AISLAMIENTO DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE AMILASA

ISOLATION OF BACTERIA PRODUCERS OF AMYLASE ENZYMES

Sonaly Coyla Barreda1 Sandra Chura Tapia2 Milton Barrios Ruelas 3 Alexander Yana
Gutiérrez 4 Richard Ponce Pancca 5
Facultad de ciencias biológicas, Universidad nacional del altiplano, Puno, Perú

RESUMEN
En el presente trabajo se realiza el estudio de colonias microbianas aisladas de diferentes
suelos, productoras de las enzimas con capacidad de hidrólisis sobre el almidón, siendo
las muestras suelo de maíz, papa y humus. Los criterios utilizados para el aislamiento de
las colonias amilolíticas, son el crecimiento sobre los medios modificados con almidón y
la positividad frente al test de lugol. Los medios empleados fueron Agar nutritivo y Agar
almidon. Las colonias obtenidas son debidamente identificadas bioquímicamente,
obteniendo un total de 436 colonias. De éste total de colonias, se seleccionan debido a la
similitud al observar macroscópicamente entre microorganismos aislados, 3 colonias por
placa. Estas últimas son identificadas bioquímicamente y se obtienen los géneros Bacillus
sp.
Palabra clave: Aislamiento de bacterias, a-amilasa, producción de amilasa, enzimas
amilolítica.
SUMMARY
In the present work, the study of microbial colonies isolated from different soils,
producers of the enzymes with hydrolysis capacity on the starch is carried out, being the
soil samples of corn, potato and humus. The criteria used for the isolation of the
amylolytic colonies are growth on starch-modified media and positivity against the lugol
test. The means used were Nutritious Agar and Starch Agar. The colonies obtained are
duly identified biochemically, obtaining a total of 436 native colonies. From this total of
colonies, they are selected due to the similarity when observing macroscopically between
isolated microorganisms, 6 colonies. The latter are identified biochemically and the
genera Bacillus sp.
Keyword: Isolation of bacteria, α-amylase, amylase production, amylolytic enzymes.
INTRODUCCIÓN
La enzima amilasa ha recibido gran cantidad de atención a nivel mundial. Los
microorganismos que pueden producir antas tienen aplicación comercial en industrias
almidoneras, de alimento, textiles, detergentes, drogas, productos farmacéuticos,
elaboración de cerveza y finos productos químicos (Annamalai et ag 2011; Fooladi &
Sajjadian, 2010). Las industrias almidoneras requieren enzimas con resistencia a alta
temperatura, para la licuefacción del almidón (Asgher 61,2006, Ponce &Pérez, 2002).
Las amilasas son enzimas intra o extraceltdares que promueven la hidrólisis de enlaces
glucosídicos presentes en el almidón, glucógeno y otros polisacáridos (Van da Maarel et
al, 2002.) Las amilasas con resistencia a las temperaturas elevadas son de importancia
industrial y biotecnológica, es por ello que el presente trabajo tiene como objetivo
principal caracterizar enzimáticamente la amilasa de la bacteria termófda Bacilltis
lichentfointrBA-3 aislada de los géiseres de Calentes-Candarave, Tacna-Perú.
El almidón es hoy en día la principal fuente de carbono renovable disponible para la
elaboración de productos mediante procesos fermentativos y/o enzimáticos. Anualmente
son extraídas y transformadas millones de toneladas en productos tales como dextrinas,
ciclodextrinas o glucosa, esta última isomerizada posteriormente a fructosa. De acuerdo
con la FAO y el “Tropical Development Research Institute” de Inglaterra, en 1998 de 604
millones de toneladas de maíz producidas, correspondientes a 6% de la producción
mundial, se extrajeron 35 millones de toneladas de almidón, con las cuales sólo en los
EUA fueron producidos 8 millones de toneladas de jarabes fructosados y 3.5 millones de
toneladas de glucosa.
Los jarabes glucosados son soluciones de glucosa en alta concentración que se utilizan en
diversas aplicaciones de la industria alimenticia y biotecnológica (1). Los jarabes de
glucosa se obtienen por hidrólisis enzimática del almidón (2), (3).
Las perspectivas futuras con respecto a la hidrólisis del almidón es acortar las etapas del
proceso, a una sola etapa ya sea con dos cepas microbianas juntas con sus respectivas
enzimas, con una sola cepa con las dos enzimas amilolíticas, o con una enzima que tenga
capacidad de romper todo tipo de enlace de las moléculas de almidón como lo hace la
Glucoamilasa (4).
En las industrias de alimentos y bebidas, las enzimas han sido aplicadas
satisfactoriamente desde hace muchos años y la necesidad de controlar los costos es
dominante (5). Por ejemplo, en la producción de edulcorantes se han venido
reemplazando la sacarosa de caña por otros provenientes de una materia prima más barata
y accesible; como es el almidón de maíz que se puede transformar en glucosa y de ella
producir jarabes ricos en fructosa con mayor poder endulzante y a menor costo, además,
de las ventajas que tiene por ser producidos por vía enzimática y no por vía química (6).
OBJETIVOS
El presente trabajo fue aislar y seleccionar microorganismos productores de amilasas a
partir de 3 muestras de suelo: suelo de plantío de papa, plantío de maíz, y humus. Medir
los halos generados por la degradación del almidón por efecto de las amilasas y
seleccionar la muestra con la colonia con mayores halos producido y seleccionar la
muestra con la colonia de menor de halos producidos e identificar el género Bacillus sp.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección de las muestras
De la localidad de Chillora, Distrito de Capachica del Departamento de Puno, se colectó
3 muestras representativas de suelos de siembra de papa, maíz y humos de
aproximadamente 500 g. de suelo, las muestras se guardaron en frascos previamente
rotuladas y llevadas al laboratorio para su procesamiento.
Procesamiento de las muestras
Procesamiento de las muestras: por cada muestra de de suelo (papa, maíz y humus)
(Figura 1), se tomaron 1g de los 500g recogidos inicialmente, luego se suspendieron en 9
mL de agua destilada y se homogenizaron durante 10 min.
Se tomó 1 ml de cada dilución y se inoculó en placas petri (Figura 2) y se realizó siembra
por diseminación en superficie con el asa de Asa de Digralsky, en el medio agar Nutritivo
y se y se Incubó temperatura ambiente por 72 horas.
Pasada las 72h se observó crecimiento bacteriano en el medio agar nutritivo y su
respectiva coloración Gram. Se repico en un medio selectivo (Agar Almidón).
 Figura 1. Muestras de tierra (Plantío de papa, maíz y suelo de humus)

Figura 2. 1 ml de dilución inoculó en placas petri

IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS:
Se realizó un estudio macroscópico y microscópico de las colonias presentes en el medio
agar nutritivo. La identificación macroscópica de las bacterias seleccionadas productoras
de amilasa, se realizó tomando en cuenta los caracteres biológicos, características
culturales y morfológicas, además se realizó la diferenciación bioquímica respectiva, que
incluye; coloración Gram y catalasa (Figura 3). A Observación microscópica de las
colonias aisladas se aprecia en este caso bacilos Gram positivos (Figura 4).

Figura 3. Identificación bioquímica, prueba catalasa positivo

 Figura 4. Observación microscópica bacilos Gram positivos.
SELECCIÓN:
Se seleccionó las colonias después de realizado el estudio macroscópico y microscópico.
Se repicó de manera ordenada cada colonia desarrollada en placas con agar almidón (3
colonias por placa petri) esta vez separadas para poder medir bien los halos producidos.
Se incubaron a 37°C por 72h.
EVALUACIÓN DE BACILLUS PRODUCTORES DE AMILASA:
En la evaluación de las cepas de Bacillus productores de amilasa; Para determinar las
cepas con mayor capacidad hidrolítica sobre el almidón, se empleó una solución de lugol
como revelador de los halos de hidrólisis, inundando la caja completa con el revelador
(Figura 5), verificando que no falte ningún espacio y se prosigue a descartar el exceso
para su inmediata lectura del halo. Se consideró como colonias amilolíticas aquellas que
presentaron la prueba de lugol positiva (Figura 6.).

Figura 5. Solución de lugol como revelador de los halos de hidrólisis

 Figura 6. Formación de halo en colonias amilolíticas
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se aislaron un total de 436 colonias en medio agar nutritivo, de estas se seleccionaron 3
colonias por placa para medio selectivo (Agar almidón). En el medio agar almidón
presentaron positividad en las 3 placas frente al test de lugol y dentro de las colonias
obtenidas figuran microorganismos de tipo bacilos Gram Positivos y Gram negativos
(Figura 7), cocos y diplococos Gram Positivos. De las 9 colonias seleccionadas, sus
características y su identificación se presentan en la Tabla 1.

Figura 7. Coloración Gram, donde se observa Bacilos Gram Positivos (Placa papa).
Tabla 1: Selección de colonias amilolíticas aisladas de diferentes fuentes de suelo.
Muestra N° de Características Lugol Catalasa Tipo de m.o.
De suelo colonias macroscópicas
Papa 216 Colonias + + - Bacilos
regulares, Gram +
pequeñas
blancas y
cremosas.
Maíz 110 Colonias + + - Bacilos
regulares, Gram +
pequeñas
blancas y
cremosas.
Humus 120 Colonias + + - Bacilos
regulares, Gram +
pequeñas - Cocos
blancas y - Diplococos
cremosas.
M.O: microorganismo, de la muestra seleccionadas el de papa, presentaron una mayor
formación de halo
Se analizaron las medidas de los diámetros de halos de degradación de almidón de todas
las mesas de trabajo tal como se muestra en la tabla N° 2.

TABLA N° 2. Colonias sleccionadas con sus respectivas medidas de halos de producción

de amilasas.
Muestra Colonia Halo (mm)
Colonia 1 45x33
Suelo plantío de papa Colonia 2 45x40
Colonia 3 35x30
Colonia 4 35x30
Suelo plantío de maíz Colonia 5 33x22
 Colonia 6 33x28
Colonia 7 35x30
Suelo Humus Colonia 8 30x20
Colonia 9 25x15

. PLACA 1: Suelo de cultivo de papa.

Figura 7. Suelo de cultivo de papa, en el cual se aprecia mayor tamaño de formación de

halo en presencia de lugol.
PLACA 2: Suelo de cultivo de maíz.

Figura 8. Suelo de cultivo de maiz, en el cual se aprecia tamaño mediano de formación

de halo a la exposición de lugol.
PLACA 3: Suelo de humos.

Figura 9. Suelo de humos, en el cual se aprecia tamaño regular de formación de halo en

presencia de lugol.
De 3 muestras de tierra
En 3 cepas aisladas de 3 muestras de tierra, la muestra de humus por Dominguez (2014)
donde la formación de halo fue: 9.5 mm, 10.5 mm y 11 mm, por producción de amilasas
(11), en contraste nosotros pudimos observar que en la muestra de suelo humus el tamaño
de formación del halo fueron mayores (35x30 mm, 30x20mm y 25x15mm), y siendo aun
de mayor tamaño de formación de halo los encontrados en la muestra de plantío de tierra
papa.
CONCLUSIONES
Se lograron obtener un total de 436 colonias. Del suelo de cultivo de papa 216 colonias,
del suelo de cultivo de maíz 130 colonias, del suelo de humus 110 colonias. De las cuales
se aislaron 3 colonias de cada placa, se observó una mayor actividad amilolítica en la
muestra obtenida del suelo de cultivo de papa observándose también un mayor tamaño de
formación de halo en comparación a las otras muestras, donde menos actividad amilolítica
se observó fue en la muestra de humus. Al ser identificadas bioquímicamente, éstas
pertenecen a los géneros Bacillus sp.
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