Posgrado

 Binacional  en  Ciencias  de  la  Visión  

Técnicas  de  Bioquímica  y  Biología  

molecular  

14092017  
Genaro  Vázquez  Victorio  
¿Cómo aislar una proteína?

•  Detergentes iónicos y no iónicos

¿Cómo aislar una proteína?

•  Concentración micelar crítica (CMC)

Inhibidores de proteasas
•  PMSF
•  Inhibidor de proteasas dependientes de serinas
(une covalentemente). Vida media de 30 a 110 min.
ALTAMENTE TÓXICO.
•  Leupeptina
•  Inhibidor de proteasas de Cys, Ser y Thr. Inhibidor
competitivo del estado de transición.
•  Inhibidor de tripsina de soya
•  Inhibidor de serin proteasas. Une fuertemente al
sitio activo.
•  Pepstatina
•  Inhibidor de aspartil proteasas. Péptido que une al
sitio activo.
Inhibidores de fosfatasas
•  NaF
•  Inhibidor de Ser/Thr fosfatasas
•  Ortovanadato de sodio (Na3VO4)
•  Inhibidor de fosfatasas de tirosina.
•  Pirofosfato de sodio (Na4P2O7)
•  Inhibidor de fosfatasas Ser/Thr
•  Beta-glicerofosfato
•  Inhibidor de fosfatasas de Ser/Thr.
•  EDTA
•  Coordina iónes divalentes (Ca2+/Mg2+).
•  NaCl (150mM)
•  Fuerza iónica de la solución.
Las  proteínas  pueden  ser  separadas  por  su  masa;  son  muy  similares  
en  densidad  si  no  recibieron  una  modificación  postraduccional.  
¿Cómo aislar una proteína?
•  Centrifugación diferencial
•  Centrifugación por
gradientes de densidad
Polimerización de Poliacrilamida

Formación  de  
radicales  libres  

Entrecruzamiento  
Gelificación de Agarosa

Por  debajo  de  los  35  oC  la  

agarosa  gelifica.    
 
Bromuro  de  e?dio  se  
exita  con  UV.  
 ¿Cómo aislar una proteína?

•  Electroforesis. Es una técnica que

se usa para separar una mezcla
de proteínas bajo la influencia de
un campo eléctrico.
•  La velocidad de migración
depende de la razón masa:carga.

•  Electroforesis de acrilamida. SDS

desnaturaliza las proteínas.

•  Dithiothreitol (DTT). Actúa en pH

debajo de 7. 2-mercaptoetanol

•  Electroforesis discontínua. Iones

Cl- y glicinato.
 ¿Cómo aislar una proteína?

•  Elelctroforesis de dos
dimenciones.

•  Se desnaturalizan las proteínas

con urea (8M). Y se usa
poliacrilamida con anfolitos.

•  Dentro del campo eléctrico se

establece un gradiente de pH.

•  Proteínas cargadas dejan de

migrar en su punto isoeléctrico.
Cromatografía líquida
•  Se basa en la interacción de moléculas en solución con una
superficie sólida.
•  Generalmente, se usa perlas empaquetadas dentro de una
columna.
Cromatografía líquida

•  Intercambio aniónico. Grupos amino (NH2)

•  Intercambio catiónico. Grupos carboxilo (COOH).
Cromatografias por afinidad
•  Proteína  G/an?cuerpos  (Fc/Fab)  
•  Flag/c-­‐Myc/HA  
•  Gluta?ón/GST  
•  Polihis?dina  
•  Bio?na/estreptavidina  
Inmunoprecipitación
¿Cómo aislar una proteína?

•  Reacciones cromogénicas.

•  Reacciones de emisión de Luz.

•  Emisión de fluorescencia.
¿Cómo aislar una proteína?

•  Reacciones cromogénicas.
•  Lowry (Oxidación de aa aromáticos). 750 nm.
•  Bradford (Coomassie G-250). 595 nm.
•  BCA (Reducción del cobre por los enlaces peptídicos/BCA
quela el cobre recudido). 562 nm.

•  Influencia de aa aromáticos y cisteínas.

Cambios postraduccionales - fosforilación.
Marcaje por radioisotopos

•  Un átomo dentro de la molécula debe estar en su forma

radioactiva, radioisótopo. Una forma inestable de un átomo que
emite radiación mientras decae.
•  Fosforilación, marcaje metabólico, incorporación de moléculas,
etc.
¿Cómo aislar una proteína?

•  Westernblot
•  Uso anticuerpos
•  Uso de enzimas
•  Luz/fluorescencia
¿Cómo aislar una proteína?

•  Autoradiografía. Es las proteínas marcadas son

sobrepuestas en un emulsión fotográfica (placa)
sensible a la luz o a la radiación.

•  Horseradish peroxidase (HRP)/Luminol (428 nm)

Un caso extraño - Green Fluorescent Protein (GFP).
FRET
Ensayo de viabilidad por Calceína AM-Ioduro
de propidio

El  ensayo  de  Calceína  AM  depende  de  las  esterasas  intracelulares  que  permiten  
la  fluorescencia  de  la  calceína  en  485/535  nm  y  su  retención  en  la  célula  
(perdida  de  hidrofobicidad).  El  Ioduro  de  propidio  (molécula  polar)  fluoresce  
intensamente  cuando  intercala  en  el  DNA  (aprox.  30  veces  más  en  530/620  nm).  
Fluorescencia
La  fluorescencia  es  un  
proceso  de  emisión  en  el  
cual  las  moléculas  son  
excitadas  por  la  absorción  
de  radiación  
electromagné?ca.  Las  
especies  
excitadas  se  relajan  al  
estado  fundamental,  
liberando  su  exceso  de  
energía  en  
forma  de  fotones.  Tiene  
una  alta  sensibilidad  
inherente  rela?va  a  la  
Espectroscopía  de  
absorción.  
PCR y RT PCR
ChIP  
1.  Crosslinking  
 

2.  Cell  lysis  
 

3. Chromatin Preparation (Shearing/

Digestion)

4. Immunoprecipitation

5. Crosslinking Reversal and

DNA Clean-up  
Luciferasa
miRNA