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Técnicas Básicas de La Biología Molecular PDF
Técnicas Básicas de La Biología Molecular PDF
DE CUENCA
FACULTAD DE BIOFARMACIA
INVESTIGADOR:
MARCELA PATRICIA VALVERDE PERALTA
DIRECTOR:
ING. RENÉ SARMIENTO
CUENCA - ECUADOR
2010
Universidad Católica de Cuenca
Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia.
Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico.
DEDICATORIA:
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular II
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AGRADECIMIENTO
Químico Farmaceuta.
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JUSTIFICACIÓN
El tema planteado es de gran relevancia pues hoy en día hay un gran desconocimiento
acerca de las técnicas básicas de la Biología Molecular, pudiendo ser de gran utilidad
en la medicina moderna, el conocimiento de esta tecnología es necesario ya que es
la base de la investigación, diagnóstico, pronóstico y tratamiento de muchas
enfermedades, siendo uno de los temas que actualmente está tomando la punta ya
que tiene mucha relevancia, tanto en el campo científico, humano y contemporáneo.
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
PRELIMINARES_______________________________________PÁGINAS
CARÁTULA……………………….…………………………………………………………………….……………………I
DEDICATORIA………..…..…………………………………………………………………….………….................II
AGRADECIMIENTO……………………………………..…………………………………………………………….III
ÍNDICE……………………………………………………………………………………………………………………...IV
INTRODUCCIÓN…………..…………………………………………………………………………………………VIII
OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………………………….…..X
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular V
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INTRODUCCIÓN
El tema planteado pretende dar a conocer las técnicas básicas usadas en Biología
paciente.
ácidos nucleicos a gran escala, abriendo las puertas a la secuenciación de los ácidos
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Estos hechos son reflejados en las siguientes palabras del científico y divulgador de
las ciencias Bertrand Russell (1872-1970): “Ciento cincuenta años de ciencia han
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OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
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CAPÍTULO ‘I’
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Desde hace muchísimos años, tantos que no podría precisarse el momento exacto,
el hombre busca descubrir un orden para el Universo y ubicarse a sí mismo dentro
de ese orden. Es la búsqueda de un lugar en esa vastedad la que originó fábulas,
mitos y leyendas que asignaban a uno o varios dioses la creación y el mantenimiento
de todo lo existente. Es esa misma búsqueda, casi desesperada, la que animó a
muchos hombres a cuestionar estas explicaciones y encontrar otras, que no
delegaran el poder de la existencia, en definitiva, de la vida y la muerte, en fuerzas
sobrenaturales o seres mitológicos. La Biología aparece en Grecia antigua nos da
cuenta de ese esfuerzo por encontrar, desde el que hacer filosófico, las respuestas a
viejas y nuevas preguntas.1
1 http://www.alipso.com/monografias/origenes_biologia_celymolec/
2 http://www.elergonomista.com/biologia/historia.htm
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Galeno (130 - 200 años D.C.). Considerado el primer anatomista griego y aún
cuando en su época no se permitían las disecciones humanas, describió nuestra
anatomía.
William Harvey (1578 – 1657). Médico y científico inglés, descubrió que el corazón
era el encargado de bombear la sangre y además, descubrió el sentido de la
circulación sanguínea.
Para concluir con este período de poco más de 2000 años, podemos decir que
durante la etapa de Biología antigua surgieron las primeras ideas sobre el origen de
la vida, se empieza a describir la anatomía y fisiología humana, así mismo, surgen la
botánica, la zoología y la taxonomía.
Esta etapa se inicia a mediados del siglo XVII y se extiende hasta poco antes del
año 1920. Uno de los inventos más importantes de esta época, es sin lugar a dudas
el microscopio, ya que con su ayuda se empezaron a observar estructuras biológicas
que a simple vista no era posible hacerlo. La historia no establece claramente quien
inventó el microscopio; algunos historiadores piensan que Giovanni Farber lo inventó
en 1550; otros opinan que le corresponde a Zaccharias Jannsen en 1590.
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Marie Francois Bichat (1771 – 1802), establece que los órganos estaban formados
por subunidades a las que llamó tejidos; también estableció que dentro de los tejidos
existía un nivel más bajo de organización (células).
Robert Brown en 1831 estableció que todos los tipos de célula tienen núcleo.
Charles Darwin (1809 – 1882), autor del libro “El Origen de las Especies” en él
expuso sus ideas sobre la evolución de las especies por medio de la selección
natural. Esta teoría originó, junto con la teoría celular y la de la herencia biológica, la
integración de la base científica de la biología actual.
Como conclusión a este período de unos 300 años: etapa caracterizada por un
método de trabajo experimental y por la tentativa de relacionar a las estructuras
celulares con su función, surgen nuevos campos de la biología como la
microbiología, citología, genética y evolución entre otras.
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Albrecht Koseel en 1879, demostró que la nucleina estaba compuesta por 4 bases
orgánicas, adenina, guanina, timina y citosina.
En 1950 Erwin Chargaff demostró que la composición química del ADN variaba
entre un organismo y otro, pero siempre existía una concentración molar equivalente
entre A-T y C- G.
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En 1975, Southern desarrolló un método para fijar ADN digerido por enzimas de
restricción a un soporte sólido y realizar en él, la hibridación con sondas específicas.
La técnica desarrollada se llamó Southern-blot y la extensión de esta metodología a
ARN se denominó Northern-blot y a proteínas, Western-blot. Otras variaciones de
este método, que no utilizan la separación electroforética, se denominan dot-blot.
En 1985, Mullis reunió algunas metodologías para realizar síntesis de ADN in vitro
en forma exponencial (PCR), considerada como una revolución dentro la biología
molecular ya que con la amplificación exponencial es posible el análisis de
moléculas de ADN o ARN, a partir de mínimas cantidades de muestras.
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Esta escuela tuvo su antecedente en las ideas primero de Niels Bohr y después de
Max Delbrück Bohr elaboró la noción de que algunos fenómenos biológicos no se
podrían explicar completamente en términos de la Física convencional.
En 1945 Edwin Schrödinger con su libro “What is life?” se convirtió en una especie
de revolución biológica. Y además centró la atención sobre el tema del material
genético. El libro lo leyó también Watson (1966) quedó polarizado hacia el objetivo
de desentrañar el secreto del gen.
La escuela tiene sus orígenes en los estudios por difracción de rayos X de proteínas
que se presentan en forma de fibras en que hay suficiente regularidad. W. H. Bragg
y su hijo W. L. Bragg inventaron la cristalografía de rayos X en 1912 y luego
3 http://www.alipso.com/monografias/origenes_biologia_celymolec/
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John Desmond Bernal demostró en 1939 que el virus del mosaico del tabaco, TMV,
consiste en una asociación de centenares de subunidades proteínicas idénticas.
W. C. Astbury en 1945. En el DNA las bases forman una pila compacta, que es
perpendicular al eje de la molécula.
La palabra biología está formada por dos vocablos griegos: bios (“vida”) y logos
(“estudio o tratado”) y significa “estudio de la vida”. Se trata de una de las ciencias
naturales cuyo principal objetivo es el estudio del origen, de la evolución y de las
propiedades que poseen todos los seres vivientes de esta manera establecer las
leyes generales que rigen la vida orgánica.
4 http://www.encuentros-multidisciplinares.org/Revistan%C2%BA3/Miguel%20A%20Fuertes%20-
20Jos%C3%A9%20M%20P%C3%A9rez.pdf
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5
http://hnncbiol.blogspot.com/2008/01/biologia-ciencias-biologicas.html
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1.3.1. EL GENOMA
El genoma es la información genética con que cuentan los seres vivos contenido en
las células presente en un organismo en particular, la cual está almacenada en los
genes y estos a su vez en los cromosomas. Prácticamente todos los genomas (con
excepción de los de algunos virus) están formados por ADN, una doble hélice
compuesta por dos hebras de nucleótidos.
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transmisión de los caracteres hereditarios. Poseen una compleja estructura que les
permite llevar a cabo el transporte del material genético y la formación del cigoto que
dará origen al nuevo individuo con las características de los progenitores.
El DNA nunca está desnudo. En eucariotas interacciona con una gran variedad de
proteínas, se espiraliza y condensa para formar la cromatina y los cromosomas.
Los cromosomas constituyen el orden superior de empaquetamiento del DNA y se
pueden visualizar al microscopio óptico como un ovillo formado por una hebra de 1,7
a 8,5 cm de longitud y esta formada por una unidad estructural que es la cromatina
que se visualiza al microscopio electrónico (fibras que contienen aprox. 60%
proteína y 35% DNA y 5% RNA). Está compuesta por 6-7 nucleosomas por vuelta.
Cada nucleosoma es un disco formado por un octámero de proteínas básicas
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http://www.profesorenlinea.cl/Ciencias/cromosomas.htm
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9 Ficha de trabajo de la Dra. Andrea Albarenga Julio del 2010 Niveles de compactación del ADN en
eucariotas. http://biologia-lacienciadelavida.blogspot.com/2010/07/ciclo-celular-ficha-de-trabajo-para-
4.html
10 Genética - Técnicos para Bioterio by Gabriel Robledo is licensed under a Creative Commons
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formado por un segmento del ADN del cromosoma localizado en el núcleo celular y
se disponen en línea a lo largo de cada uno de ellos. Cada gen ocupa en el
cromosoma una posición, o locus (plural: loci).
Atendiendo al aspecto que afecta a la herencia, esa unidad básica recibe también
otros nombres, como recón, cuando lo que se completa es la capacidad de
recombinación (el recón será el segmento de ADN más pequeño con capacidad de
recombinarse), y mutón, cuando se atiende a las mutaciones (y, así, el mutón será el
segmento de ADN más pequeño con capacidad de mutarse).
Los genes no están situados siempre de forma contigua en el ADN, sino que
separando los genes existe una gran cantidad de ADN (región intergénica). En
términos generales, un gen es un fragmento de ADN que codifica una proteína o un
péptido. El ADN contiene la información genética de todos los seres vivos. Es como
el código de barra de todos los organismos vivos que existen en la tierra, que está
formado por segmentos llamados genes. El conjunto de todos los caracteres
transmisibles, que vienen fijado en los genes, recibe el nombre de genotipo y su
manifestación exterior en el aspecto del individuo el de fenotipo. Se llama idiotipo al
conjunto de posibilidades de manifestar un carácter que presenta un individuo. La
combinación de genes es específica para cada organismo y permite
individualizarnos. Estos genes provienen de la herencia de nuestros padres y por
ello se utiliza los tests de ADN para determinar el parentesco de alguna persona.
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traducida a las proteínas. Son las proteínas las moléculas que finalmente ejecutarán
las "instrucciones" codificadas en los ácidos nucleicos. A las unidades químicas que
se unen para formar los ácidos nucleicos se les denominan nucleótidos. 11
En los eucariotas la estructura del ADN es de doble cadena helicoide, mientras que
la estructura del ARN es polinucleótido lineal monocatenaria, aunque puede
presentarse en forma extendida, como el ARNm, o en forma plegada, como el ARNt
y el ARNr. La masa y el peso molecular del ADN es generalmente mayor que la del
ARN. El ADN contiene la información genética de todos los seres vivos. Ambos
ácido nucleicos, se encuentran simultáneamente en organismos eucariotas y
procariotas (bacterias, etc.), y sólo uno de ellos en los virus.
Los ácidos nucleicos polímeros de alto peso molecular constituidos por unidades
elementales denominadas nucleótidos.Cada nucleótido es una molécula
compuesta por tres unidades:
D-ribosa (R), en el caso del RNA D-2- desoxirribosa (dR), en el caso del DNA
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b) Base orgánica nitrogenada, son compuestos orgánicos cíclicos, que incluyen dos
o más átomos de nitrógeno y son la parte fundamental de los ácidos nucleicos.
Biológicamente existen cinco bases nitrogenadas, que se clasifican en:
Las Bases Purínicas, derivadas de la estructura de las Purinas (con dos anillos):
la Guanina (G) y la Adenina (A). Ambas se encuentran tanto en el ADN como el
ARN.
12 Biología COU- Anaya. Bloque 1. Tema 6: Composición química de los Ácidos Nucleicos.
http://www.iesbanaderos.org/html/departamentos/bio-
geo/Apuntes/Bio/T%206%20Ac%20Nucleicos/2%20Composicion.htm
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c) Grupos o radical fosfato, uno o varios derivados del ácido fosfórico (H 3PO4-). En
la cadena de ácido nucleico une dos pentosas a través de una unión
fosfodiester.
Los nucleótidos son las unidades o monómeros utilizados para construir largas
cadenas de polinucleótidos. Tanto los nucleótidos como los nucleósidos pueden
contener como azúcar la D-ribosa (ribonucleótidos y ribonucleósidos) o la pentosa
2-desoxi-D-ribosa (desoxirribonucleótidos y desoxirribonucleósidos). Además, los
nucleótidos pueden tener 1, 2 ó 3 grupos fosfato unidos al carbono 5’ de la pentosa,
existiendo por tanto, nucleótidos 5’ monofosfato, nucleótidos 5’ difosfato y
nucleótidos 5’ trifosfato según el número de grupos fosfato que posea.
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Estructura de un polirribonucleótido
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Acorde a las evidencias, sólo una pequeña parte del ADN constituye genes (menos
del 10 %).
13 http://es.wikipedia.org/wiki/Hibridaci%C3%B3n_(biolog%C3%ADa_molecular)
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Cada hélice es una serie de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster en los
que un grupo fosfato forma un puente entre grupos OH de dos azúcares
sucesivos (posiciones 3’ de un azúcar y 5’ del siguiente).
14 http://heliotropodeluz.wordpress.com/2008/06/14/la-clave-esta-en-el-adn/
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El ADN es una molécula por lo general bicatenaria, formada por dos cadenas
dispuestas de forma antiparalela y con las bases nitrogenadas enfrentadas.
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Estas estructuras poco frecuentes pueden ser reconocidas por proteínas específicas
que se unen a ADN-Z y posiblemente estén implicadas en la regulación de la
transcripción.
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1. Separación de las dos cadenas que forman la doble hélice, de lo cual se encargan
enzimas y proteínas que se encuentran en la célula eucariótica.
4. Constitución de las nuevas copias siempre formadas por una hebra madre y otra
hija, por lo que al proceso se le denomina replicación semiconservativa del DNA.
Según la Horquilla replicativa del DNA con todas las enzimas implicadas se sigue el
siguiente proceso.
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Fig.1.8.Horquilla Replicativa16
La DNA polimerasa puede sintetizar DNA en la dirección 5' - 3', por lo que una de las
hebras debe ser sintetizada discontinuamente, esto lleva a la formación de cortas
cadenas de DNA con huecos entre ellas que deben ser completados por la acción
de la DNA polimerasa I y unidos por la acción de una DNA ligasa.
Esta macromolécula representa alrededor del 7% del peso de una célula, constituida
por largas cadenas de ribonucleotidos, unidos por enlaces fosfodiester. Estos se
16 http://www.editoriallapaz.org/ateismo_ADN_acetatos_files/image010.gif
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forman por la unión de un grupo fosfato, ribosa (una aldopentosa cíclica) y una base
nitrogenada unida al carbono 1’ de la ribosa, que puede ser C, G, A y U. En
general los ribonucleótidos se unen entre sí, formando una cadena simple, excepto
en algunos virus.
Se conocen tres tipos principales de ARN y todos ellos participan de una u otra
manera en la síntesis de las proteínas. Ellos son:
Este tipo de ARN una vez transcripto, pasa al nucléolo donde se une a proteínas. De
esta manera se forman las subunidades de los ribosomas. Aproximadamente dos
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terceras partes de los ribosomas corresponde a sus ARNr. Los ribosomas, formados
por proteínas y ARN ribosomal y participan activamente en la lectura de la molécula
de ARN mensajero para sintetizar las proteínas contenidas en la secuencia de
codones del ARN mensajero.
Diagrama de un ribosoma
Procarionte
Molécula de ARNt
Estos tres tipos de ARN están implicados en el pasaje de información del lenguaje
de los nucleótidos del ADN al de los aminoácidos de las proteínas, en un proceso
conocido como; “El dogma central de la biología”.
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Un gen está compuesto, como hemos visto, por una secuencia lineal de nucleótidos
en el ADN, dicha secuencia determina el orden de los aminoácidos en las proteínas.
Sin embargo el ADN no proporciona directamente de inmediato la información para
el ordenamiento de los aminoácidos y su polimerización, sino que lo hace a través
de otras moléculas, los ARN.
1.6.1. LA TRANSCRIPCIÓN
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Así, la secuencia ATG (AUG en el ARNm) codifica para la metionina, y el codón TTT
(UUU en el ARNm) codifica para la fenilalanina en todos los organismos vivos.
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Este proceso de elongación continúa hasta llegar a un codón de parada. Una vez
sintetizada la proteína pueden haber modificaciones postranscripcionales (cortes por
enzimas proteolíticas, fosforilaciones, glicosilaciones etc.
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El nombre de una enzima suele derivarse del sustrato o de la reacción química que
cataliza, con la palabra terminada en -asa. Por ejemplo, lactasa proviene de su
sustrato lactosa; alcohol deshidrogenasa proviene de la reacción que cataliza que
consiste en "deshidrogenar" el alcohol; ADN polimerasa proviene también de la
reacción que cataliza que consiste en polimerizar el ADN.
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Reacciones de oxido-reducción: Si una molécula se reduce, tiene que haber otra que
se oxide, catalizan reacciones de oxido reducción o redox.
Deshidrogenasas
Amino oxidasa
Deaminasas
Catalasas.
Peroxidasas.
grupos aldehídos
grupos acilos
grupos glucosilos
grupos fosfatos
enlace éster
enlace glucosídico
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Ejemplo:
Epimerasas (mutasa).
Aldolasas
Decarboxilasas
Entre C y C
Entre C y O
Entre C y N
Catalizan reacciones en las que se eliminan grupos H2O, CO2 y NH3 para formar un
doble enlace o añadirse a un doble enlace. Ejemplos: descarboxilasas, liasas,
Isomerasas de azúcar, Epimerasas y Mutasas.
Entre C y O
Entre C y S
Entre C y N
Entre C y C
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1.7.4.1. COFACTORES
1.7.4.2. COENZIMAS
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CAPÍTULO II
OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE UN ORGANISMO
TRANSGÉNICO
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Fig. 2.1. Estructura de una molécula de ARN de transferencia (ARNt) con regiones de bases
complementarias (en círculos rojos). La molécula de ARN, si bien mayormente es una única
hebra, tiene la posibilidad de aparearse con otra, e incluso de plegarse y formar regiones
complementarias dentro de la misma molécula. 17
17“Biología” de Helena Curtis y N. Sue Barnes, 6ta Edición (2000) Editorial Panamericana. Capítulo
16: “DNA recombinante: las herramientas del oficio”.
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Así, si un investigador busca estudiar un gen de interés, basta con conocer al menos
una parte de su secuencia, para poder construir una porción complementaria que
permita “pescar” de algún modo a ese gen de interés. Esa porción pequeña de ácido
nucleico se denomina “sonda” y al sintetizarla en el laboratorio se le suele poner
alguna marca que permita visualizarla luego fácilmente (por ejemplo, fluorescencia),
como se representa en la siguiente imagen.
Fig. 2.2. Sonda de ADN marcada que hibrida con una secuencia de ADN complementaria 18.
Por último, las enzimas que se usan para cortar y pegar fragmentos de ADN, o para
sintetizar fragmentos de ADN, provienen de organismos. Estas enzimas se mejoran
para que trabajen eficientemente en las condiciones de laboratorio.
Las etapas del trabajo son básicamente cinco que a continuación se detalla cada
una de estas y las técnicas que involucran.
18 Sonda de ADN marcada que hibrida con una secuencia de ADN complementaria. Fuente: “Las
sondas de ácidos nucleicos” por Rodolfo Wettstein en Ciencia Hoy, Volumen 4 -Nº 20- Setiembre
/octubre 1992
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Una vez que se determinó que el organismo donante posee un gen que codifica para
la característica de interés, los biólogos moleculares se lanzan a la tarea de
conseguir ese gen, es decir: “clonar” el gen. Clonar un gen significa tenerlo puro en
el tubo de ensayos, o mejor aún, dentro de un vector (una molécula mayor de ADN
que permite guardar fragmentos de ADN en forma estable y práctica por más
tiempo). La tarea de clonar involucra varias técnicas que se describen a
continuación:
c) Una vez terminada la PCR, se realiza una técnica conocida como “electroforesis
en gel de agarosa” para visualizar los millones de fragmentos de ADN de interés.
Esta técnica consiste en armar un gel de agarosa, con pequeños huecos en un
extremo donde se deposita (“siembra”) el contenido del tubo de PCR. El gel es
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d) Una vez que se visualizó el resultado del PCR en el gel de agarosa, la “bandita”
del gel que contiene el ADN de interés se recorta y se purifica el ADN. Luego se
realiza la secuenciación que consiste en conocer la cantidad y el orden en que
se ubican los nucleótidos en el fragmento de ADN analizado. Actualmente se
realiza en un secuenciador automático utilizando nucleótidos marcados
fluorescentemente, que son leídos por un láser acoplado a una computadora.
19 Sonda de ADN marcada que hibrida con una secuencia de ADN complementaria. Fuente: “Las
sondas de ácidos nucleicos” por Rodolfo Wettstein en Ciencia Hoy, Volumen 4 -Nº 20- Setiembre
/octubre 1992
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Existen varias técnicas para transferir genes a células de mamíferos con el objetivo
de que se integre al genoma. Una de ellas es la microinyección del ADN de interés
directamente en un óvulo fecundado. Los cigotos así obtenidos son luego
implantados en el útero de una madre adoptiva, o receptora, que ha sido preparada
hormonalmente para poder llevar adelante la gestación. Otra técnica consiste en
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Una vez obtenido el OGM, se debe demostrar, entre otras cosas, si tiene una (o
más) copias del transgén, y cómo y en qué tejidos se expresa el gen. Para lograrlo
se extrae el ADN del organismo y se lo analiza. La técnica de PCR, ya explicada,
permite amplificar el transgén, si es que está en el genoma del organismo, y es una
técnica rápida para verificar si el organismo ha sido transformado o no. Para estimar
cuántas copias del gen se insertaron en el genoma del organismo se utiliza la
técnica denominada Southern Blotting que se representa en la siguiente ilustración:
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Las fuentes más importantes de ADN para clonación son el ADN genómico
(cromosómico) que contiene los genes completos y lo que se conoce como ADN
complementario (ADNc) que se obtiene a partir del ARN mensajero (ARNm) bajo la
acción de la enzima transcriptasa reversa o transcriptasa inversa. Esta enzima es
capaz de sintetizar ADN a partir del ARN el cual le sirve como molde. El empleo de
una u otra fuente depende de los objetivos que se persigan con el estudio a realizar.
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BACTERIÓFAGOS: Son virus que infectan a las bacterias y están constituidos, según
su clase, por un núcleo de ADN o ARN y una cubierta proteica; algunos presentan
una cola, y son incapaces de replicarse autónomamente por lo que necesitan
infectar a la célula para poder hacerlo. Dentro de los fagos más utilizados como
vehículos moleculares de clonación, se encuentran la lambda y sus derivados.
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Para ello se aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un
transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc.) que tras introducirlo dentro
de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una vez replicado
considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente
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se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran número de copias del
fragmento de interés.
2.3. ELECTROFORESIS
Por ejemplo, los científicos pueden usar el ADN encontrado en la sangre presente
en la escena de un crimen como sonda para buscar fragmentos complementarios en
electroforesis conteniendo ADN obtenido de diversas personas sospechosas.
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El peso molecular de los ácidos nucleicos se mide con las siguientes unidades:
DNA: en pares de bases o bp.
RNA: en nucleótidos o nt.
Proteínas: en Daltons o Da.
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pueden ser detectadas a simple vista examinando el gel bajo luz ultravioleta. La
corrida electroforética se realiza colocando el gel que contiene el ADN en un campo
eléctrico, y las moléculas migran a una velocidad que es inversamente proporcional
al log10 de su talla en pares de bases.
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Para evitar una degradación tanto de las muestras como de los reactivos, se debe
trabajar siempre sobre hielo así como de alicuotar todo el material para evitar los
sucesivos descongelamientos.
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Cada muestra debe ser procesada de manera individual y con material desechable y
no hablar o pasar las manos y el material sobre las muestras con los tubos abiertos.
Las muestras deben ser debidamente rotuladas el momento mismo en el que lleguen
al laboratorio y mmantener la cadena de frío para evitar degradación de muestras.
Instrumentos totalmente necesarios para que cada una de las áreas funcione de
forma autónoma e independiente. Entre dichos instrumentos estarán aquellos
dedicados a:
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Una vez conocida la concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el
propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.
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Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el
fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:
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CAPÍTULO III
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
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Para poder realizar Hibridación en una muestra de ADN se necesitan realizar los
siguientes pasos Previos a la Hibridación:
1. Separación de fragmentos
Extracción de ADN
Fragmentar el ADN en porciones más pequeñas (Enzimas de restricción)
Separar los fragmentos realizando una corrida electroforética usando como
sustrato de migración un gel (separación por tamaño)
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Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-
químico, bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. Esta cadena tiene
una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras
moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.
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Para llevar a cabo hibridaciones de este tipo, se aísla el ADN de un tejido o línea
celular, luego se purifica, y se digiere con enzimas de restricción específicas. Los
fragmentos generados se separan mediante electroforesis y después son
transferidos a la membrana que sirve de soporte (gel de agarosa). Este proceso se
lleva a cabo colocando el gel de agarosa sobre papel filtro previamente remojado en
una solución llamada de transferencia (solución salina concentrada). A continuación
se sitúa la membrana sobre el gel y encima de esta una pila de papel filtro seca, y
por capilaridad la solución de transferencia es atraída a la pila de papel filtro,
arrastrando consigo al ADN hacia la membrana, donde queda inmovilizado
conservando la misma posición relativa que ocupaba en el gel. Luego, el ADN puede
ser hibridado en la membrana con una sonda marcada (radiactivamente o con un
fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de
ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda
unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una
forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de
sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con
fluorocromo. La sonda está situada en el filtro en la posición del fragmento de
secuencia complementaria, que es una posición fija fácilmente localizable en el gel.
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Se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que
se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar
ADN, el método Northern sirve para identificar ARN.
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20
Clinical Cytogenetics, Part 1, Mary Beth Dinulos, M.D. HuBio 554 Medical Genetics, Fall 1997, Dr.
Marshall Horwitz, Univ. Washington. http://biomodel.uah.es/citogene/horwitz/cytogen1.htm
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sembrar los clones sobre placas de Petri con agar para después de crecidos
transferirlos a membranas de nylon o nitrocelulosa y luego realizar la hibridación.
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los genes expresados por un microorganismo. De este modo se puede identificar los
patrones de expresión bacteriana de acuerdo a distintas condiciones fisiológicas o
patológicas. El principio de cDNA microarray es la hibridación, pero a diferencia de
los métodos tradicionales, se utilizan múltiples sondas, las que unidas a un sistema
cuantitativo de análisis, permiten identificar patrones de expresión génica. Esta
metodología, aunque aún se encuentra a nivel experimental, tiene una proyección
tan importante en clínica como la PCR.
Figura Método de ADN ramificado (branched DNA) para cuantificación de ácidos nucleicos.
El proceso comienza con la hibridación de las sondas de captura a una fase sólida. A
continuación se produce la reacción de hibridación entre las sondas de captura y el ADN o
ARN en estudio, lo cual es seguido de la introducción de la sonda de amplificación que
contiene múltiples sitios para las sondas de revelado. Estas últimas están conjugadas con
moléculas quimioluminiscentes de modo que la cantidad de luz emitida es proporcional a la
cantidad de ADN o ARN hibridado.
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toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en
el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que
absorben estas bases (260 nm), la absorción de energía será mucho menor si la
cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta última los
dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energía, están
totalmente expuestos a la fuente emisora de energía.
Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T;
A=U; C≡G; G≡C; T=A ó U=A
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Fragmentos de DNA
Fragmentos de RNA
Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas.
Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a permitir la detección de esta
tras un proceso de hibridación. Existen moléculas reporter de muchos tipos:
radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimáticas (Fosfatasa,
Peroxidasa...) y quimioluminiscentes (ésteres de acridina).
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3.4.3. BIOINFORMÁTICA
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A lo largo del tiempo, el ADN almacena mutaciones que se heredan y, por tanto,
contiene información histórica, de manera que comparando secuencias de ADN, los
genetistas pueden inferir la historia evolutiva de los organismos, su filogenia. La
investigación filogenética es una herramienta fundamental en biología evolutiva. Si
se comparan las secuencias de ADN dentro de una especie, los genetistas de
poblaciones pueden conocer la historia de poblaciones particulares. Esto se puede
utilizar en una amplia variedad de estudios, desde ecología hasta antropología,
como ilustra el análisis de ADN llevado a cabo para identificar las Diez Tribus
Perdidas de Israel. Por otro lado, el ADN también se utiliza para estudiar relaciones
familiares recientes.
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CAPÍTULO IV
TÉCNICA DIRECTA DE LA AMPLIACIÓN DEL ADN
MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
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La PCR fue desarrollada por Kary Mullis en 1985, utilizando como DNA polimerasa
el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli y lo llevó a cabo cambiando
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los tubos de reacción en cada ciclo, entre dos baños que estaban a 94 ºC
(desnaturalización) y 37 ºC (hibridación y extensión del cebador). Debido a que esta
enzima se desnaturaliza a temperaturas superiores a 37 ºC, era necesario añadirla
en cada uno de los ciclos tras el paso de desnaturalización, lo que convertía a la
PCR en una técnica tediosa y costosa. La PCR mejoró vertiginosamente como
herramienta de laboratorio a partir de 1988, gracias a dos hechos que hicieron que la
técnica se pudiera automatizar: el primero de ellos fue la comercialización de la
enzima denominada Taq polimerasa que es un enzima termoestable, por lo que
permanece activa después de incubaciones prolongadas a 94 ºC, y no hay que
añadirla en cada ciclo de amplificación. El segundo hecho fue la aparición en el
mercado de los primeros termocicladores que realizaban los cambios de temperatura
automáticamente, sin necesidad de distintos baños. La gran revolución que ha
producido en la Biología Molecular la aparición de la PCR ha supuesto para su
descubridor la concesión del Premio Nobel en el año 1993.
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ciclo sirven de molde para ciclos siguientes. Por lo tanto, la PCR es una reacción
de amplificación de fragmentos de ADN en forma exponencial y al final del ciclo
35-40 en el tubo de ensayos existen millones de copias del fragmento de interés.
Los componentes de la reacción de PCR son los que siguen, los cuales deben
mezclarse adecuadamente en el tubo de reacción. La cantidad y calidad de estos
componentes influyen significativamente en la especificidad, calidad y
rendimiento de esta reacción; igualmente influye el diseño de los ciclos de
temperatura, como se describen más abajo.
1. El ADN molde del cual se quiere amplificar un fragmento
2. Los oligonucleótidos cebadores
3. ADN polimerasa
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4. MgCl2
5. Desoxiribonucleótidos libres (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)
6. Tampón (pH, fuerza iónica y aditivos adecuados para la enzima empleada)
4.3. CICLOS DURANTE LA PCR.
Hay tres etapas fundamentales en un PCR, las cuales son repetidas entre 30 y 40
veces. Esto es realizado en un termociclador automático que realiza estos cambios
de temperatura en muy corto tiempo.
1. Desnaturalización (940C): La doble hebra del ADN se separa en dos cadenas
independientes.
En esta etapa todos los procesos enzimáticos están detenidos.
2. Hibridización o anneling (450C – 600C): Los oligonucleótidos se unen a sus
secuencias específicas por complementación de bases, la polimerasa se une al
ADN y usando el oligonucleótido como cebador comienza a polimerizar.
3. Extensión (720C): Es la temperatura ideal para que polimerase la enzima. La
polimerasa adiciona los desoxiribonucleótidos (dNTPs) complementarios a la
cadena molde de 5´ a 3´ (la cadena molde se lee de 3´ a 5´).
4.4. APLICACIONES.
La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia básica, como
herramienta de detección y/o generación de acervos de fragmentos de ADN de
interés; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en sí mismo, por ejemplo
en diagnóstico clínico.
4.4.1. INVESTIGACIÓN
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4.4.2. MEDICINA
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CAPÍTULO V
TÉCNICA DIRECTA DE LA SECUENCIACIÓN
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La secuenciación del ADN es una técnica que no estuvo disponible hasta 1977
cuando Sanger, por un lado, Maxam y Gilbert, por otro, idearon dos estratégicas
diferentes con esta finalidad. Aunque ambas técnicas son utilizadas en la actualidad
para ciertos propósitos, es la idea de Sanger la que se utiliza de forma rutinaria al a
hora de secuenciar moléculas de ADN.
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Al final del proceso tendremos que, a partir del cebador, se habrá originado una
mezcla de cadenas de ADN de cadena sencilla y longitud variable, las cuales, todas
poseen en el extremo 5 el oligonucleótido utilizado como cebador, y en el extremo 3
de un ddNTP fluorcente correspondiente a la base complementaria del ADN molde.
Ya que cada ddNTP emite una luz de longitud de onda diferente, cada una de esas
cadenas de ADN podrá ser interpretada como una base en la secuencia del ADN.
Los secuenciadores de uso más común en los laboratorios utilizan para separar las
cadenas de ADN de cadena doble un sistema de electroforesis capilar, que posee
grandes ventajas respecto a los geles convencionales que se utilizan en el pasado.
Una de ellas es que se evita la preparación del gel. Otra ventajas es que se pueden
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aplicar voltajes superiores, ya que el calor generado puede ser disipado rápidamente
gracias al pequeño diámetro de los capilares (entre 50 y 100 micras solamente), lo
que acorta el tiempo necesario para separar la muestra. Además, ya que la muestra
es leída al ir pasando las cadenas de ADN por el detector, no es necesario obtener
ninguna imagen del gel, ni interpretar el resultado.
El secuenciador esta también equipado con el dispositivo para emitir rayo laser y con
la cámara necesaria para medir la longitud de onda que emiten las cadenas de
oligonucleótidos al ser excitadas. A medida que va pasando la muestra, van
apareciendo picos de emisión de luz de una determinada longitud de onda, que son
recogidos por la cámara en forma de cromatogramas. Dichos cromatogramas son a
su vez interpretados en un ordenador, el cual suministra directamente la secuencia.
5.5. APLICACIONES.
El conocimiento exacto de la secuencia abre la puerta a llevar a cabo
manipulaciones en el ADN que permitan conocer funciones especificas, tales como
muta génesis dirigidas, delecciones, expresión en sistemas heterógenas, etc.…
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CAPÍTULO VI
CONCLUCIONES Y BIBLIOGRAFÍA
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6.1. CONCLUCIONES
CONCLUCION GENERAL
Luego de haber obtenido las conclusiones relacionadas con los objetivos específicos,
queda demostrado el objetivo general de esta monografía que fue fortalecer los
conocimientos obtenidos en el seminario de graduación los cuales me permiten
analizar y demostrar la importancia de las ¨Técnicas básicas de la Biología
Molecular¨ y sus aplicaciones mediante la recopilación bibliográfica y científica, con
el fin de obtener el título de Químico Farmaceuta otorgado por la Universidad
Católica De Cuenca al culminar el cuarto año de la carrera, por lo tanto, este
documento es una guía para que el estudiante de biofarmacia se desenvuelva de
buena manera frente a la práctica cotidiana que exige su profesión.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. El origen de la biología molecular se puede rastrear hasta fines del siglo XIX; sin
embargo, el descubrimiento de la estructura del ADN se considera como el inicio
de esta disciplina. Los avances producidos por la biología molecular en la década
´60 nos permiten contar hoy con herramientas para el estudio de
microorganismos a nivel molecular. Las Disciplinas científicas que forman parte
de la Biología Molecular son; Bioquímica Estructural, Bioquímica Inorgánica,
Bioquímica Metabólica y Enzimología, Fisiología Molecular, Química Física.
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6.2. BIBLIOGRAFÍA:
1. KLUG William, CUMMINGS Michael, SPENCER Charlotte; CONCEPTOS DE
GENÉTICA, Editorial Pearson Educación S.A, Edición 8ª, Madrid España
2006
2. KLUG William, CUMMINGS Michael, SPENCER Charlotte, “et al”, conceptos
de genética, Editorial Pearson Educación S.A, Edición 8ª, Madrid España
2006.
3. BRUCE Alberts, (1938- ), JOHNSON, ALEXANDER, LEWIS, JULIAN; COLL
Durfort, “et al”, Biología molecular de la célula, Ediciones Omega, S.A, 5ª ed.,
1ª imp (07/2010)
4. LEÓN SERRANO, Javier, manual de genética molecular, Editorial Síntesis,
S.A, 1. ed.(12/1990)
5. GONZÁLEZ HERNÁNDEZ A, Principios de bioquímica clínica y patología
molecular, Ediciones Elsevier España, S.A, 1ª ed.(2010)
6. Nelson, David L.; Cox, Michael M.; Lehninger, Albert L., Lehninger: principios
de bioquímica, Ediciones Omega, S.A, 1ª ed., 1ª imp.(07/2009).
7. Tymoczko, John L.; Berg, Jeremy M.; Stryer, Lubert, Editorial Reverte,
6(08/11/2007).
8. Williams, Bryan L.; Wilson, Keith, principios y técnicas de bioquímica
experimental, Ediciones Omega, S.A, 1. ed.(02/1981).
9. Ramos Ruiz, Ricardo, Técnicas de investigación en biología molecular,
Universidad Autónoma de Madrid, Servicio de Publicaciones,1ª ed., 1ª
imp.(10/2000)
10. Tagu, Denis; Moussard, Christian, Fundamentos de las técnicas de biología
molecular, Editorial Acribia, S.A, 1ª ed., 1ª imp.(04/2006).
11. Freifelder, D., Técnicas de bioquímica y biología molecular, Editorial Reverté,
S.A, 1ª. ed. , 4ª. imp.(06/1981)
Direcciones en internet:
http://www.argenbio.org/xaga/h/biotecnologia/02_a4.php
http://www.elergonomista.com/biologia/historia.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADa
http://definicion.de/ciencias-naturales/
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
PRELIMINARES__________________________________PÁGINAS
CARÁTULA……………………….………………………………………………………….……………………I
DEDICATORIA………..…..………………………………………………………..………….................II
AGRADECIMIENTO……………………………………..……………………………………………….III
ÍNDICE…………………………………………………………………………………………………………...IV
INTRODUCCIÓN…………..………………………………………………………………………………VIII
OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………….…..X
CAPÍTULO ‘I’............................................................................................................. .- 1 -
CONCEPTOS BÁSICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ..................................... - 1 -
1.1. HISTORIA Y ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. ................................. - 2 -
1.1.1. LOS PRIMEROS PASOS......................................................................... - 2 -
1.1.2. ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR .......................................... - 6 -
1.2. DISCIPLINAS QUE FORMAN PARTE DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. ....... - 8 -
1.3. INFORMACIÓN GENÉTICA Y EL GENOMA. ................................................. - 10 -
1.3.1. EL GENOMA ........................................................................................ - 10 -
1.3.2. MATERIAL GENÉTICO ...................................................................... - 12 -
1.3.3. CROMATINA Y LOS CROMOSOMAS ................................................ - 12 -
1.3.4. LOS GENES ......................................................................................... - 14 -
1.4. TIPOS Y COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS. ...............................- 15 -
1.4.1. ÁCIDO NUCLÉICO ...............................................................................- 15 -
1.4.2. NUCLEÓSIDOS Y NUCLEÓTIDOS .................................................... - 18 -
1.4.3. LOS DINUCLEOTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS ............................. - 19 -
1.5. FUNCIONES Y ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS. ..................... - 20 -
1.5.1.ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO O ADN …………………………………..- 21 -
1.5.2. ÁCIDO RIBONUCLEICO O ARN ........................................................ - 27 -
1.6. DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR .................................... - 30 -
1.6.1. LA TRANSCRIPCIÓN .......................................................................... - 30 -
1.6.2. LA TRADUCCIÓN Y EL CÓDIGO GENÉTICO ................................... - 31 -
1.7. ENZIMAS Y VECTORES USADOS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR............. - 33 -
1.7.1. CONCEPTO DE ENZIMA .................................................................... - 33 -
1.7.2. USOS DE LAS ENZIMAS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR ............. - 33 -
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CAPÍTULO II ............................................................................................................ - 37 -
OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO ...... - 37 -
2.1. ETAPAS DE LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO ........... - 38 -
2.1.1. PRINCIPIOS DE LAS TÉCNICAS CON ÁCIDOS NUCLEICOS .......... - 38 -
2.1.2. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO ........................ - 39 -
2.2. CLONADO DEL GEN. ....................................................................................... - 44 -
2.2.1. PRINCIPIOS DE CLONACIÓN MOLECULAR ................................... - 44 -
2.2.2. PASOS A SEGUIR PARA UNA CLONACIÓN MOLECULAR ............ - 44 -
2.3. ELECTROFORESIS........................................................................................... - 47 -
2.3.1. FUNDAMENTO DE LA ELECTOFORESIS ........................................ - 47 -
2.4. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DEL ADN .................................... - 49 -
2.4.1. EXTRACCIÓN DE ADN ...................................................................... - 49 -
2.4.2. ALMACENAMIENTO DEL ADN ....................................................... - 49 -
2.4.3. CONSERVACIÓN DEL ADN EN TEJIDO FRESCO .......................... - 50 -
2.5. NORMAS EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR. ................. - 50 -
2.5.1.POSIBLES CONTAMINACIONES EN EL LABORATORIO DE ..................
BIOLOGIA MOLECULAR .................................................................... - 50 -
2.5.2.ORGANIZACIÓN ESPACIAL DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA .........
MOLECULAR .........................................................................................- 51 -
2.5.3. OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS . .......... - 52 -
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CAPÍTULO IV ............................................................................................................- 71 -
TÉCNICA DIRECTA DE LA AMPLIACIÓN DEL ADN MEDIANTE LA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ...................................- 71 -
4.1. FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. ..... - 72 -
4.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA REALIZAR LA PCR........................... - 74 -
4.3. CICLOS DURANTE LA PCR. ............................................................................ - 75 -
4.4. APLICACIONES. ............................................................................................... - 75 -
4.4.1. INVESTIGACIÓN ................................................................................ - 75 -
4.4.2. MEDICINA ......................................................................................... - 76 -
CAPÍTULO V ............................................................................................................ - 79 -
TÉCNICA DIRECTA DE LA SECUENCIACIÓN ............................................... - 79 -
5.1. FUNDAMENTO DE LA SECUENCIACIÓN. .....................................................- 80 -
5.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA LA SECUENCIACIÓN. ...................... - 81 -
5.3. CONDICIONES UTILIZADAS DURANTE LA SECUENCIACIÓN. ................. - 82 -
5.4. SECUENCIADORES DE ADN. ......................................................................... - 82 -
5.5. APLICACIONES. ............................................................................................... - 83 -
CAPÍTULO VI ........................................................................................................... - 84 -
CONCLUCIONES Y BIBLIOGRAFÍA ............................................................... - 84 -
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