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Tecnicas de Histologia Vegetal PDF
Tecnicas de Histologia Vegetal PDF
HISTOLOGÍA
VEGETAL
por
• Laboratorio de Histología
Vegetal “Julio Iranzo”. Jardín
Botánico de Valencia
• Departamento de Ecosistemas
Agroforestales. Universidad
Politécnica de Valencia
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................................................... 1
FIJACIÓN ................................................................................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................................................. 1
EXAMEN EN FRESCO........................................................................................................................................................ 1
CONCEPTO DE FIJACIÓN ................................................................................................................................................ 2
FIJADORES FÍSICOS ......................................................................................................................................................... 3
EL CALOR ........................................................................................................................................................................................ 3
EL FRÍO ............................................................................................................................................................................................ 3
LA CRIODESECACIÓN (LIOFILIZACIÓN)............................................................................................................................................. 3
INCLUSIÓN ................................................................................................................................................................. 9
INCLUSIÓN EN HIELO..................................................................................................................................................... 10
INCLUSIÓN EN PARAFINA .............................................................................................................................................. 11
CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES....................................................................................................................................................13
1
CARMÍN ACÉTICO.......................................................................................................................................................... 17
CARMÍN-VERDE IODO................................................................................................................................................... 18
FLOROGLUCINA ............................................................................................................................................................ 18
FUCSINA BÁSICA-VERDE DE METILO .............................................................................................................................. 18
FUCSINA BÁSICA-VERDE LUZ ........................................................................................................................................ 19
HEMALUM DE MAYER .................................................................................................................................................... 19
HEMATOXILINA FÉRRICA DE HEIDENHAIN....................................................................................................................... 20
LUGOL .......................................................................................................................................................................... 20
ORCEÍNA ACÉTICA ........................................................................................................................................................ 21
SAFRANINA-VERDE RÁPIDO .......................................................................................................................................... 21
SUDÁN III ...................................................................................................................................................................... 21
TIONINA FENICADA ....................................................................................................................................................... 22
VESUVINA ..................................................................................................................................................................... 22
COLORANTES................................................................................................................................................................ 23
AZUL DE ANILINA...........................................................................................................................................................................23
FABRIL ...........................................................................................................................................................................................25
FLOROGLUCINA ............................................................................................................................................................................26
GLICEROGELATINA........................................................................................................................................................................26
2
HEMALUN DE MAYER .....................................................................................................................................................................27
LUGOL ..........................................................................................................................................................................................28
ORCEINA ACETICA.........................................................................................................................................................................28
PICROFUCSINA ..............................................................................................................................................................................28
ROJO DE RUTENIO.........................................................................................................................................................................28
SAFRANINA ...................................................................................................................................................................................29
CLORO-IODURO DE ZINC:.............................................................................................................................................................31
ESPECÍFICAS. .............................................................................................................................................................31
ALMIDÓN ......................................................................................................................................................................................31
CROMOSOMAS ............................................................................................................................................................................31
FABIL: ............................................................................................................................................................................................32
HEMATOXILINA – PICROFUCSINA..................................................................................................................................................33
3
ESPORAS DE HONGOS .......................................................................................................................................................................35
POLEN ................................................................................................................................................................................................35
TRICOMAS ..........................................................................................................................................................................................35
ESTOMAS ...........................................................................................................................................................................................36
EPIDERMIS CERIFICADA...................................................................................................................................................................36
COLÉNQUIMA ...............................................................................................................................................................................37
ESCLERÉNQUIMA ...........................................................................................................................................................................37
VASOS CONDUCTORES.................................................................................................................................................................37
GLÁNDULAS PELTADAS..................................................................................................................................................................38
GLÁNDULAS SÉSILES......................................................................................................................................................................38
LENTICELAS....................................................................................................................................................................................38
ALMIDÓN ......................................................................................................................................................................................38
ALEURONA ....................................................................................................................................................................................38
PUNTEADURAS ..............................................................................................................................................................................39
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 40
4
INTRODUCCIÓN
Este manual expone en forma clara, sencilla e inmediata las técnicas que se siguen en el procesa-
miento histológico para la elaboración de preparaciones anatómicas, la observación y el registro
de los tejidos vegetales. Las preparaciones permanentes para estudios microscópicos son indispen-
sables como fuente de información básica, tanto en cualquier investigación botánica formal como en
la enseñanza, en un curso básico de botánica o en cursos más especializados o avanzados.
Todas las plantas están formadas por los mismos tejidos -dérmico, fundamental y vascular-, sin em-
bargo, la manera cómo están organizadas sus células dentro de cada uno es muy variable, haciendo
que las diferencias estructurales entre las plantas sean notables y, por lo tanto, los métodos histoló-
gicos para procesarlas sean variados.
FIJACIÓN
INTRODUCCIÓN
Antes de entrar en los detalles más significativos sobre los distintos métodos que existen para la
fijación de tejidos vegetales, es necesario resaltar que los métodos más sencillos y más prácticos son
los que no necesitan de la fijación, pero no siempre son posibles, ya que con frecuencia las muestras
se encuentran alejadas del laboratorio, la capacidad de trabajo también es limitada y por tanto
hay que recurrir a los métodos de fijación con mayor frecuencia de la que sería deseable.
EXAMEN EN FRESCO
Este método tiene la ventaja de una gran simplicidad y por otra parte no produce alteración alguna
en las muestras; en histología animal se presentan grandes inconvenientes para su uso, puesto que
sólo puede utilizarse, bien para organismos vivos de pequeño tamaño o bien para piezas sumergi-
das durante un tiempo limitado en líquidos fisiológicos (solución de Ringer, solución de Locke, solución
de Tyrode, etc.). Los vegetales presentan ventajas sobre los animales, ya que se pueden fácilmente
cultivar en el laboratorio o bien llevarlos desde el campo al mismo sin que los procesos de lisis se
presenten con la rapidez que ocurren en los tejidos animales.
Aun teniendo estas ventajas sobre los tejidos animales, con mucha frecuencia debe recurrirse en his-
tología vegetal al uso de fijadores, bien porque las muestras se recojan lejos del laboratorio durante
campañas botánicas más o menos amplias o porque los trabajos se prolonguen excesivamente debido
a largos tratamientos, por lo que es necesario recurrir a la fijación de las muestras a estudiar.
También queremos llamar la atención sobre las técnicas de fijación que se van a emplear y describir,
ya que se refieren únicamente a técnicas para microscopía óptica, obviando las de microscopía elec-
trónica, tanto de barrido como de transmisión.
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CONCEPTO DE FIJACIÓN
Se entiende por fijación toda manipulación sobre un ser vivo, o bien sobre parte de él, que tiene
por objeto mantener toda su arquitectura tanto estructural como química lo más inalterada posible,
de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas características que cuando dicho
ser o tejido estaban vivos. Es claro que la mayoría de la estructura celular se debe a la presencia
de proteínas y, por tanto, todo proceso de fijación debe tener en cuenta la naturaleza química de
éstas, de forma que el fijador no reaccione con las mismas. Es cierto que existen componentes muy
distintos, más o menos lábiles, que también se encuentran formando parte de la estructura celular,
pero son las proteínas las que nos van a reflejar fundamentalmente si un fijador es o no bueno. Por
otra parte, un fijador prepara también de alguna forma el tejido o la célula para la posterior
manipulación, bien en el proceso de inclusión, actuando como mordiente o como fijador del colorante
dependiendo de su naturaleza, por eso es importante la elección del fijador.
Por otra parte hay que distinguir bien entre fijador y conservador, ya que con frecuencia, y sobre
todo en histología vegetal, se tienen conceptos erróneos al respecto. Un conservador es aquella
sustancia, o bien fenómeno físico, que evita la autolisis cadavérica, pero que una vez eliminada su
acción, la muestra o la célula, quedan a merced de sus propios enzimas lisógenos y son, por tanto,
susceptibles a la autodestrucción. Son conservadores: el frío, y ciertos líquidos como los de Petit, de
Ripert, etc. Así pues, una pieza que se ha mantenido durante un tiempo en un conservador debe ser
fijada rápidamente antes de cualquier estudio o manipulación, ya que de no hacerse se corre el
peligro de que sufra graves alteraciones. Un fijador, por el contrario, inmoviliza y estabiliza los
elementos celulares, bien sea por precipitación de las proteínas y demás sustancias celulares activas,
ya sea mediante un bloqueo químico de su actividad, siendo estos fenómenos permanentes.
Para la elección de un fijador hay que tener en cuenta, además de lo señalado anteriormente, unas
características que son intrínsecas al mismo, como son la velocidad de penetración, la velocidad de
fijación y el coeficiente de endurecimiento, así como el efecto de retracción. Estos factores son de gran
importancia a la hora de elegir un fijador; sobre todo, en histología vegetal. Es muy importante el
coeficiente de endurecimiento y el efecto de retracción, ya que de por sí los tejidos vegetales son
frecuentemente duros y estos dos fenómenos contribuyen a una mayor elasticidad de los tejidos, con
el consiguiente posible perjuicio a la hora de manipularlos para obtener los cortes. Menos impor-
tancia tienen quizás el poder de penetración y la velocidad de fijación, ya que como se ha indicado
anteriormente los procesos de lisis en los tejidos vegetales son más lentos en términos generales que
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en los tejidos animales; en cuanto a la velocidad de penetración y de fijación, son muy distintas, ya
que un fijador puede tener una gran velocidad de fijación y un bajo poder o velocidad de pene-
tración o viceversa. Por tanto la elección de un fijador es un problema de suma importancia en
histología vegetal. Un fijador ideal sería aquel que tuviera una gran velocidad de penetración y
fijación y unos coeficientes de retracción y endurecimiento lo más bajos posibles.
Los fijadores que se usan para el tratamiento de los tejidos vegetales son prácticamente los mismos
que se utilizan en histología animal; las células vegetales presentan, sobre todo en la pared celular,
una estructura celulósica o bien una impregnación o sustitución de ésta por compuestos distintos como
la lignina, suberina, etc., que diferencia totalmente a los vegetales de los animales. El comporta-
miento de los fijadores al menos a este nivel es muy distinto; si a ello unimos que los estudios de los
efectos sobre las estructuras celulares vegetales son prácticamente nulos, nos encontramos con un
problema serio a la hora de elegir un fijador. En histología animal se saben la mayoría de los
efectos de retracción, endurecimiento, etc., que presentan cada uno de los fijadores utilizados, cosa
que no se conoce cuando se trata de tejidos vegetales. Únicamente la experiencia y los ligeros
conocimientos de química permiten al histólogo vegetal poder elegir un fijador que le ofrezca ciertas
garantías; desgraciadamente, estos conocimientos no están reflejados en los textos de técnicas his-
tológicas ni en los de histología vegetal.
Vamos a dar un listado de los fijadores más frecuentes y a discutir brevemente sus distintas carac-
terísticas. Los fijadores se pueden clasificar en dos grupos: fijadores físicos y fijadores químicos.
FIJADORES FÍSICOS
Son varios los fijadores físicos que usualmente se utilizan en histología, sobre todo por su simplicidad,
pero la mayoría de ellos debemos desecharlos, porque alteran gravemente la estructura de los
vegetales.
EL CALOR
Es el más antiguo y más utilizado de estos fijadores. Tanto en microbiología, como en frotis de células ani-
males, la fijación se hace a la llama, con lo que se obtiene una coagulación rápida de las proteínas y por
tanto su estabilización. Esta técnica no es recomendable cuando de se trata de tejidos vegetales, puesto que
produce retracciones importantes y muy desiguales en la paredes celulares.
EL FRÍO
Como anteriormente hemos mencionado, el frío (congelación), se ha tenido y se tiene como agente de fijación,
pero es realmente un agente conservador y por tanto no debe utilizarse como tal.
LA CRIODESECACIÓN (LIOFILIZACIÓN):
Se trata de congelar a una temperatura inferior a -50º C y eliminar el agua a una presión baja. Este método
puede ser muy efectivo, si después la pieza se incluye en parafina o plástico, pero es bastante complejo y
excesivamente caro; no produce deformaciones ni retracciones, ni tampoco endurecimientos de las muestras.
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Su inconveniente es el precio y lo engorroso que puede resultar el que, al manipular la muestra, no se rehi-
drate posteriormente.
FIJADORES QUÍMICOS
Existen numerosos fijadores químicos, unos simples, y otros que son mezclas de varias sustancias. Los más
reseñados en la bibliografía son:
• Acetato mercúrico
• Ácido acético
• Ácido crómico.
• Etanol
• Etanol-Glicerina-Agua (G.A.W.)
• Formaldehido
• Formaldehido-Alcohol
• Formaldehido-Propiónico-Alcohol (F.P.A.)
• Formol-Acético-Alcohol (F.A.A.)
• Mezcla Cromo-Acético-Formaldehido (C.R.A.F.)
• Mezcla Cromo-Acético.
ACETATO MERCÚRICO
ÁCIDO ACÉTICO
ÁCIDO CRÓMICO
Se utiliza en soluciones al 2%. Hay que tener precaución al usarlo, puesto que disuelve las láminas medias y
las celulosas. Después de una fijación de 1-2 horas, se debe sacar la muestra del mismo y pasarla a un
conservador. Es buen fijador si se toman las precauciones debidas.
ETANOL
El único alcohol que se puede usar como fijador es el absoluto y con ciertas reservas el de 96º. Se debe usar
junto con otros fijadores para potenciar la acción de los mismos, o como solución de otros fijadores, pero no
solo, ya que tiene poco poder de penetración, es un mal fijador de núcleos y mediocre de citoplasma, y
retrae excesivamente los tejidos. Más que un verdadero fijador, el etanol a baja concentración puede ser un
buen conservador.
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Fijador lento y conservador perecedero, máximo dos años de permanencia en la solución. No endurece; para
cortar por congelación debe lavarse la muestra en agua destilada un mínimo de cuatro horas.
FORMALDEHIDO
El formol se utiliza en concentraciones del 10% comercial. Es un fijador regular, práctico y fácil de manejar;
tiene el inconveniente de polimerizar los fenoles libres, que son muy frecuentes en los vegetales y que una
fijación prolongada los endurece excesivamente. No debe ser usado o se debe usar con ciertas precauciones
en tejidos muy lignificados.
FORMOL-ACÉTICO-ALCOHOL (F.A.A.)
• Alcohol etílico de 50-70º 90 mL
• Ácido acético glacial 5 mL
• Formaldehido 40% 5 mL
Buen fijador general para tallos, raíces y hojas. Sirve como conservador. Endurece las muestras.
FORMALDEHIDO-ALCOHOL.
• Alcohol etílico 96º 15 mL
• Agua destilada 10 mL
• Formaldehido 40% 1 mL
Fijador general y conservador para estudios anatómicos de material leñoso. Endurece las muestras.
FORMALDEHIDO-PROPIÓNICO-ALCOHOL (F.P.A.)
La misma fórmula del F.A.A. sustituyendo el ácido acético por propiónico. Mezcla recomendada
para briófitos y pteridófitos. Produce endurecimiento de los tejidos.
MEZCLA CROMO-ACÉTICA.
a) Débil:
b) Media:
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MEZCLA CROMO-ACÉTICO-FORMALDEHIDO (C.R.A.F.)
Solución a):
• Ácido crómico 1g
• Ácido acético glacial 7 mL
• Agua destilada 92 mL
Solución b):
• Formaldehido 40% 30 mL
• Agua destilada 70 mL
Ambas soluciones se deben mezclar en partes iguales inmediatamente antes de su uso y, tras una fijación de
12-24 horas, el material debe ser lavado en alcohol de 70º.
GLUTARALDEHIDO-PARAFORMALDEHIDO AL 5%.
Se trata de una variación del fijador de Karnovsky, ya que este es una mezcla de ambos componentes a una
concentración del 2.5%.
En primer lugar hay que preparar el paraformaldehido disolviendo en agua la cantidad suficiente para que
resulte una concentración del 10%, ello ha de hacerse en caliente y en agitación continua mediante un agi-
tador magnético, procurando que la temperatura no sobrepase los 70ºC; para la correcta disolución hay que
añadir unas gotas de KOH 1N. Al llegar a los 70ºC. Se observará que la disolución, que antes era turbia, se
torna rápidamente transparente. Se realizará el proceso en campana de extracción para no respirar los
vapores que resultan tóxicos.
Una vez frío el paraformaldehido se mezcla a un volumen igual de glutaraldehido al 10% en tampón, con lo
que la mezcla tendrá una concentración de ambos fijadores del 5%. La mezcla ha de guardarse en nevera
y puede mantenerse durante mucho tiempo.
El fijador se lleva al campo también en nevera portátil para asegurarnos que no se sobrepasen los 4ºC.
Concentraciones menores de esta mezcla dan lugar a resultados deficientes para la observación de cortes en
microscopía electrónica de transmisión. Ello se debe a que el contenido hídrico de las vacuolas es alto y al
penetrar el fijador, su concentración intracelular desciende considerablemente. De este modo estructuras que
rápidamente degeneran, como las membranas, no se aprecian con nitidez, por una deficiente fijación.
Hay otras razones por las que los tejidos vegetales no deben fijarse como los animales. Muchas veces las
plantas están cubiertas de sustancias céreas en sus cutículas que son hidrófobas e impiden la penetración del
fijador. Por otra parte el bajo contenido proteico de las células vegetales, en comparación con las animales,
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vuelve al glutaraldehido menos efectivo en sus enlaces cruzados con la proteína. Asimismo, la pared de las
células vegetales supone una barrera parcial a la penetración del mismo.
El tiempo de fijación en esta mezcla nunca debe ser inferior a 12 horas para las muestras que nosotros
manipulamos, aunque frecuentemente no se observa hundimiento de estas en el fijador hasta pasadas 20
horas. Podemos decir lo mismo que se indicaba para el fijador anterior en lo referente a la dificultad de
penetración por la naturaleza de las flores y los pelos hidrófobos; es recomendable, sobre todo para las
flores con un grado de madurez elevado fijar al vacío, esto supone una dificultad añadida al tener que
mantener las muestras a baja temperatura en nevera; utilizamos para ello recipientes herméticos en los que
se hace el vacío con una bomba de vacío manual y luego pasamos a nevera.
Hay que lavar el fijador, como máximo, a las 24 horas, para evitar el excesivo endurecimiento. El lavado se
lleva a cabo en tampón fosfato 1 molar a pH 7.2. Se pasan las muestras a un frasco con abundante tampón
y se hacen 5 cambios de ½ hora cada uno. En el tampón y en nevera podemos mantener las muestras durante
varios días sin que se aprecie ninguna alteración.
Sobre todo, si pretendemos hacer preparaciones para microscopía electrónica de transmisión, llevaremos a
cabo una post-fijación con tetróxido de osmio al 2% en tampón fosfato durante dos horas a temperatura
ambiente y en oscuridad total. Una de las características de la completa fijación es la de que el líquido
adquiere una coloración parecida al vino tinto, y el material está negro. El osmio torna de un color negro
todo contenido lipídico celular, resultando, además de fijador, un elemento de contraste que delata la pre-
sencia de lípidos.
Procedemos a lavar, tras la post-fijación, de nuevo con tampón fosfato, de modo análogo al caso anterior.
Conviene pasar las muestras cuanto antes a alcohol de 70º y proceder lo más pronto posible a la confección
de bloques.
ACLARAMIENTO Y BLANQUEADO
En histología vegetal y sobre todo cuando se trata de estudiar la anatomía, es preciso destruir el
contenido celular para dejar únicamente la arquitectura de las paredes. Este tratamiento es conocido
con el nombre de aclaramiento y se realiza pasando los cortes por un baño de hipoclorito sódico o
potásico. Con frecuencia se utiliza lejía comercial concentrada. El uso de lejía debe descartarse si
querernos realizar un trabajo fino, ya que ésta contiene gran cantidad de impurezas que puede
más tarde interferir en los procesos de tinción. El tiempo que el corte debe permanecer en hipoclorito
dependerá de la naturaleza del mismo: cuando los tejidos sean delicados (meristemos, hojas jóvenes,
etc.) el tiempo debe ser menor que cuando estos tejidos sean adultos y por tanto más resistentes.
Nuestra experiencia nos dice que 20 minutos es un tiempo medio excelente para la realización del
aclaramiento.
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2. Lavar con agua.
3. Neutralizar con ácido acético al 20% durante 10 minutos.
4. Lavar varias veces con agua destilada.
Los cortes después de aclarados están ya en disposición de ser teñidos por cualquier método.
HIDRATACIÓN
Siempre recomendamos que, a ser posible, se trabaje con material fresco o bien fijado, pero con
demasiada frecuencia hay que recurrir a material seco de herbario para trabajar. Es claro que una
vez prensado, el material vegetal sufre deformaciones que son irrecuperables, pero se puede estu-
diar rehidratándolo. Para rehidratar una muestra vegetal se coloca esta en una disolución de hipo-
clorito sódico o potásico al 10 % a una temperatura ambiente o bien, si se desea una hidratación
más rápida, puede realizarse en la estufa a una temperatura de 60º C; el tiempo de hidratación
será muy variable dependiendo fundamentalmente de la naturaleza y tamaño de la muestra. Es
muy importante controlar el tiempo para que los tejidos no se degraden por la acción del hipoclorito.
Otro método de rehidratación de muestras es utilizar una solución saturada de hidrato de cloral, a
temperatura ambiente y durante un tiempo aproximado de 12 horas, aunque este tiempo también
es orientativo y dependerá como siempre del tamaño y naturaleza de la muestra. El hidrato de
cloral tiene la ventaja de ser menos corrosivo que la lejía y además aclara muy bien los tejidos.
ACLARAMIENTO Y BLANQUEADO
Para poder estudiar los distintos elementos de los tejidos vegetales como cutícula, vasos conductores
y también la morfología de los elementos esqueléticos de los vegetales, se puede recurrir a una
maceración de los mismos, lo que nos permite su estudio aisladamente, esto unido al estudio anató-
mico de los cortes, tanto longitudinal como transversal, nos da una visión mucho más real y completa
de los constituyentes celulares de un vegetal determinado. Para realizar dichas maceraciones pode-
mos recurrir a varios métodos. Uno de los más usados es el:
MÉTODO DE JEFFREY:
Se trata de someter el material de la muestra previamente troceado en una solución a partes iguales de:
Modo de empleo:
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tinción posterior.
5. Sobre un tamiz muy fino se disgrega la muestra para individualizar los elementos, tomando la
precaución de sumergir éste en agua.
6. Recoger el agua del tamizado en un tubo de centrífuga.
7. Centrifugar la suspensión para sedimentar el material y decantar el agua sobrante.
8. Tinción.
9. Lavados sucesivos, centrifugando y decantando cada vez.
10. Montar.
INCLUSIÓN
La observación de los distintos tejidos, tanto vegetales como animales, con microscopio óptico viene
limitada por la opacidad de los mismos; para poder ver la estructura celular de un tejido y los
componentes de las mismas células es necesario por tanto obtener cortes que sean translúcidos. Por
muy habilidosa que sea una persona, jamás puede obtener a mano secciones tan finas como las que
se obtienen mediante aparatos especiales como son los microtomos.
La histología vegetal se ha nutrido esencialmente de las experiencias realizadas en los tejidos ani-
males y frecuentemente no se ha tenido en cuenta la distinta naturaleza de estos tejidos. La presencia
de una pared celular rígida y la concatenación general que ello supone, da a los tejidos vegetales
una particularidad a tener en cuenta a la hora de elegir un proceso de inclusión. Se utilizan en
general las mismas técnicas en un caso y en otro, por lo que muchas veces los resultados no son, ni
con mucho, los deseables, puesto que la respuesta frente a un mismo tratamiento en uno u otro tipo
de tejido es muy diferente.
Para poder manejar los tejidos fácilmente y poder cortar con los distintos tipos de microtomos que
existen, es necesario que el tejido o la muestra a cortar tenga un soporte, y que éste sea homogéneo,
por tanto es necesario no sólo que dicho soporte envuelva a la muestra, sino que penetre en su
interior y que además dicho soporte no obstaculice o interfiera lo mínimo posible en la arquitectura
de la célula y en la naturaleza química de la misma.
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aquí únicamente a mencionarlos y comentar algunas variantes a los métodos ya citados, así como a
una crítica de los mismos en lo referente a la histología vegetal.
Existen varios métodos de uso común, pero los que se utilizan con más frecuencia son:
Cada una de estas técnicas presenta ventajas e inconvenientes. Por este motivo discutiremos cada
una de ellas.
INCLUSIÓN EN HIELO
Un inconveniente que presentan los cortes por congelación, es la variabilidad en el grosor de los
mismos, si no se dispone de un criotomo de precisión motorizado. El grosor de los cortes, por otra
parte, no es un obstáculo en la histología vegetal, por lo menos en un principio, ya que el tamaño
de las células, mucho mayor que las animales, puede suplir esta desventaja.
Otra posible dificultad que puede surgir es la manipulación posterior de los cortes, ya que obliga-
toriamente se deben recoger sobre agua. Se ha recomendado el uso de pequeños pinceles para
manipular los cortes. Nosotros desaconsejamos la utilización de los mismos, puesto que por mucha
delicadeza que se tenga, la naturaleza de la estructura vegetal (tramas de paredes) puede ser
destruida fácilmente al manipularla con el pincel. Es preferible, para el mejor manejo de los cortes,
el uso, de pequeños tamices sobre los que se recogen los cortes, utilizándose los mismos para todo
proceso de tinción o tratamiento que a los mismos se quiera dar, así la manipulación de los mismos
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es mínima y, por tanto, también disminuye el riesgo de destrucción. Los cortes realizados por conge-
lación tienen una gran importancia, sobre todo por la posibilidad de observar el tejido “in vivo”. Por
tanto, las dimensiones, disposición, morfología, etc. de las células y de los tejidos son las reales, cosa
que no ocurre después de un proceso de inclusión en parafina, plástico u otro medio. No obstante,
para el estudio de un tejido es necesario utilizar más de una técnica. Por otra parte, los orgánulos
celulares, normalmente por rotura de la célula, se pierden; así difícilmente se pueden observar nú-
cleos o vacuolas en células que se han cortado mediante congelación, y mucho menos si los cortes
son finos.
Por otra parte la inclusión en hielo y los cortes realizados por congelación nos dan la posibilidad de
estudiar aquellos productos metabólicos solubles en los líquidos polares y apolares que son elimina-
dos de los tejidos cuando se utilizan otras técnicas de inclusión, como son los lípidos, las clorofilas,
etc. Cuando se requiere información de tipo histoquímico el mejor método es la obtención de cortes
por congelación.
INCLUSIÓN EN PARAFINA
Las parafinas son mezclas hidrocarburos saturados de cadenas que oscilan entre 22 y 28 átomos
de carbono. El punto de fusión depende del número de átomos de carbono y se encuentra entre 45
y 60 grados. Las mezclas de parafinas comerciales tienen un punto de fusión entre 54º y 56º C.
La técnica de inclusión en parafina es una perfusión de la misma en los tejidos para crear un medio
homogéneo, que permita la realización de los cortes de menor grosor con gran facilidad y una
precisión mayor que cuando los mismos se realizan por congelación. Como toda técnica, presenta
ventajas e inconvenientes; sobre todo es en esta modalidad de inclusión donde se pueden discutir
ciertos procesos que son válidos en histología animal pero que al aplicarlos a los tejidos vegetales
pueden originar alteraciones, a veces profundas, en las estructuras anatómicas e histológicas; el
primer problema que nos encontramos al incluir en parafina un tejido es la apolaridad de la misma;
para poder incluir el tejido se han descrito varios métodos de deshidratación, pero en general se
sigue, como en histología animal, la deshidratación por alcohol etílico en graduaciones crecientes
hasta llegar a alcohol absoluto.
La parafina y el alcohol etílico absoluto tampoco son miscibles, por lo que hay que sustituir éste por
un líquido apolar miscible con aquélla. Hay varios líquidos apolares como benceno, cloroformo, xi-
leno, etc., que se han descrito en todas las técnicas histológicas, pero que deben usarse con muchas
reservas, por las grandes retracciones y deformaciones que producen en los tejidos vegetales, alte-
raciones que no son homogéneas, puesto que cada uno de los distintos tejidos de una muestra a
cortar, reaccionan de forma muy distinta a la retracción debido al distinto grosor y naturaleza de
la pared celular. Nosotros sustituimos el benceno, xileno, etc., por acetato de isoamilo o bien miristato
de isopropilo; más frecuentemente el primero. Si la deshidratación se ha realizado correctamente,
la pieza a incluir se hundirá en el acetato. Si flotase sobre el mismo, hay que esperar 15 minutos y
si sigue flotando es que la deshidratación no se ha realizado correctamente, debiendo ser introdu-
cida la muestra de nuevo en alcohol absoluto.
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Los tiempos de deshidratación más habituales para una muestra que se va a incluir en
parafina son:
Después de tres baños de acetato de isoamilo, la muestra puede ser incluida en parafina, Histosec®,
Paraplast®, etc. Este proceso es quizá el que merezca mayor atención junto con el anteriormente
explicado. Los manuales de técnicas y los distintos trabajos sobre histología vegetal nos dan tiempos
muy dilatados de inclusión: mínimo de 6 horas. Los tejidos vegetales tienen una naturaleza muy
distinta a la de los animales, pero las técnicas de inclusión que se describen en los distintos manuales
han sido aplicadas a partir de las experiencias sobre tejidos animales; en algún caso, esta expe-
riencia es útil y sirve para el proceso de inclusión de vegetales, pero en la mayoría de los casos no
lo es, y a cada muestra vegetal hay que darle un tratamiento muy distinto dependiendo de los
tejidos que presente y de la disposición de los mismos. No se puede tratar de igual manera una
muestra que contenga tejidos lignificados o suberificados que otra que contenga grandes parénqui-
mas o grandes conductos aeríferos. Por tanto, lo más importante antes de realizar una inclusión es
conocer la naturaleza y la organización de la muestra a incluir, o por lo menos presuponerla. Los
cortes realizados con el microtomo de congelación nos pueden dar la pauta a seguir en el caso de
que se desconozca la organización de un vegetal determinado.
El calor es uno de los enemigos más importantes de los tejidos vegetales. La presencia de pared
celular y la distinta naturaleza que ésta puede presentar es la causa de que el calor, los fijadores,
los compuestos hidratantes y deshidratantes, el xileno, benceno, etc., produzcan en las paredes ce-
lulares retracciones muy importantes y no constantes, que pueden distorsionar en gran manera la
estructura anatómica de un vegetal. Ante los mismos agentes, en una sección, no todos los tejidos
responden igual: las deformaciones dependen entre otras cosas del grosor de la pared celular,
naturaleza de la misma, disposición de los diferentes tejidos, tiempo de actuación de los distintos
agentes, etc. Por tanto, si las deformaciones son variables, las interpretaciones que se dan son, con
frecuencia, erróneas.
Por tanto, para incluir una muestra vegetal en parafina, o bien en sucedáneos de la misma (Para-
plast®, Histosec®, etc.), es necesario calcular los tiempos mínimos, que pueden oscilar desde 35
minutos a varias horas.
Los tiempos de deshidratación pueden ser más o menos constantes para todos los tejidos, pero varían
mucho los tiempos de parafinación. Un tallo macizo, con mucho tejido esquelético (esclerénquima), o
de protección (peridermis), puede necesitar varias horas. La práctica nos irá diciendo cuales son los
tiempos más idóneos para los órganos o partes de órganos que estemos utilizando.
12
Lo más importante es comprender que no existen dos muestras vegetales o tejidos iguales y, por
ello, cada una se comportará de distinta forma. Con experiencia se calcula fácilmente los tiempos
que necesitan los distintos tejidos.
Se realiza de la misma forma que en histología animal: existen pinzas (Leukart) y recipientes especiales para
realizar bloques, pero lo más barato es confeccionar recipientes, de papel satinado o de aluminio, más o
menos cúbicos o en forma de paralelepípedo, dependiendo de las características de la muestra a incluir. Lo
más importante en la confección del bloque es la orientación que se da a la muestra, porque de ello va a
depender que el corte sea bueno o malo.
Para obtener los cortes o secciones a partir de bloque de parafina, se pueden utilizar dos tipos de microtomos
muy distintos. Microtomos tipo Minot, (Figura 3) que se caracteriza por ser móvil el bloque y fija la cuchilla,
o bien microtomos de deslizamiento, en los cuales la cuchilla es móvil y orientable, mientras que el bloque es
fijo.
DESPARAFINACIÓN E HIDRATADO:
Una vez pegados los cortes pueden, o bien almacenarse indefinidamente, o bien pasar a la desparafinación
y posterior hidratación y teñido de los mismos; para ello se utiliza el proceso inverso al realizado para la
inclusión con la variante de utilizar el xileno o el benceno para eliminar la parafina. En este punto del proceso
la utilización de xileno o benceno en los cortes no es tan importante como cuando se incluye en parafina, ya
que el corte se encuentra pegado sobre el porta.
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El proceso a seguir será el siguiente.
Si los colorantes se encuentran en disolución acuosa se realizarán todos los pasos. Es obvio que si los colorantes
a utilizar se hallan en disolución alcohólica o en disolventes apolares (esencia de clavo, etc.) no se llegará a
la hidratación.
Una vez hidratados, si conviene, se procederá con los cortes a la coloración más oportuna y de nuevo se
deshidratará para realizar el montaje permanente.
1. Tinción
2. Lavado con agua destilada
3. Deshidratación mediante goteo de etílico absoluto
4. Aclarado con creosota, aceite de clavo, xilol, etc.
5. Montaje permanente con Bálsamo de Canadá, Entellán®, Euparal®, etc.
En algunas ocasiones puede darse la circunstancia de que no se desee pasar las secciones realizadas por
disolvente alguno como alcohol, xileno, etc., bien por la tinción o bien porque histoquímicamente no es acon-
sejable, y se quiera montar de forma permanente o semipermanente un corte, para ello es necesario recurrir
a la utilización la glicerogelatina o glicogelatina.
INCLUSIÓN EN RESINAS
En el mercado existen muchas resinas pero, para incluir tejidos vegetales, no todas dan buenos resultados;
nosotros, después de probar varias, hemos constatado que las más adecuadas para nuestros intereses son la
LR White® y la Spurr®
Se trata de resinas que penetran muy bien, son miscibles con el etanol y no totalmente hidrófobas en el caso
de la LR White®. Pero lo que las hacen idóneas es la gran facilidad con que penetran los colorantes una vez
polimerizadas.
Este proceso de inclusión puede hacerse al vacío, lo que permite, sobre todo en las muestras de tamaño
grande, una infiltración más rápida y completa.
14
PARA LOS BLOQUES DE LR WHITE.
Con los bloques incluidos en plástico hay que utilizar un ultramicrotomo, con el que se consiguen tanto cortes
semi-finos (de 0.5 a 3 µm de grosor) como cortes ultra-finos (de 30 a 100 nm de espesor). Los primeros para
microscopía óptica y los segundos para microscopía electrónica.
Para los cortes se deben utilizar cuchillas de vidrio o de diamante, las primeras son mucho más económicas
que las segundas, pero tienen una corta duración (30 a 40 cortes).
Bajo el filo de la cuchillas se fija, con parafina fundida, una balsita plástica que se llena hasta el borde con
agua destilada y un tensioactivo (una o dos gotas de detergente por litro de agua) que sirve para recoger
los cortes que flotan sobre ella extendidos.
Una vez colocados los cortes pasamos el porta a una plancha de calor a 65º, con ello logramos que se
evapore el agua y que los cortes queden pegados sobre el vidrio y puedan manipularse en la tinción. Si el
agua evapora a temperatura ambiente o a temperaturas inferiores a la indicada los cortes no quedan bien
pegados, y al manipularlos se desprenden. De igual modo, cortes de grosor superior a los 3 µm no suelen
pegarse bien.
El material incluido en plástico no debe sufrir más manipulación. Normalmente las resinas que se utilizan no
interfieren en la visión microscópica de los tejidos, por lo que no hay que eliminarlas como ocurre con la
parafina.
A continuación comentaremos algunas características de los colorantes más usados en histología ve-
getal.
Este colorante se utiliza, como el azul de lactofenol, para poner de manifiesto las cribas de los
elementos de los tubos del floema, ya que tiene afinidad por la calosa. Nuestra experiencia nos
hace inclinamos más por este procedimiento que por aquel por varias razones: en primer lugar
admite una doble coloración de contraste, que puede ser la safranina; en segundo lugar se puede
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deshidratar y montar de forma permanente y los inconvenientes no son mayores que los que presenta
la coloración del azul de lactofenol. Es más fácil de manejar que aquel.
Modo de empleo:
Se colorean en azul tanto la celulosa como la calosa, aunque el citoplasma de los tubos cribosos
puede también aparecer teñido si nos excedemos en el tiempo de permanencia en azul de anilina.
AZUL DE LACTOFENOL
Este colorante tiene afinidad por la calosa, y se usa por tanto para poner de manifiesto aquellas
paredes celulares en las que se deposita la misma: placas cribosas del floema y paredes celulares
de ciertos hongos. No es una coloración de resultados espectaculares ni mucho menos y es necesario
que la calosa se encuentre en cierta cantidad para que se ponga de manifiesto, por tanto será difícil
poner de manifiesto cribas jóvenes. Por otra parte se usa este colorante para preparaciones extem-
poráneas que se desechan una vez observadas al microscopio.
Modo de empleo:
Si se desea una preparación permanente añadir al cubre una gota de glicerogelatina y sellar con
laca o parafina.
AZUL DE METILENO
El azul de metileno en soluciones del 1% y 0.1% se utiliza con frecuencia para poner de manifiesto
las paredes celulares de naturaleza celulósica. Se utiliza sobre todo en preparaciones extemporá-
neas. Es un colorante poco limpio y tiñe muy desigualmente, por esto se recomiendan las soluciones
más diluidas.
Modo de empleo.
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puede realizar una coloración de contraste.
Es una de las coloraciones más espectaculares, pues con tan solo dos colorantes aparecen cuatro
colores distintos en los cortes y se pueden apreciar diferencialmente distintos tejidos. Tiene el incon-
veniente de que el rojo de rutenio es un colorante no permanente; hay que prepararlo en el momento
de usarlo, dura pocos días y es relativamente caro.
Modo de empleo:
Con esta doble coloración, el floema aparece teñido de verde, el esclerénquima en violeta, el xilema
en azul y los parénquimas más o menos rosados.
CARMÍN ACÉTICO
Modo de empleo:
1. Hidrólisis enzimática o bien ácida de las láminas medias y paredes celulares de los meriste-
mos, anteras, etc.
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CARMÍN-VERDE IODO
Una coloración clásica de histología vegetal, que da también buenos resultados, aunque su prepa-
ración es más engorrosa y los resultados comparables a los que se han reseñado para la safranina-
verde rápido; tiene la ventaja de que la tinción es permanente.
Modo de empleo:
Los elementos lignificados se colorean en un azul verdoso y el resto de los tejidos en rojo carmín.
FLOROGLUCINA
Modo de empleo:
a) Sistema 1
b) Sistema 2
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Modo de empleo:
Esta doble tinción, que es menos usada en histología vegetal; tiene la ventaja de colorear bien la
cutícula y los pelos de la epidermis.
Modo de empleo:
HEMALUM DE MAYER
Es un colorante clásico; se ha utilizado con frecuencia para teñir en histología vegetal. Colorea la
celulosa y los núcleos, debe utilizarse sobre todo en tejidos jóvenes y como coloración de contraste
la safranina.
Modo de empleo:
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HEMATOXILINA FÉRRICA DE HEIDENHAIN
Se utiliza sobre todo en histología vegetal para teñir meristemos y es una buena coloración para
la observación de mitosis en los mismos. También se pueden observar mitocondrias. Es una tinción
muy engorrosa y difícil de realizar pero una vez dominada puede dar excelentes resultados. Se
puede realizar una coloración de contraste con safranina o verde Luz.
Modo de empleo:
LUGOL
Se utiliza de forma extemporánea para el reconocimiento del almidón, que toma una coloración
azul-morada intensa. También se puede utilizar para teñir los tejidos lignificados de forma perma-
nente; éstos se colorean de amarillo intenso.
Modo de empleo:
Para observar granos de almidón es suficiente con recubrir de Lugol el corte, poner un cubreobjetos
sobre el mismo y observar al microscopio. Los granos de almidón se almacenan en distintos tejidos
en la planta (colénquima, distintos parénquimas, periciclo, células oclusivas, etc.), siendo de gran
interés para el reconocimiento de distintas especies, puesto que dentro de un mismo género, cada
una de las especies puede almacenar el almidón de forma distinta.
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2. Lavar con agua.
3. Deshidratar con alcohol absoluto.
4. Aclarar.
5. Montar con bálsamo de Canadá o similar.
Los tejidos lignificados y suberificados se tiñen de un amarillo intenso, mientras que los tejidos celu-
lósicos aparecen coloreados de amarillo pálido.
ORCEÍNA ACÉTICA
Se utiliza como el carmín acético para la tinción de cromosomas por aplastamiento. Da mejores
resultados que éste y es más fácil de preparar.
Modo de empleo:
Esta doble coloración es muy sencilla de realizar y de muy claro contraste, pues la safranina, que
tiene afinidad muy marcada por la lignina y algo menor por la suberina, tiñe de rojo intenso los
tejidos que presentan lignina, como es el xilema y las distintas células que forman los tejidos esque-
léticos de la planta, mientras que el verde rápido colorea el resto de los tejidos de un verde a un
verde-azulado o bien azul, dependiendo del tratamiento que se le haya dado al corte anteriormente.
Modo de empleo:
Esta doble tinción presenta el inconveniente de que se decolora a lo largo del tiempo, sobre todo el
color del verde rápido; su duración como máximo es de 3 a 4 años. Esta decoloración puede evitarse
en parte si las preparaciones se mantienen al abrigo de la luz y a temperatura adecuada.
SUDÁN III
Es un colorante que tiene afinidad por los compuestos lipídicos, por lo cual se utiliza fundamental-
mente para colorear la cutina y la suberina.
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Método de empleo:
No es una preparación permanente; no montar en bálsamo ya que se decolora. El Sudan III tiñe de
rojo-anaranjado la cutícula y las partes lipófilas de los cortes. Puede completarse la coloración con
otro colorante de contraste.
TIONINA FENICADA
Es un colorante poco utilizado en histología vegetal, aunque los resultados son muy satisfactorios; se
puede realizar una buena coloración de contraste con rojo de rutenio.
Modo de empleo:
Los tejidos lignificados se tiñen de un color azul morado intenso, mientras que los no lignificados
aparecen de color púrpura o rojo; no es una tinción permanente ya que después de montadas, las
preparaciones se decoloran con el tiempo.
VESUVINA
Tiñe de color pardo-amarillento la celulosa. Es una coloración delicada, pero sucia si no se tiene la
precaución de lavar abundantemente en agua. Se puede utilizar como tinción de contraste tanto
safranina como el verde luz, que teñirán las partes lignificadas del corte. Es una tinción excelente
por si sola para colorear la epidermis.
Modo de empleo:
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PREPARACIÓN DE COLORANTES Y OTROS REACTIVOS
Composición:
• Acetato mercúrico 1 g
• Ácido acético 5 mL
• Agua destilada 1000 mL
ALBUMINA DE MAYER
Composición:
Se toman dos o tres huevos y se separa la yema cuidadosamente. Las claras se baten a punto de nieve; una
vez llevadas hasta el punto de nieve se filtra durante varias horas. Se mezcla a partes iguales con glicerina
y se le añade unos cristales de timol o fenol para evitar el ataque bacteriano. Agítese bien la mezcla antes
de usarse.
COLORANTES
AZUL DE ANILINA
Composición:
Preparar en frío.
AZUL DE LACT0FEN0L
Composición:
• Fenol 0.1 g
• Ácido láctico 8 mL
• Agua destilada 10 mL
• Glicerina 20 mL
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• Azul de anilina (C.I. 42755) 0.5 g
Se disuelve calentando ligeramente el fenol, el ácido láctico, el agua destilada y la glicerina; se deja enfriar
y se añade el azul de anilina. Se deja reposar durante 24 horas. Se filtra y guarda en botella de color
topacio.
AZUL DE METILENO
El azul de metileno se prepara en frío a distintas concentraciones dependiendo del uso que se quiera dar.
Las dos más frecuentes son:
Composición:
O bien:
AZUL DE METILENO-ALUMBRE
Composición:
Disolver primeramente en frío el alumbre potásico en agua destilada. Una vez disuelto el alumbre se añade
el azul de metileno.
Composición:
Disolver al Azul de Metileno en el agua calentada a 50ºC; posteriormente, añadir los otros ingredientes.
Filtrar.
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CARMIN ACETICO
Composición:
Se disuelve el carmín en ácido acético al 45% y la disolución se calienta hasta ebullición durante una hora,
teniendo la precaución de refrigerar continuamente los vapores para no variar la concentración; esto se
consigue calentando la mezcla en un Erlenmeyer cerrado mediante un tapón de goma perforado a través
del cual se pasa un serpentín de refrigeración.
Composición:
Se disuelve en caliente el alumbre en agua se añade el carmín y se mantiene en caliente sin llegar a ebullición
durante una hora, para lo cual es necesario colocar sobre Erlenmeyer un refrigerante, para evitar que varíe
la concentración. En cualquier caso se enrasa hasta el volumen primitivo con agua destilada.
CARMIN ALUMBRE
Fórmula 2 (Johansen)
Composición:
Se procede para su preparación como en la fórmula anterior. Por la bibliografía consultada, y por los resul-
tados obtenidos después de utilizar ambos, nosotros nos inclinarnos por el uso del primero.
FABRIL
Composición:
a) SOLUCIÓN A
• Azul de anilina 0.5 g
• Lactofenol 100 mL
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b) SOLUCIÓN B
• Fucsina básica 0.5 g
• Lactofenol 100 mL
c) SOLUCIÓN C
• Yodo 0.3 g
• Yoduro potásico 0.6 g
• Lactofenol 100 mL
Se mezclan:
• Solución A: 80 mL
• Solución B: 20 mL
• Solución C: 100 mL
(la conservación es indefinida)
FLOROGLUCINA
Composición:
• Floroglucina 8 g
• Alcohol 96º 100 mL
Composición:
• Fucsina. básica 1 g
• Ácido fénico 5 g
• Alcohol etílico 96º 10 mL
Mezclar en un mortero hasta conseguir un homogeneizado completo; una vez logrado, añadir lentamente:
• Agua destilada 90 mL
Existen en el mercado formulaciones de Fucsina básica según Ziehl que evitan su preparación en laboratorio.
GLICEROGELATINA.
Composición:
• Gelatina 7 g
• Agua destilada 42 mL
• Glicerina 50 mL
• Ácido fénico 1 g
Calentar a baño María la gelatina, el agua destilada y la glicerina, hasta conseguir una disolución homogé-
nea; añadir seguidamente el ácido fénico y filtrar. Siempre que se use debe ser calentada a baño María y
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mantenerla en caliente, ya que se solidifica a temperatura ambiente.
HEMALUN DE MAYER
Composición:
Se disuelve el sulfato alumínico potásico (alumbre potásico) en 1 litro de agua destilada a temperatura
ordinaria; una vez disuelto, se le añade la Hematoxilina y el iodato sódico. Este último se utiliza para la
maduración rápida, pues es un oxidante que pasa la Hematoxilina a hematina. Este colorante presenta un
color violáceo intenso cuando está maduro.
Una variante de esta fórmula es el Hemalun ácido. Para obtenerlo se añade a la fórmula anterior:
• Hidrato de cloral 50 g
• Ácido cítrico 1 g
El Hemalun ácido da una coloración nuclear más precisa y se conserva mucho mejor.
Mordiente:
El sulfato amónico férrico presenta una coloración violeta claro; no confundir con el sulfato ferroso amónico o
sal de Mohr, que presenta cristales verdes, ni tampoco utilizar los cristales alterados de sulfato alumínico
férrico (cuando éste se ha alterado y presenta cristales amarillentos); seleccionar cuidadosamente los cristales
que presenten una coloración violeta pálido.
Colorante:
• Hematoxilina 1 g
• Alcohol de 90º 10 mL
Una vez disuelta la Hematoxilina en el alcohol de 90º añadir agua destilada hasta completar 100 mL de
colorante.
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LUGOL
Composición:
Los 0.5 g de Iodo se disuelven en unas gotas de alcohol; todo ello es llevado hasta 25 mL con agua destilada,
a la que se añade yoduro potásico hasta saturación. Este reactivo se halla comercializado en el mercado a
concentraciones variables.
ORCEINA ACETICA
Composición:
• Orceína 1-2 g
• Ácido acético 45 mL
Se disuelve la orceína en caliente a 60º C en ácido acético, tomando las mismas precauciones que en el
proceso de preparación del carmín, para evitar la evaporación del acético. Una vez enfriada la disolución,
añadir:
PICROFUCSINA
ROJO DE RUTENIO
Composición:
Esta solución, como se ha dicho anteriormente, hay que prepararla inmediatamente antes de su uso, dado
que es inestable.
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SAFRANINA
Composición:
En manuales, tanto de histología animal como vegetal, figuran preparados con fórmulas distintas, tanto en las
concentraciones de colorante como en la de disolventes (Martoja, 1970; Purvis-Collier-Walls 1966; Johansen
1968; Gabe, 1968; etc.). Nuestra experiencia es que, a concentraciones mayores de colorante, éste precipita
fácilmente, siendo poco limpias las tinciones; y el exceso de colorante conlleva también un exceso de colora-
ción.
SUDAN III
Composición:
Se trata de una solución saturada de Sudán III en alcohol de 70º, ya que éste es insoluble en agua. La solución
se prepara en caliente.
TIONINA FENICADA
Composición:
• Tionina 1 g
• Fenol 2.5 g
• Ácido acético glacial 20 mL
• Agua destilada 400 mL
Preparar en frío.
VERDE YODO
Composición:
Preparar en frío.
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VERDE LUZ
Composición:
Sustituir el agua destilada por alcohol etílico de 96º para la solución alcohólica.
VERDE RAPIDO
Composición:
Composición:
Preparación:
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TINCIONES TEMPORALES
CLORO-IODURO DE ZINC:
ESPECÍFICAS.
ALMIDÓN
Dejamos actuar el Lugol sobre el corte, en el porta (tinción progresiva) hasta que los cortes adquieran
una tonalidad violácea. Se lava con agua destilada y se monta con una gota de agua.
La observación de raspados montados en agua, sin tinción previa, jugando con el diafragma se
observa muy bien el hilio y las líneas de crecimiento. Lo mismo sucede al observarlos con luz polari-
zada, lo que da unos resultados muy espectaculares.
CROMOSOMAS
Los ápices de cebolla, ajo, o habas secas puestas a germinar, son un buen material para observar
los cromosomas de las células en mitosis de los meristemas.
1. Previamente se deben introducir los ápices (de 2 mm de longitud) en una solución de HCl 0.1
M.
a. Esta solución con los ápices se pasa a la estufa a unos 60ºC durante 10 o 15 min.
Con ello conseguimos eliminar la lámina media de las paredes celulares para que se
desagreguen con facilidad.
2. Lavamos sumergiendo en agua destilada tres cambios de 0.5 min cada uno.
3. Pasamos los ápices a orceína acética reciente, y los introducimos con el colorante en la estufa
a 60º durante 4 o 5 min.
31
4. Se pasa el ápice a un porta, con una gota del mismo colorante, se tapa con el cubre y se
presiona este con el dedo para aplastar el ápice y disgregar las células del mismo (Squash).
5. Esta preparación puede hacerse permanente, para ello se congela durante un 4 o 5 días, se
saca del congelador y, estando la muestra congelada, se separa el porta del cubre, con
precaución. Se vierte alcohol absoluto, para deshidratar; se cubre con xileno y se tapa con
el cubre al que se le ha agregado una gota de bálsamo de Canadá o similar.
FABIL:
Resultados:
• Celulosa Rojo
• Lignina Amarillo
• Núcleo y cloroplastos Rojo
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HEMATOXILINA – PICROFUCSINA (DE DELAFIELD O DE FRIELANDER)
1. Se lava 10 min en agua corriente ya que las sales, especialmente el litio, del agua corriente
hacen virar la hematoxilina a un color violeta.
2. Se pasa 10 min a picrofucsina
3. Se lava 3 o 4 veces en alcohol de 96º, hasta que salga limpio.
4. Se deshidrata con alcohol absoluto.
5. Se aclara con xileno y se monta con cualquier medio de montaje.
Resultados:
• Celulosa Azul
• Lignina Amarillo
• Núcleos Azul
• Cloroplastos Rojo
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ESTRUCTURAS VEGETALES DE LAS CUALES, PARA SU ESTUDIO, NO ES
NECESARIO OBTENER CORTES
Material tal como algas unicelulares o filamentosas, esporangios de helechos, hongos y setas, granos
de polen, tricomas, epidermis arrancadas de hojas, etc. Pueden observarse directamente al micros-
copio poniéndolos con una gota de agua entre porta y cubre. Algunas de las estructuras comentadas
tienen una coloración propia (esporas, polen, tricomas) que permite verlas fácilmente. A las otras
(diatomeas y diversas algas unicelulares, etc.) será conveniente darles el máximo contraste posible,
mediante el cierre del diafragma y haciendo, en algunos casos una iluminación oblicua.
También es interesante la observación, en vivo, de algunos orgánulos celulares; son materiales pro-
picios para la observación de cloroplastos, los pelos estaminales de Tradescantia o bien las hojas de
Elodea, en las cuales, al ser puestas entre porta y cubre con una gota de agua, se pueden observar
los movimientos de ciclosis de los cloroplastos, arrastrados por corrientes citoplasmáticas.
Si se desea obtener preparaciones permanentes de este tipo de materiales, en algunos casos hay
que proceder a una fijación previa mediante alcohol etílico de 70º o de formol al 6%, y seguida-
mente escoger el tipo de montaje:
DIATOMEAS
Podemos partir de una gota de agua dulce o marina, que tras ser observada directamente, nos
haya permitido ver que tenía algas de este tipo, o bien muestras de fitoplancton, obtenidas con res,
que previamente se eluirán en una gota de agua.
Se deja secar sobre el porta, y cuando se haya secado completamente se añade una gota de
bálsamo.
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ESPORANGIOS DE HELECHO
Raspamos delicadamente los soros de un helecho tierno o seco sobre una gota de goma arábiga.
Esparcimos el material con una aguja enmangada.
Se deja secar la goma arábiga y se coloca una gota de bálsamo de Canadá para cubrir, acto
seguido con el cubre.
Al hacer la observación microscópica, veremos esporangios: Unos enteros, los otros rotos; así como
esporas dentro de los esporangios o bien libres. Estas últimas hay que verlas a grandes aumentos.
ESPORAS DE HONGOS
Si el material es fresco, es necesario disgregar las laminillas sobre un portaobjetos, dentro de una
gota de goma arábiga, y seguir la técnica descrita.
Si el material es seco, hay que dejar los trozos de láminas dentro de amoníaco durante unos minutos
(5 o 10), con ello se hinchan. Seguidamente se lavan con agua abundante y se procede a montarlos
como en el caso anterior.
POLEN
Para el estudio del polen, este debe ser previamente acetolizado previamente (Erdtman, 1969), así
se consigue eliminar el contenido celular y la intina del grano de polen, lo que hace fácil la obser-
vación de la esporodermis. Esta técnica se lleva a cabo sobre portaobjetos según el protocolo si-
guiente:
Los granos de polen suelen tener una pigmentación variable de la exina por lo que no es necesario
teñirlos.
Es recomendable la observación de granos de polen de pino por los flotadores que tiene, así como
los de calabaza, por su morfología y la observación de los poros germinativos operculados.
TRICOMAS
Los tallos y las hojas están cubiertas, a menudo, de pelos, más o menos abundantes, extraordinaria-
mente polimorfos, con un gran valor en taxonomía. Pueden ser pelos peltados, estrellados, escuami-
formes, etc.
Su estudio nos permite comprobar, una vez más el elevado grado de polimorfismo celular.
35
Cabe escoger, como material de estudio, plantas pubescentes, velludas; Sus hojas y tallos se rascan
suavemente, y se puede hacer un montaje al aire o con el método de la goma arábiga y el bálsamo
de Canadá, antes citado.
No suele ser necesaria la fijación, ya que los tricomas suelen estar formados por células muertas.
Son especialmente curiosos los tricomas de Eleagnus angustifolia, Olea europaea, Quercus
sp., Lavandula sp., Cistus clusii, C. albidus...
ESTOMAS
Es particularmente interesante el estudio de las epidermis foliares. Para ello basta con arrancar con
cuidado la epidermis de las hojas; las paralelinervias (monocotiledóneas) nos permiten hacerlo bas-
tante bien, también es fácil arrancar la epidermis de las hojas de lechuga en su zona central.
1. La epidermis arrancada se pasa a etanol de 70º para su fijación, su delgadez hace que
basten 10 min para completar el proceso.
2. Conviene teñir, en vidrio de reloj con hematoxilina al 1%, azul de metileno al 1%, violeta de
genciana al 1.5 %, o cualquier otro colorante nuclear y de la celulosa, durante 5 min.
3. Se lava sumergiendo en un tubo con agua destilada durante 5 min.
4. Se contrasta tiñendo con eosina 5 min, y se vuelve a lavar durante otros 5 min.
5. Pasamos la muestra extendida al porta y cubrimos con etanol absoluto, dos veces, para
deshidratar. Se cubre inmediatamente con xileno y se coloca el cubreobjetos con una gota
de bálsamo de Canadá.
EPIDERMIS CUTINIZADA
EPIDERMIS CERIFICADA
EPIDERMIS MINERALIZADA
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EPIDERMIS SUBERIFICADA
PARÉNQUIMA CLOROFÍLICO
• Hojas:
o En el haz, parénquima en empalizada.
o En el envés, parénquima de células redondeadas
• Tallos: Normalmente bajo la epidermis hay una o dos capas de colénquima, y todo seguido
viene el parénquima clorofílico de células redondas.
COLÉNQUIMA
• Hojas: Poco frecuente, aunque se puede ver en los nervios centrales de Ficus y Rhamnus.
• Tallos: Muy frecuente, acostumbra a situarse bajo la epidermis formando una o dos capas.
Los tallos festoneados suelen presentar en cada saliente acúmulos de colénquima de tipo
periférico o de tipo angular. Son buenos los tallos de perejil, apio, ortiga...
ESCLERÉNQUIMA
• Hojas: Casi nunca; en la hoja de pino, bajo la epidermis, hay una capa de esclerénquima
bien desarrollada. También hay entre la epidermis y los haces conductores de las monocoti-
ledóneas en general. En el nervio central de la hoja de magnolio encontramos un magnífico
anillo de esclerénquima envolviendo a los haces vasculares.
• Tallos: Muy frecuente bajo la epidermis (hinojo) o bien entre los vasos leñosos, donde constitu-
yen una franja continua (vid). En general podemos afirmar que los haces vasculares de la
mayoría de los vegetales suelen ir acompañados de tejidos esqueléticos protectores: colén-
quima y esclerénquima.
CÉLULAS PÉTREAS.
• Hojas: No suele ser frecuente, podemos verlas en Camelia japónica, Cephalotaxus, y en frutos
carnosos tales como la pera y el membrillo.
• Observando detenidamente de las paredes y contrastando con el diafragma, es fácil ob-
servar los plasmodesmos de estas células petrosas.
VASOS CONDUCTORES.
• Hojas, tallos y raíces.
o Son interesantes las secciones transversales de plantas de hojas no paralelinervias ya
que nos permiten ver en el mismo corte cortes longitudinales y transversales de los vasos.
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o Los cortes longitudinales de los tallos y peciolos, especialmente los de las cucurbitáceas,
son muy interesantes para ver la morfología de los vasos del xilema (espiralados, ani-
llados, punteados, escalariformes, etc.), así como para poder ver las cribas de los vasos
de floema, sobre todo al teñirlos con el azul de anilina o el azul de lactofenol.
CONDUCTOS RESINÍFEROS
• Hojas y tallos de Pinus sp. y Abies sp.
CONDUCTOS ESENCIALES
• Tallos y hojas de plantas aromáticas (Rosmarinus sp., Lavandula sp., Petroselium sativum ...)
BOLSAS DE ESENCIA
• Hojas de naranjo, limonero, eucaliptus...
GLÁNDULAS PELTADAS
• Epidermis de hojas y tallos jóvenes de Rosmarinus sp., Lavandula sp., Cistus clusii, etc.
GLÁNDULAS SÉSILES
• Epidermis de hojas y tallos jóvenes de Rosmarinus sp, Pelargonium sp....
CÁMARAS ESTOMÁTICAS
• Cortes transversales de hojas de Cycas revoluta, Nerium oleander.
LENTICELAS
• Epidermis suberificada de tallos, especialmente rosales y patata.
ALMIDÓN
• Tubérculos y otros órganos de reserva: patata, zanahoria, plátano...
ALEURONA
• Simientes de ricino
INCLUSIONES CRISTALINAS
• Cistolitos: Cortes de hojas de Ficus sp., Parietaria officinalis, Urtica dioica...
• Drusas de carbonato y oxalato cálcico: Hojas, tallos y raíces de Magnolia sp., Lonicera sp.,
Vitis sp., Cistus sp., Rhamnus alaternus...
• Rafidios: Hojas, tallos y raíces de Vitis vinifera, Ophris sp.
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PUNTEADURAS
En las paredes celulares de la médula de sauco (Sambucus nigra), de Ruscus aculeatus, etc.) Encon-
traremos las punteaduras simples. Para observar las areoladas, hay que recurrir a los cortes de
madera de coníferas en donde son especialmente abundantes.
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BIBLIOGRAFÍA
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