FORMULACIÓN DE TRICHODERMA HARZIANUM RIFAI EN LA

PRODUCCIÓN ECOLÓGICA DE PLÁNTULAS DE MELÓN EN SEMILLERO

PARA EL CONTROL DE LA FUSARIOSIS VASCULAR

A Martínez-Medina, A Roldán, E Lloret, J Pascual

CEBAS-CSIC, Dpto. Conservación de Suelos y Agua y Manejo de Residuos
Orgánicos, Campus Universitario de Espinardo, Murcia, 30100,
ammedina@cebas.csic.es

RESUMEN
La fusariosis vascular, causada por el hongo fitopatógeno Fusarium oxysporum
Schlechtend f. sp. melonis Snyd. y Hans es una de las enfermedades más destructivas
en cultivo de melón a nivel mundial, siendo especialmente severa en semilleros debido
a las condiciones específicas que se dan en los mismos. El control biológico de esta
enfermedad mediante el uso del hongo antagonista Trichoderma harzianum se
presenta como una alternativa adecuada para la producción ecológica de plántulas en
semillero. Sin embargo, para un uso eficaz de este antagonista, es necesario el
desarrollo de un inóculo que permita su aplicación de manera sencilla y efectiva en
esta fase de la producción de melón.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de control biológico de T.
harzianum frente a la fusariosis vascular, comparando la efectividad de dos formulados
diferentes: uno sólido, compuesto por bentonita-vermiculita, y una suspensión líquida.
Para esto, se efectuó un ensayo de germinación y crecimiento de plántulas de melón
en semillero con condiciones de agricultura ecológica. T. harzianum se incorporó en
cada una de las formulaciones, en presencia o ausencia inducida del patógeno F.
oxysporum.
La capacidad de supervivencia de T. harzianum resultó muy afectada por el tipo de
formulación, de modo que la aplicación de T. harzianum en la formulación sólida
mostró mayor supervivencia, estabilidad y eficacia frente a F. oxysporum que la
formulación líquida, transcurridas las ocho semanas de residencia de las plántulas en
semillero. Debido a esto, las plántulas tratadas con la formulación sólida de T.
harzianum mostraron un mayor desarrollo y un aspecto más vigoroso, incrementando
su peso hasta un 30%; mayores contenidos en clorofila, hasta un 80%; y mayor
resistencia frente a la enfermedad, disminuyendo su incidencia y severidad hasta en
un 50% con respecto a las plántulas sin tratar.
Palabras clave: Trichoderma harzianum, Fusarium oxysporum, biocontrol, bentonita,
semillero.

INTRODUCCIÓN
La fusariosis vascular del melón causada por el hongo fitopatógeno F. oxysporum es
una enfermedad muy común en zonas semiáridas, que puede llegar a ocasionar
pérdidas de hasta un 90%, presentándose especialmente destructiva en semilleros,
dónde las plántulas crecen en sustratos que favorecen su desarrollo (Gonzalez-Torres
et al., 1993). Los métodos químicos empleados para el control de esta enfermedad no
se muestran efectivos e implican efectos negativos sobre el medio ambiente y la salud
humana, mostrándose el control biológico mediante el empleo de microorganismos
como una alternativa eficaz al uso de estas sustancias (Pascual et al., 2002)
Entre los agentes de control biológico más importantes se encuentran los hongos
pertenecientes al género Trichoderma, que son capaces de controlar un amplio
abanico de patógenos de plantas de interés agrícola. Además algunas especies de
este género poseen capacidad de bioestimulación de crecimiento en algunos cultivos
(Howell 2003). Sin embargo, a pesar del éxito relativo, todavía no ha sido posible
alcanzar los niveles deseados en el control de enfermedades, debido en parte a que
se conoce muy poco acerca del establecimiento proliferación y supervivencia de este
antagonista en sustratos naturales.
El desarrollo de formulados eficaces adquiere una gran importancia en el campo del
control biológico ya que puede afectar profundamente al rendimiento del agente
antagonista. Uno de los mayores obstáculos para el uso y la comercialización de
agentes de control biológico reside en el desarrollo de productos que estén formulados
adecuadamente lo que implica, entre otros criterios, que contenga una cantidad
suficiente de inóculo y que la calidad de este se mantenga durante el tiempo de
almacenamiento, que sea de fácil aplicación y muestre una alta persistencia en el
medio en el que se ha dispersado, y que su producción sea económicamente rentable,
(Fravel, 2005). El mantenimiento de una alta densidad de inóculo una vez que se ha
aplicado en el suelo o sustrato, tras un periodo de tiempo de medio a largo plazo,
representa uno de los mayores obstáculos en el uso eficiente de microorganismos
como agentes de control biológico.
En este trabajo se propone el uso de un medio sólido basado en bentonita y
vermiculita para el crecimiento y posterior vehículo de T. harzianum, basándonos en
la consideración de que es inocuo para el medio ambiente, barato y fácilmente
disponible. La bentonita es una arcilla que ha demostrado incrementar de manera
importante la supervivencia de microorganismos del suelo frente a exposición a altas
temperaturas, desecación, o radiación UV, así como confiriendo una protección frente
a la predación (Heynen et al., 1987; Zohar-Perez et al., 2003).
Para ello se ha evaluado la capacidad de control biológico de T. harzianum frente a la
fusariosis vascular así como su potencial efecto de bioestimulación, comparando la
efectividad de dos formulados diferentes, uno sólido compuesto por bentonita-
vermiculita y una suspensión líquida. Para esto, se efectuó un ensayo de germinación
y crecimiento de plántulas de melón en semillero bajo condiciones de agricultura
ecológica.

MATERIAL Y MÉTODOS.
Material vegetal
Como planta hospedadora se utilizó melón Cucumis melo var. Giotto. Se seleccionó
esta variedad por tratarse de una variedad con una elevada susceptibilidad al
patógeno F. oxysporum empleado en este ensayo.
Inóculos
1. Trichoderma harzianum
El aislado de Trichoderma empleado, T. harzianum T-78 (CECT 20714) procede de la
colección de hongos del “Departamento de Conservación de Suelos y Agua y Manejo
de Residuos Orgánicos” del Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura,
perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CEBAS-CSIC). Este
aislado fue crecido en dos medios diferentes, obteniendo así dos diferentes inóculos:
una suspensión líquida de conidios y un formulado sólido.
Para obtener el inóculo sólido, se creció el hongo en medio enriquecido con avena,
modificado para obtener el máximo rendimiento (máxima concentración de
conidios/g).La preparación del medio se realizó mezclando 20 g de avena, 50 ml de
bentonita con 100ml de vermiculita. Tras homogeneizar la mezcla, esta se pasó a
distintos Erlenmayers de 1000 ml, conteniendo cada uno 150 ml de la mezcla, a los
que se le añadieron 60 ml de agua. La mezcla se esterilizó en autoclave (1h, 121ºC)
dos veces, dejando 24 horas entre cada ciclo. Finalmente se incorporó el aislado de T.
harzianum, transfiriendo tres trozos circulares de agar colonizado por el hongo, de 10
mm de diámetro, en cada uno de los Erlenmayers. Los cultivos se incubaron a 28ºC en
oscuridad durante 8 días, resultando una concentración final de 2*109 conidios/g de
medio.
Para obtener el inóculo líquido, se cultivó el hongo en placas conteniendo PDA
(Potato, Dextrosa, Agar) implementado con estreptomicina (100mg/L). Estas placas se
incubaron en una estufa a 28ºC, en oscuridad durante 6 días, transcurridos los cuales,
se procedió a recolectar los conidios en agua estéril, con ayuda de un asa de siembra,
obteniendo una suspensión con una concentración de 1*108 conidios/ml.

2. Fusarium oxysporum
El aislado monospórico de Fusarium oxysporum f.sp. melonis raza 1,2 empleado se
obtuvo a partir de una plántula de melón afectada de fusariosis vascular. Este se
cultivó en PDB (Potato, Dextrosa, Broth) suplementado con estreptomicina (100mg/l).

Diseño experimental y condiciones de crecimiento

Se estableció un diseño multifactorial dispuesto en bloques al azar compuesto por
dos factores y cinco repeticiones. El primer factor estaba compuesto por 3 niveles:
control sin inocular e inoculación con T. harzianum en el formulado líquido y sólido,
respectivamente. El segundo factor estaba compuesto por dos niveles: no inoculación
/inoculación con F. oxysporum respectivamente. Los diferentes tratamientos se
prepararon mezclando turba comercial (3,7 g Kg-1 nitrógeno total, 11,58 g-3 kg-1 fósforo
asimilable, and 13,4g-3 Kg-1 potasio asimilable) previamente autoclavada (1h, 121ºC 2
veces con un intervalo de 24 horas entre ambos ciclos), con los inóculos de T.
harzianum, alcanzado esta una población de 106conidios/g de turba, tanto en la
formulación líquida como en la sólida.
Los diferentes tratamientos homogeneizados se dispusieron en bandejas de
poliestireno de 10 alveolos, a razón de 7 g/alveolo. Cada bandeja se consideró como
un bloque, y se utilizaron 5 réplicas por tratamiento. Se sembraron 10 semillas de
melón en cada bandeja de poliestireno (1 semilla/alveolo) y seguidamente se cubrieron
con vermiculita y se humedecieron. Las bandejas sembradas se colocaron en una
cámara acondicionada para la germinación de las semillas de melón, a temperatura y
humedad constante y oscuridad. Pasados dos días se sacaron de la cámara de
germinación y fueron llevadas al invernadero donde se extendieron de manera
aleatoria.
La incorporación del patógeno F. oxysporum se realizó transcurridas 4 semanas tras la
siembra de las bandejas, alcanzando este una concentración de104 conidios/g. 8
semanas después de la siembra, se cortaron las plantas y se tomaron muestras de los
sustratos que se almacenaron 4ºC. A las 4 semanas de la siembra se tomaron
muestras de los sustratos para evaluar la supervivencia de T. harzianum.

Análisis de planta
Se determinó tanto el peso fresco como el peso seco (105°C, 5 h) de la parte aérea y
posteriormente se trituró el material para los análisis bioquímicos. La concentración
foliar de fósforo y potasio se determinó tras una digestión nítrico-perclórica ácida (2:1)
durante 2 horas (Plank, 1992) y posteriormente mediante colorimetría en el caso del
fósforo (Murphy y Riley, 1962) y fotometría de llama para el potasio (Schollemberger y
Simon, 1954). La concentración total de nitrógeno y clorofila se determinó mediante el
método Kjedahl modificado (Bremner y Mulvaney, 1982) y de acuerdo a Arnon (Arnon,
1949), respectivamente.

Análisis microbiológico de suelo

Para el estudio de la evolución de los hongos inoculados se sembraron en placa
diluciones seriadas de las muestras de la rizosfera. Para el recuento de T. harzianum
se sembró 1 g de sustrato en PDA suplementado con 50 mg/l de Rosa de Bengala y
100 mg/l de estreptomicina. Para cuantificar las colonias de F. oxysporum se utilizó
como medio selectivo Komada (Komada, 1975). Las placas se incubaron a 28ºC en
oscuridad durante 5 días.
Para evaluar el porcentaje de infección de la enfermedad en cada tratamiento, se
cortaron segmentos (~1.5 cm) de la parte basal del tallo de las plantas, que
posteriormente fueron esterilizados en hipoclorito de sodio 1% durante 5 min. Los
segmentos se incubaron en PDA a 28ºC durante 5 días y se estudió la presencia de
colonias de F. oxysporum.

Análisis estadístico
Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) según el
procedimiento de modelo lineal general univariante simple. Las medias con
diferencias significativas se compararon según el test de Tukey (P<0,05). Para el
procesamiento estadístico se utilizó el software SPSS, versión 12.0.

RESULTADOS

Respuesta en planta en ausencia de patógeno

Aquellas plantas que se trataron con el formulado sólido de T. harzianum
incrementaron significativamente tanto el peso como el contenido en clorofila (Fig 1A)
con respecto al control (los valores medios del control fueron peso fresco: 5,61 g, peso
seco: 0,65 g y 0,31 g/Kg de peso fresco, de clorofila), mientras que las plantas tratadas
con el formulado líquido de T. harzianum no mostraron diferencias significativas con
respecto al control (Fig 1A).
El formulado sólido de T. harzianum afectó igualmente al contenido en nitrógeno,
fósforo y potasio. El contenido de fósforo en planta se incrementó significativamente
mientras que el contenido en nitrógeno disminuyó significativamente con respecto al
control. El contenido en potasio disminuyó aunque no de manera significativa (Fig 1B)
los valores medios del control fueron: 19,6, 5,7 y 23,3 g/K- de peso seco
respectivamente.

Supervivencia de T. harzianum en el sustrato

En los tratamientos en los que T. harzianum se incorporó en el formulado sólido, la
población se mantuvo en el nivel de inoculación, mientras que en el formulado líquido
la población de T. harzianum se redujo en 2 órdenes de magnitud (Fig 2).
Interacción entre los hongos inoculados
La presencia de F. oxysporum no afectó a la población de T. harzianum inoculada
tanto en medio líquido como en sólido (Fig 3A), sin embargo la población del patógeno
incrementó significativamente como consecuencia de la presencia de T. harzianum
incorporado en el formulado sólido. El formulado líquido de T. harzianum no afectó a la
población del patógeno (Fig 3B).

Reducción de la enfermedad
Los tratamientos que incorporaban el formulado sólido de T. harzianum redujeron
significativamente la incidencia de la enfermedad con respecto tanto a los controles no
tratados como a los tratamientos inoculados con T. harzianum en el formulado líquido
(Fig 4A).
Además, las plantas de aquellos tratamientos que incorporaban T. harzianum en el
formulado sólido experimentaron un menor descenso tanto en peso fresco como en
contenido en clorofila como consecuencia de la enfermedad, comparada tanto con
plantas enfermas del tratamiento sin inocular con T. harzianum como con plantas
enfermas tratadas con T. harzianum en el formulado líquido (Fig 4B). No se
observaron diferencias significativas en los tratamientos inoculados con el formulado
líquido de T. harzianum con respecto al control (Fig 4). En plantas sanas, los pesos
frescos fueron 5,61, 5,72 y 7,13 g, y el contenido en clorofila 0,31, 0,35 y 0,55 g/Kg de
peso fresco, en plantas no tratadas y tratadas con el formulado líquido y sólido de T.
harzianum respectivamente.

DISCUSION
En ausencia de un vehículo sólido T. harzianum fue incapaz de mantener una
población estable en la turba. Esta baja supervivencia reveló la sensibilidad del
antagonista a las condiciones ambientales, a pesar de darse en semillero unas
condiciones muy favorables para su aplicación, ya que la temperatura y humedad son
razonablemente controlables. Sin embargo, el formulado sólido se mostró como un
medio eficaz en cuanto a la persistencia y supervivencia del antagonista en la turba ya
que su población se mantuvo estable tras 8 semanas después de su inoculación.
Determinados microorganismos se muestran muy sensibles a ciertos factores
ambientales como la luz solar, temperatura, humedad, exudados foliares o presencia
de competidores en el sustrato. La reducción en la población de T. harzianum
incorporada como una suspensión liquida de conidios podría atribuirse a la ausencia
de protección frente a estos factores. Se ha demostrado que la inmovilización del
antagonista en vehículos sólidos como arcillas o alginato le proporciona una mayor
supervivencia frente a la radiación UV, que en suspensión líquida (Zohar-Perez et al.,
2003). Además, la bentonita podría ofrecer una protección adicional frente a factores
biológicos a través de la inducción a la formación de micro-nichos (Heynen et al.,
1988) y barreras físicas entre el microorganismo inoculado y el medio (Heijnen, Chenu
y Robert, 1993). A esto se le suma la protección que el vehículo sólido podría conferir
a los microorganismos frente al lavado (Jones and Burges, 1988).
Nuestros resultados mostraron un claro efecto positivo por parte del vehículo sólido, en
la inoculación del antagonista en turba, bajo condiciones de semillero, ya que la
efectividad de este se vio drásticamente reducida o perdida por completo debido
principalmente al decrecimiento en su población en ausencia de éste. Estos resultados
también nos permitieron concluir la necesidad de un mínimo nivel de población del
antagonista en el sustrato, con el fin de garantizar un control biológico eficiente.
El incremento tanto en el peso fresco de la parte aérea, niveles de clorofila y fósforo
observado en ausencia de patógeno, en las plantas tratadas con el formulado sólido
de T. harzianum, se manifestó con un mayor desarrollo y vigor que en plantas no
tratadas, o tratadas con el formulado líquido. Estos efectos tienen una implicación
económica muy importante en cuanto a que permiten acortar el periodo de tiempo de
desarrollo de la planta en el semillero, incrementando por tanto su capacidad de
producción.
Además, las plantas tratadas con el formulado sólido se mostraron más resistentes a
la fusariosis vascular. La capacidad de control biológico de T. harzianum ha sido muy
estudiada y son varios los mecanismos de acción que se le atribuyen, como
micoparasitismo, producción de antibióticos o competición (Harman et al., 2004).

CONCLUSIÓN
Le eficiencia de la aplicación de T. harzianum en plantas de melón bajo condiciones de
invernadero está fuertemente relacionada con su formulado, ya que el formulado tiene
una clara influencia en la supervivencia de este antagonista en la turba. Un formulado
sólido de este agente basado en bentonita-vermiculita se muestra como efectivo en
semilleros en cuanto al incremento del crecimiento y vigor en las plántulas como al
control de la incidencia y severidad de la fusariosis vascular.

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FIGURAS

Fig 1. Efecto de bioestimulación y respuesta nutricional en plantas tratadas con T.

harzianum en formulado liquido (FL) o sólido (FS), 8 semanas tras la siembra. (A)
Peso fresco y seco, contenido en humedad y contenido en clorofila de planta, y (B)
contenido en nitrógeno fósforo y potasio, todo medido y comparado con estos
parámetros en plantas no tratadas. *Incremento significativo, (P≤0.05), n=5.

Fig 2. Evolución de la población de T. harzianum en el sustrato, inoculada tanto en

formulado líquido (FL) como sólido (FS) (Log de unidades formadoras de colonia/ g de
sustrato). Los valores de las barras indican la desviación estándar.
Fig 3. Efecto de la interacción entre T. harzianum y F. oxysporum en la evolución de
sus poblaciones, 4 semanas tras la inoculación con el patógeno. (A) Población de T.
harzianum inoculada tanto en el formulado líquido (FL) como sólido (FS) en presencia
y ausencia de F. oxysporum. (B) Población de Fusarium oxysporum en ausencia y
presencia de T. harzianum incorporada tanto en el formulado líquido como sólido (Log
de unidades formadoras de colonia/ g de sustrato). Los valores con la misma letra no
representan diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo al test de Tukey
(P≤0.05), n=5. Las barras indican la desviación estándar.

Fig 4. Incidencia y severidad de la fusariosis vascular en plantas, 4 semanas tras la

inoculación con el patógeno. (A) Incidencia de la enfermedad en plantas tratadas y no
tratadas con T. harzianum inoculada tanto en el formulado líquido (FL) como sólido
(FS), and (B) efecto de la enfermedad en el peso fresco y contenido en clorofila de la
planta, tanto en plantas no tratadas como plantas tratadas con T. harzianum inoculada
tanto en el formulado líquido (FL) como sólido (FS), todo medido y comparado con
estos parámetros en plantas no inoculadas con el patógeno. *Incremento significativo
(P≤0.05), n=5.