Práctica: Cromatografía

Asistente: Carlos Urena

Estudiante: Helena Wigoda

Introducción:

El laboratorio consta de buscar un mecanismo con el fin de separar las partes de una
sustancia. Se experimentará con compuestos orgánicos para subdividir los diferentes
compuestos formados por elementos quimicos presentes en la mezcla (1)
Runge, Schoenbein, y Goeppelsroeder estudiaron el análisis de sustancias por
capilaridad en papel en el año 1850, este es un aspecto clave para el proceso de
cromatografía ya que sin capilaridad la cromatografía sería imposible. En 1906 Tswett, un
científico ruso descubrió la cromatografía de columna como mecanismo para la
diferenciación de pigmentos naturales presentes en las plantas, por medio de este
experimento se identificaron los pigmentos vegetales clorofila a, b y c3 (2) M, Tswett utilizó
una columna de vidrio en posición vertical, con carbonato de calcio como material
absorbente, dentro de la cual virtió una disolución que contenía éter y pigmentos de las
hojas morterizadas de una planta. Tras unos minutos el material de la columna empezó a
separarse en distintos pigmentos.(2)
La cromatografía se basa en una fase estacionaria y una fase móvil que es capaz de
fluir a través de la fase estacionaria.(2) La cromatografía puede funcionar como criterio de
pureza de la sustancia a separar.(5) La fase móvil recorre la fase estacionaria arrastrando
componentes de la mezcla, éstos son absorbidos en distintas partes de la fase
estacionaria.(4) La separación resultante es producto de las diferencias entre las polaridad
y afinidad a cada una de las fases de cada componente.
Los tipos de cromatografía incluyen de adsorción y de partición. En el laboratoruo se
tranbajará con tres tipos de cromatografía de adsorción; cromatografía de columna,
cromatografía de capa fina (TLC) y cromatografía de papel.
El método de adsorción se fundamenta en una fase estacionaria sólida en la que se
absorben los componentes de la muestra, que se encuentran distribuidos entre ambas
fases por un proceso de sorción-desorción y en ella se incluyen la cromatografía de capa
fina (TLC), de columna y gas-sólido y HPCL(6)
.
La cromatografía de capa fina permite determinar el grado de pureza de un compuesto,
además se pueden comparar muestras ya que si dos muestras posee un mismo Rf en la
placa podrían ser idénticas.
El Rf es la distancia que recorrió el componente y se calcula mediante la siguiente
fórmula:
Rf = distancia componente //distancia disolvente (1)
La Rf es igual para sustancias idénticas. Para llevar a cabo esta cromatografía la muestra
a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio que
debe de estar cubierta por una fina capa de adsorbente. La placa se introduce ne un
beakermezclados (eluyente o fase móvil). A medida que la mezcla de disolventes
asciende por capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de
los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el adsorbente.7 En el caso
de que la muestra no sea facilmente visible en la lámina se pueden utilizar métodos de
revelación tales como una lámpara de rayos-ultravioleta.
La cromatografía de columna consiste en un sólido poroso que queda soportado en
el interior de una columna de vidrio o plástico y funciona como fase estacionaria. En
cambio, la fase móvil es formada por un líquido que atraviesa, constantemente es usado
el gel de sílice.
La cromatografía de papel permite observar de manera clara y cualitativa las distintas
fases resultantes. La fase estacionaria es papel de filtro, la cual posee un contenido natural
de agua. Las muestras se depositan en un extremo colocando pequeñas gotas de la
disolución y evaporando el disolvente. Luego el disolvente asciende por capilaridad. La
separación se realiza de acuerdo a la afinidad de los solutos con las dos fases, las más
solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se aplicó la muestra, y las menos
solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos.

Sección experimental:
El procedimiento se tomó del Manual de Laboratorio de Fundamentos de Química
Orgánica, página 25, experimento: Eugenol extraído de clavo de olor. El procedimiento
consistió en una cromatografía de capa fina utilizando cuatro analgésicos; ibuprofeno,
acetaminofen, aspirina y cafeína. Además se evaluaron dos mezclas incóngnitas bajo el
mismo método.
Se realizó la extracción del pigmento de un material vegetal (espinaca). Se
separaron los pigmentos por cromatografía de columna y cromatografía de capa fina. Por
otro lado, se separaron los componentes coloros de los M&Ms por medio de una
cromatografía de papel.

Resultados:

Cuadro I. Valores de Rf obtenidos por medio de la cromatografía de capa fina

Sustancia Distancia recorrida (cm) Rf
Ibuprofeno 3.2 0.372
Incógnita 1 (ibuprofeno y 3.2 0.372
acetaminofén)
Acetaminofén 2.4 0.279
Incógnita 2 (cafeína y 3.3 0.383
aspirina)
Cafeína 1.7 0.198
Aspirina 3.3 0.383

Cuadro II: Valores de Rf obtenidos por medio de la cromatografía de papel

Colorante Distancia (cm) Rf
Naranja (combinación de 4 0.404
amarillo y rojo)
Azul 6 0.606
Café combinación de rojo, 6 0.606
amarillo y azul)
 Verde (combinación de 6 0.606
amarillo y azul)
Rojo 3 0.303
Amarillo 4 0.404

Muestra de cálculo:
𝑑1
Rf=𝑑𝑑

Donde Rf= relación frontal

D1= distancia entre el punto final recorrido por la sustancia y el punto inicial
Dd=distancia entre la línea donde se colocó la sustancia hasta la línea donde llegó el
disolvente.

Discusión:

En la cromatografía de capa fina los compuestos que se analizaron fueron dos

incógnitas, acetaminofen (Paracetamol), Ibuprofeno, Aspirina y Cafeína. En la
cromatografía de capa fina las sustancias a separar se mueven a través de una capa de
adsorbente en una placa de vidrio: este adsorbente se encuentra en la fase estacionaria,
en este caso el adsorbente que se utilizó fue el gel de sílice. La fase estacionaria en este
caso es una capa de cromatografía hecha de dióxido de sílice. Esta capa tiene un carácter
polar por lo que los compuestos a analizar con mayor polaridad serán los que suben
menos porque tendrán una mayor afinidad a la fase sólida o estacionaria.
Como eluyente se utilizó una mezcla compuesta por un 95% de acetato de etilo y un 5%
de ácido acético. La polaridad del eluyente que se utiliza tiene un efecto en el tiempo que
dura cada sustancia subiendo a través de la fase estacionaria. La fase móvil se compone
de una mezcla debido a que estos dos compuestos forman una mezcla relativamente
polar, sin embargo, a pesar de la polaridad, esta fase es más afín a compuestos no
polares que a los compuestos polares lo cual la hace óptima para realizar el proceso
cromatográfico. La escogencia del adsorbente y la fase móvil, como fue mencionado
anteriormente, juega un papel crucial para el proceso. Todos los eluyentes comunmente
usados comparten ciertas características obligatorias, entre ellas están bajos puntos de
ebullición y viscosidad que les permite moverse con más rapidez; para escoger un buen
eluyente es necesario considerar la polaridad del mismo, ya que esto predecirá la
solubilidad del mismo con los componentes, lo cual es la base de la separación. Además,
el eluyente debe tener una propiedad de capilaridad, para ser capaz subir y arrastrar las
sustancias de prueba de por la placa. (7)
Cuando se obtuvieron los resultados fue imposible observar a simple vista los
compuestos por lo que fue necesario aplicar luz UV. La mayoría de las placas de
́ llevan un indicador fluorescente que permite la observar los compuestos
cromatografia
bajo una luz ultravioleta éste absorbe luz UV y emite luz visible. Como resultado se puede
observer una mancha en la zona donde se encuentra el compuesto. (7)
Esto se da gracias a que el compuesto actúa como una cortina que evita que los rayos
UV lleguen al papel.
Después de esto se reveló con yodo el resultado. Esto se hace por medio de un frasco
con cristales de yodo en el que se inserta la placa (cuando ya se haya secado el
disolvente). La placa debe estar seca porque de lo contrario se da una adsorción de yodo
en todas las áreas que tengan disolvente. Otro aspecto importante a recordar es que el
yodo es volátil por lo que se recomienda marcar con un lápiz las manchas observadas
ya que se desvanecerán en un rato. (8)
Fig. 1: Resultados de cromatografía de capa fina
Cabe resaltar que las incóognoitas fueron mezclas de diferentes analgésicos por lo que
se mostraron dos manchas diferentes al colocar la luz ultravioleta y la prueba de la
cámara de yodo. Esto se debe a que a pesar de estar mezclados los componentes
mantienen sus propiedades físicas y químicas, en este caso su solubilidad y afinidad a
cada fase por lo que se separaron y tuvieron el mismo Rf que cuando se hizo la
cromatografía del compuesto puro sin mezclar. Esto es un indicador de la pureza de la
sustancia ya que diferentes componentes se separan y recorren distancias diferentes a
traves fase estacionaria

Extracción de columna
Duarante la cromatografía de columna se le extrajeron pigmentos tales como beta
carotenos, xantofilas y clorofila a un extracto de planta de espinaca o spinaca olearea.
Para obtener el extracto se le agregó alcohol para solubilizar los pigmentos clorofílicos.
Posteriormente se filtró para separar el etanol extra. Se agrega éter de petróleo y hexano
a los pedazos de espinaca que disuelven los carotenoides y las clorofilas por lo que los
pigmentos salen del tejido y quedan en los solventes (7) Luego de esto se filtró para
extreaer la fase acuosa y mantener la fase orgánica dobde se encuentran los pigmentos.
Después de esto el filtrado se lleva al rotavapor para deshacerse de los disolventes. El
eter etpilico y el hexano se convierten en gas y solo quedan los pigmentos. (9)
Para armar el equipo se puso un algodón, 1 centímetro de arena, una capa de sílice (fase
estacionaria) y otro centímetro de arena. Luego se pasó el disolvente (hexano y acetato
de etilo) que conforma la fase móvil para separar las fases. El dióxido de sílice tiene un
carácter polar y la mezcla de disolventes tiene un caracter no polar por lo que el pigmento
amarillo (el cual es menos polar) pasa major a traves de la fase sólida ya que tiene una
mayor afinidad a la fase móvil mientras que el pigmento verde no es capaz de traspasar
la fase estacionaria debido a su alta polaridad y afinidad a la fase estacionaria. Los
pigmentos visibles en la separación cromatográfica fueron las xantofilas las cuales son
amarillo claro y la clorofila la cual es color verde. (10)

Fig. 2: resultado de la cromatografía de columna

La cromatografía de papel consta de una tira de papel filtro y las distintas muestras que
se quieran colocar, en estos casos distintos colorantes. El proceso consiste en que el
disolvente asciende por capilaridad a lo largo del papel, y arrastra cada muestra por
separadp hasta puntos específicos.

Figura 3. Estructura del pigmento de coloración azul; blue 1

Figura 4. Estructura del pigmento de coloración roja; red 1 lake.

Figura 5. Estructura del pigmento de coloración amarilla; yellow 1 lake.

El compuesto del pigmento rojo presenta mayor afinidad a la fas estacionaria que a la
fase móvil, ya que fue menos arrastrado por la fase móvil que los demás pigmentos. Esto
puede ser causado debido a que la composición molecular del pigmento rojo posee tres
oxígenos con electrones desapareados lo cual le da cierta polaridad y capacidad en
formar enlaces con el agua presente en la fase estacionaria.
Se observó de igual manera basado en los datos del cuadro que el pigmento de
coloración azul fue el que obtuvo un Rf más alto traduciendose a una mayor afinidad a
la fase móvil.
En el experimento se pudo observar como los pigmentos son mezclas de varios
colorantes de colores primarios. Es decir, las coloraciones que no sean amarillo, rojo y
azul son compuestas de estos.
Conclusiones:
La cromatografía permite separar los componentes de una mezcla
Mismos compuestos tienen el mismo Rf
La cámara de yodo y la luz UV permiten revelar los resultados de cromatografía de capa
fina de compuestos incoloros.
El valor del Rf depende de la afinidad que tenga la muestras hacia las dos fases: si es
mas soluble a la fase estacionaria va a obtener un Rf bajo, si una muestra es más soluble
a las fase la móvil se traduce en un valor Rf más alto.
Bibliografía:
1. Audesirk et al. Biología la vida en la tierra. Novena edición. Pearson Education,
México, 2012, pp 37,116
2. García, A. Curso de Métodos; cromatografía. Instituto de biotecnología, UNAM, 2002.
pp 2-3, 11-16.
3. Senchenkova, E. Michael Tswett, The creator of cromatography.
Davankov & Ettre, L.S ed. Academia rusa de ciencias, Moscú, 2003.
4. Kenndler, E. Introduction to chromatography. Institute for analytical
chemistry, University of Vienna.
5. Lamarque, A.; Zygadlo, J.; Labuckas, D.; López, L.; Torres, M.; Maestri,
D. Fundamentos teórico prácticos de química orgánica, 1a ed.
Encuentro: Córdoba, 2008, pp. 55.
6. Pavia, D. L.; Lampman, G. M.; Kriz, G. S.; Engel, R. G. A Small Scale
Approach to Organic Laboratory Techniques , 3 a ed; Cengage Learning:
Canadá, 2011; pp. 693-707, 777-800, 801-811.
7. Cromatografía en capa fina
https://www.uam.es/docencia/jppid/documentos/practicas/actuales/guion-p6.pdf
(accessed Oct 9, 2018).
8. Quimica experimental, Google books
https://books.google.co.cr/books?id=xiqTfEO1a2gC&pg=PA89&lpg=PA89&dq=c
amara+de+yodo&source=bl&ots=iIo6H5LUVx&sig=g9ljGJio7AE3zEMy22RUR3S
0nKU&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwiMsZHFvv_dAhVRzlMKHQBYDncQ6AEwB3
oECAkQAQ#v=onepage&q&f=false (accessed Oct 9, 2018).
9.
10. Johnston, A., Scaggs, J., Mallory, C., Haskett, A. Warner, D., Brown, E.,
Hammond, K., McCormick, M., McDougal, O. A Green Approach To Separate
 Spinach Pigments by Column Chromatography. J. Chem. Educ., 2013, 90 (6), pp
796–798.
11. Propiedades de la luz. Cómo absorben la luz las clorofilas y otros pigmentos. Khan
academy https://es.khanacademy.org/science/biology/photosynthesis-in-
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