mexicana de ingeniería química, 12(3), 451-461.

[9] Ahmed, I., Zia, M. A., Hussain, M. A., Akram, Z., Naveed, M. T., & Nowrouzi, A. (2016).
Bioprocessing of citrus waste peel for induced pectinase production by Aspergillus niger; its
purification and characterization. Journal of Radiation Research and Applied Sciences, 9(2), 148-154.
[10] Kureel, M. K., Geed, S. R., Giri, B. S., Rai, B. N., & Singh, R. S. (2017). Biodegradation and
kinetic study of benzene in bioreactor packed with PUF and alginate beads and immobilized with
Bacillus sp. M3. Bioresource Technology.

[11] Şeker, Ş., Beyenal, H., Salih, B., & Tanyolac, A. (1997). Multi-substrate growth kinetics of
Pseudomonas putida for phenol removal. Applied Microbiology and Biotechnology, 47(5), 610-614.

[12] Klecka, G. M., & Maier, W. J. (1985). Kinetics of microbial growth on pentachlorophenol. Applied
and environmental microbiology, 49(1), 46-53.

[13] Lee, J. (2017). Development of a model to determine mass transfer coefficient and oxygen
solubility in bioreactors. Heliyon, 3(2), e00248.

[14] Linek, V., Beneš, P., & Vacek, V. (1989). Dynamic pressure method for kla measurement in large‐
scale bioreactors. Biotechnology and bioengineering, 33(11), 1406-1412.

[15] Kondo, O., Honda, H., Taya, M., & Kobayashi, T. (1989). Comparison of growth properties of
carrot hairy root in various bioreactors. Applied microbiology and biotechnology, 32(3), 291-294.

[16] Erazo, R., Cárdenas, J. (2001). Determinación experimental del coeficiente de transferencia de
oxígeno (kLa) en un biorreactor batch. Revista peruana de química e ingeniería química, 4(2), 22 - 27.

[17] Zhu, A., Guo, J., Wang, S., Peng, Y. (2012). Dynamic DO simulation for aerobic nitrification
process in SBR with constant aeration intensity: Model identification and KLa determination. Huagong
Xuebao/CIESC Journal 63(12), pp. 4048-4054.