OBSERVACIONES SOBRE EL USO DE PNEUMOCOCCUS

EXTRACTOS EN EL EFECTO DE LA TRANSFORMACIÓN

DE TIPO EN VITRO

El hecho ha sido probado de manera concluyente por Griffith (1), y subsecuentemente

confirmado por Neufeld y Levinthal (2) y Dawson (5) que los neumococos R derivados de
organismos S de un tipo específico pueden transformarse en formas S de un tipo específico
diferente. El cambio se cumplio in vivo primera vez por Griffith, quien inyectó en ratones
organismos vivos R derivados de un tipo de Neumococos junto con grandes cantidades de
neumococos S muertos por calor de un tipo diferente. Las formas vivas S del mismo tipo
que las de los organismos S muertos inyectados, se recuperaron de los animales.

Dawson y Sta (4, 5) tuvieron éxito más tarde al provocar la transformación del tipo in vitro.
Inocularon cantidades diminutas de organismos vivos R derivados de un tipo de
Pneumococcus, un medio de caldo que contenía suero anti-R y todos los organismos S
exterminados por calor de un tipo diferente. De los cultivos originalmente inoculados con
neumococos R, se recuperaron organismos S que eran de tipo idéntico al de los neumococos
S muertos presentes en el medio. En un trabajo anterior de este laboratorio (7), se
describieron experimentos en los que se había elegido la transformación del tipo en vitro a
través del uso de extractos libres de células de S. pneumococci. Estos extractos, aunque
ilegibles (filtrables?), eran crudos y contenían grandes cantidades de restos celulares que
ahora se sabe que no son esenciales para la transformación. Además, el método de
preparación anterior dio como resultado la pérdida de una cantidad considerable de la
sustancia activa. El presente trabajo describe un método más eficiente de extracción de
neumococos, y registra los resultados de los intentos de purificación adicional de la
sustancia activa.

Métodos

Cultivos.-Los cultivos de neumococos R utilizados en los experimentos fueron cepas madre

originalmente derivadas de neumococos S específicos de tipo por crecimiento en caldo que
contenía 10 por ciento de suero antipneumococo del tipo homólogo. Los neumococos a
partir de los cuales se prepararon los extractos fueron cepas de tipo específicos S, cuya
virulencia se había mantenido mediante pasajes frecuentes de animales.

Preparación de Extracto de Pneumococcus- Los neumococos S utilizados en la preparación

de extractos se cultivaron en caldo de infusión de carne, pH 7,8, que contenía dextrosa al
0,01 por ciento. Se usaron inóculos grandes para producir un crecimiento rápido y denso.
Al menos 100 cc. de un cultivo moderadamente pesado se usó para inocular 5 litros de
medio. Los cultivos se cultivaron a 37 ° C durante 8 a 10 horas solamente. organismos de 5
litros de cultivo fueron arrojados hacia abajo y luego tomados en 50 cc. de agua destilada
estéril. A esta suspensión se añadieron 3,5 cc. de una solución estéril al 10% de desoxicolato
de sodio. La mezcla se mantuvo en un baño de hielo durante 10 minutos, luego se llevó
lentamente a 60 ° C. en un baño de agua Los organismos tratados de esta manera se
disuelven rápidamente, formando un gel espeso y extremadamente viscoso. La preparación
se mantuvo en el baño de agua a 60 ° C. para IS minutos para poner a Bill cualquier
organismo sobreviviente, y para inhibir o destruir las enzimas autolíticas liberadas por la
disolución de las células. La solución bacteriana se añadió lentamente a 500 cc. de alcohol
absoluto previamente enfriado en un baño de hielo. Se formó un precipitado espeso y
fibroso que se asentó lentamente al ponerse de pie. El desoxicolato de sodio, al ser soluble
en alcohol, permaneció en el líquido sobrenadante. El precipitado se arrojó después de 30
minutos, mediante centrifugación, descartando el fluido sobrenadante. La solución de
desoxicolato de sodio fue así eliminada. El precipitado se lavó con alcohol para eliminar los
últimos vestigios de la sal biliar y se secó en el aire o se expuso durante 12 a 14 horas al aire
frío y seco.
El material seco se extrajo a continuación en 100 cc. de estéril
Solución de cHoruro de sodio al 0,85%, ligeramente alcalina mediante la adición de 0.5 cc.
De N / 10 hidróxido de SOdio, sellado en ampollas de vidrio, y sumergido durante 15
minutos en un baño de agua a 60 ° C. La preparación se centrifugó luego durante 30 minutos
y el residuo insoluble, que contenía solo una pequeña cantidad del material activo, se
descartó. El extracto sobrenadante era un líquido ligeramente turbio, delgado y
opalescente. Los extractos fueron sometidos a pruebas rígidas de esterilidad. Se cultivaron
en caldo simple, en caldo de sangre, en agar sangre y en medios enriquecidos por la adición
de líquido ascítico o de tórax. En ningún caso se cultivaron neumococos a partir de los
extractos. Inyectado en cantidades de hasta 1 cc. en ratones, no causaron ningún efecto
adverso más que letargo leve durante unas pocas horas. Todos los animales de prueba
sobrevivieron.
Medio de cultivo. Dawson y Sin encontraron en sus experimentos in vitro (4, 5), que la
transformación de neumococos de un específico el tipo a otro fue fejado por la adición al
medio de cultivo de suero anti-R Sus observaciones han sido confirmadas repetidamente
en este laboratorio De hecho, ninguna transformación ha sido posible en la experiencia del
autor sin el uso de suero o un fluido seroso en la médium.
El suero de cerdo y el suero de conejo anti-R se usaron en experimentos anteriores. Tiene
encontrado recientemente, sin embargo, que ascitis líquido ascítico o de torax es más
efectivo que el suero sanguíneo, cuando se agrega al caldo de nutrientes en proporción de
1 a 3. La el fluido del tórax utilizado en los presentes experimentos se obtuvo de un paciente
con insuficiencia cardíaca y anasarca general. Era un trasudado claro, de color pajizo, y
probado estéril en la cultura. Antes de su uso, se filtró a través de un Berkefeld V vela. Las
valoraciones de sus propiedades anti-R revelaron que aglutinaría R neumococos solo en
diluciones de 1-20, o, raramente, 1-40

Técnica Cultural. La técnica cultural empleada para efectuar las transformaciones. fue
similar, salvo por cambios menores, a lo descrito en un documento anterior (7). Inocnla,
que consiste en 1 gota de una dilución l0-4 de un cultivo de 8 horas de R pneurnococci, se
agregaron a una serie de tubos que contenían 1,5 cc. de caldo, 0.5 cc. de cofre fluido, y
cantidades variables, 0.05 a 1.0 cc., del extracto de neumococo específico. Los cultivos se
desarrollaron aeróbicamente a 37 ° C. por 24 horas Transfiere a fresco medio se hicieron en
serie cada 24 horas, 1 gota de cultivo se lleva adelante a un tubo correspondiente en la
segunda serie. En el momento de cada transferencia, subculturas se hicieron en placas de
agar sangre para el estudio posterior de la colonia características de los organismos. Ningún
experimento se consideró negativo hasta cinco transferencias en serie fueron hechas.
Siempre que se observaron colonias lisas en la subcultura, una colonia típica se transfirió a
caldo de sangre y el tipo específico de los organismos fueron posteriormente identificados
serológicamente.

Actividad de los extractos. Extractos hechos de neumococos S por la acción del desoxicolato
de sodio resultó mucho más eficaz en la inducción transformaciones en el tipo que los
extractos que antes preparado a partir de organismos congelados y descongelados. Fueron
efectivos en alta dilución, e incluso no logró inducir un cambio si está presente demasiado
concentración. Conversión de neumococos R derivados del tipo II Organismos S en
neumococos tipo III se podría lograr en casi todas las instancias mediante un extracto de
organismos Tipo III. La Tabla I muestra los resultados de un experimento típico.

Purificación adicional de extractos

Adsorción en CharcoaL - Se hicieron intentos para separar el activo transformando el
material de los desechos celulares inertes mediante el uso de varios adsorbentes. Se
encontró que el carbón de leña en polvo daba resultados satisfactorios y consistentes. La
purificación con carbón fue llevado a cabo de la siguiente manera: 100 cc. del extracto
preparado de la manera descrita se diluyó con un volumen de solución estéril al 0,85% de
cloruro de sodio. 8 ginebra de polvo estéril se añadió carbón de leña al extracto diluido y la
mezcla se agitó durante 5 minutos. La preparación se centrifugó a alta velocidad durante
30 minutos y el fluido sobrenadante, que aún contiene cantidades considerables de
carbón suspendido, fue eliminado. Esta solución se filtró a través de estéril papel de filtro y
finalmente a través de una vela Berkefeld V. El extracto filtrado fue generalmente claro
como el agua, incoloro y bastante límpido. Los extractos purificados por el uso de carbón
fueron más activos en efectuar transformación que fueron los extractos crudos. Además,
era mucho más fácil determinar cuándo se produjo la transformación en las culturas que
contiene estos extractos claros. El medio fue completamente claro y transparente en la
inoculación. El crecimiento fue granular y se asentó en la parte inferior del tubo, siempre y
cuando los organismos conserven su R características. Cuando las células S se desarrollaron,
sin embargo, el crecimiento se volvió difuso a través del medio. La presencia de crecimiento
difuso en el medio de cultivo era evidencia presuntiva de que las colonias S serían
encontrado más tarde en el enchapado
* Extractos preparados disolviendo pneumococos S en una solución de desoxicolato de
sodio, precipitarse en alcohol, redisolverse en solución salina, adsorberse en carbón
vegetal, y filtrando a través de la vela Berkefeld V; Extracto de tipo I preparado a partir del
tipo I neumococos, tipo II de neumococos tipo II y tipo III de tipo III neumococos. J "Los
controles se prepararon usando cantidades de 1.0 y 0.5 cc del extracto en el experimento
original que se muestra aquí muy abreviado. Todos los controles fueron estéril.

Extractos adsorbidos en carbón de los neumococos de los Tipos I, II y III S. se prepararon y

se encontró que son muy activos en todos los casos. En la Tabla II se registran las
transformaciones producidas a través del uso de extractos después de la eliminación de
material inactivo considerable por carbón vegetal adsorción.
Como muestran los resultados presentados en la Tabla II, fue posible causar R neumococos
derivados de cada uno de los tres tipos específicos para volver a sus formas S originales a
través del uso de extractos específicos de los homólogos tipo. Del mismo modo, era posible,
con una excepción, efectuar un transformación selectiva en tipo, por lo que las células R
derivadas de cada tipo de Pneumococcus se cambiaron a las formas S de cada uno de los
otros dos tipos específicos en presencia del extracto apropiado. Fue imposible, en dos
intentos realizados, efectuar la transformación de neumococos R derivados de organismos
S tipo III en Tipo I neumococos. En cambio, estos neumococos R particulares revirtieron a
S formas del tipo específico original del cual se derivaron; a saber, Tipo III. La tendencia de
los neumococos lZ a revertir a S organismos del tipo original, incluso en presencia de una
suspensión de organismos S calcinados de tipo heterólogo, se encontraron y comentada
tanto por Griffith como por Dawson. Como se indicó en el documento anterior (7), fue
bastante fácil convertir R neumococos derivados de organismos del tipo II S en formas del
tipo III S.
En la mayoría de los casos, el cambio ocurrió en la primera cultura dentro de los 15 a 20
horas. Otras cepas R cambiaron menos fácilmente y a menudo requerían dos, tres e incluso
cuatro transferencias. Por lo tanto, en el experimento que se muestra en Tabla II, los
organismos R derivados de neumococos tipo I S se cambiado en formas de Tipo II solo en el
tercer cultivo sucesivo en el medio que contiene extracto
Reprecipitación en acetona o alcohol. Aún más purificación de los extractos adsorbidos en
carbón se lograron por precipitación en acetona. El extracto filtrado, después de la
adsorción de carbón, se precipitó en 10 volúmenes de acetona en el frío. La preparación,
después de reposar 1 hora, se centrifugó a alta velocidad durante 30 minutos y se descartó
la acetona sobrenadante. El sedimento se secó a vacío y se recogió en el volumen original
de destilado estéril agua. Gran parte del precipitado permaneció insoluble. El residuo
insoluble fue arrojado por centrlfugation y descartado. El sobrenadante contenido el
material activo sin pérdida apreciable. El alcohol fue sustituido por acetona con igual éxito.
La mayoría del material activo se precipitó con un 70 por ciento de alcohol: todo por 100
por ciento La sustancia activa después de la precipitación en acetona o alcohol era soluble
en agua No se produjo ninguna pérdida demostrable en la potencia del tratamiento con
estos reactivos, como lo demuestran los datos presentados en la Tabla III.

Propiedades del extracto

Resistencia al calor. La sustancia transformante fue más resistente calentar en extractos
liberados de gran parte del material extraño presente en toda la célula de neumococo y en
las preparaciones en bruto. Griffith y Dawson encontraron (1, 3, 6) que calentando las
células intactas

* Extracto de neumococo preparado precipitando el carbón purificado adsorbido extracto

de S organismos en acetona y extraer el precipitado en agua destilada agua. A temperaturas
superiores a 80 ° C. prestados las suspensiones bacterianas utilizadas en la creación de
transformaciones in vivo, incapaz de inducir cambios en tipo, mientras que el calentamiento
a temperaturas más bajas, si la exposición no fue demasiado largo, causó muy poca
disminución en la potencia. Experimentos con extractos purificados demostró que aunque
estos preparados mostró una disminución progresiva de la potencia al calentar a más de 80
° C., sin embargo, ocasionalmente fueron activos después de 10 minutos de exposición en
el baño de agua a una temperatura tan alta como 90 ° C. El efecto en la actividad de un
extracto calentado durante 10 minutos a 70 °, 80 ° y 90 ° C., respectivamente, es evidente
a partir de los resultados experimentales dados en la Tabla IV.

* Extracto de neumococo tipo III S preparado disolviendo el cultivo en un solución de

desoxicolato de sodio, que precipita en el alcohol, y la extracción del precipitar en solución
salina. t Cepa de R Neumococo derivado originalmente de organismos del tipo II S.

A partir de los datos presentados en la Tabla IV, es evidente que el neumococo extractos se
volvieron progresivamente menos activos después de la exposición a temperaturas
superiores a 80 ° C, y que la pérdida incurrida fue aproximadamente en proporción directa
al grado de calentamiento. Sin embargo lo és también es evidente que en el estado actual
de pureza, un extracto ocasionalmente retuvo suficiente actividad para provocar cambios
incluso después de la calefacción a 90 ° C. durante 10 minutos. La ebullición invariablemente
destruyó la actividad de los extractos purificados
* Extracto de neumococo tipo III preparado por filtración de carbón purificado,
charcoaladsorbed extracto a través de la vela Berkefeld W t Cepa de R neumococo derivado
de S. tipo II

Filtrabilidad. Se dijo en un documento anterior (7) que el neumococo extractos preparados

por congelación y descongelación de las células bacterianas, podría filtrarse a través de las
velas Berkefeld N y aún así conservar su capacidad para efectuar cambios en el tipo.
Investigaciones recientes mostraron que cuando el extracto purificado era alcalino en
reacción, filtración podría llevarse a cabo sin pérdida de potencia demostrable, no solo a
través del N pero también a través del filtro tipo W de Berkefeld. Cuando el extracto era
ácido, sin embargo, la filtración resultó en la pérdida completa de actividad. Los extractos
purificados que pasaron por los filtros W fueron de cristal claro e incoloro. Todavía
mostraron una actividad completa como se demostró por los resultados del experimento
de filtración registrado en la Tabla V.
* Extracto preparado disolviendo neumococos tipo I en una solución de sodio desoxicolato,
precipitando en alcohol, extrayendo el precipitado en solución salina, Adsorción con carbón
y filtrado a través de la vela Berkefeld V.t Todas las inyecciones realizadas por vía
intraperitoneal.
S = sobrevivió; periodo de observación 21 días.
D = murió; el número indica el número de horas antes de la muerte del animal.

Sustancia específica soluble. Los extractos purificados contienen cantidades de la sustancia

soluble específica de los neumococos de que estaban preparados. Sin embargo, la
concentración del tipo sustancia específica era relativamente baja, ya que en la mayoría de
los casos el extractos reaccionados específicamente en suero antipneumococo del tipo
homólogo solo en diluciones de 1-40 u ocasionalmente de 1-80. Esta indica una
concentración probable del polisacárido capsular específico de aproximadamente 0.01 rag.
por cc. de extracto.

Antigenicidad. Era interesante saber si estos extractos poseía propiedades antigénicas y

transformantes. Fue encontrado que los extractos preparados no solo estaban activos en la
transformación efectiva en tipo, pero también fueron capaces de inducir inmunidad activa
en ratones tratados con las preparaciones purificadas. El protocolo mostrado en La Tabla VI
ilustra el grado de inmunidad activa inducida en ratones por inyecciones intraperitoneales
repetidas de un extracto activo. De los resultados registrados en la Tabla VI, se puede ver
que la inmunidad activa se indujo en ratones mediante tres inyecciones, a los 3 intervalos
de días, de 0.2 cc. de extracto purificado de neumococo tipo I. De 8 ratones así tratados e
inoculados 7 días después con una cepa de virulencia Tipo I Pneumococcus, 5 sobrevivieron
a un inóculo infeccioso 100 a 100.000 veces mayor que el que invariablemente resultó fatal
para el animales de control normal.

DISCUSIÓN
Extractos de neumococos S preparados por la acción de disolución de desoxicolato de sodio
fueron tan activos como lo fueron las células intactas al hacer que los formularios R asuman
caracteres específicos de tipo. Su acción fue específico, el cambio en el tipo fue
determinado selectivamente por el especificidad del extracto empleado. La sustancia o
sustancias activas en el extracto crudo inducir los cambios podría ser considerablemente
liberado de las impurezas que lo acompañan por la precipitación en el alcohol, mediante
adsorción de carbón y reprecipitación en alcohol o acetona. Estos procedimientos parecían
no disminuir la potencia del activo preparativos. De hecho, en una mayor purificación, los
extractos exhibidos en la mayoría de los casos aumenta la actividad, lo que induce una
transformación más rápida. A pesar del hecho de que el polisacárido capsular del
neumococo determina su especificidad de tipo, no fue posible correlacionar la actividad de
los extractos que estimulan el desarrollo de características específicas de tipo en
neumococos R, con la presencia de la sustancia específica soluble. Extractos que
aparentemente eran igualmente potente en causar la transformación varió
considerablemente en su contenido de sustancia específica soluble. Se ha demostrado (6)
que polisacárido capsular específico en forma químicamente purificada, como tal, es
ineficaz en inducir transformación en tipo. Parece probable por lo tanto, si la sustancia
soluble específica en estos extractos es preocupado en absoluto en la reacción, está
presente allí en un físico diferente estado, o en combinación con alguna otra sustancia que
confiere sobre ella propiedades que no se encuentran en los químicamente aislados y
altamente sustancia purificada Ciertas cepas de neumococos R resultaron ser más
resistentes a la transformación que otros, pero ninguno se encontró que fueron
completamente refractarios. Transformación de neumococos R derivados de las cepas Tipo
II a las formas Tipo III S en presencia de El extracto tipo III parecía tener lugar casi de forma
abrupta. Muy raramente fueron colonias de transición notadas. Del mismo modo, bajo la
influencia de Extracto de tipo II, las células R derivadas de organismos de tipo III cambiaron
abruptamente a neumococos tipo II. Sin embargo, el cambio de formas R derivados de
neumococos de tipo II a los organismos de tipo I S era un más gradual, y requirió, a veces,
una serie de transferencias en el específico medio de extracción En este caso, todas las
etapas de transformación fueron observado en colonias plateadas de una cultura individual.
Una vez que el cambio fue completa, sin embargo, los caracteres específicos del tipo recién
adquiridos persistió.
El factor que es presumiblemente común para el suero sanguíneo, ascítico y el líquido del
tórax, y que es esencial en la reacción, permanece desconocido.
Ningún experimento se completó con éxito sin la adición al medio de una u otra de estas
tres sustancias relacionadas. Los presentes experimentos proporcionan evidencia adicional
de que la transformación en tipo no es aparente, sino real, y que los cambios son
provocados en presencia del extracto a través de la acción específica de un constituyente
soluble presente en formas S de neumococos. Eso es casi inconcebible que cualquier
elemento viviente en el neumococo célula podría sobrevivir a los drásticos procedimientos
empleados en la preparación de los extractos. A través de la acción del desoxicolato de
sodio, neumococo se disolvieron por completo para que no celular reconocible las formas
permanecieron. Los extractos se calentaron a 60 ° C. para un total de 30 minutos durante
el curso de la preparación, y en tubos de vidrio sellados se sumergieron por completo en el
baño de agua durante parte del calentamiento. Estuvieron expuestos a la acción del alcohol
absoluto durante 30 minutos, y se saturaron con alcohol de intensidad variable para varias
horas. Fueron tratados con carbón que eliminó mucho del material particulado, y
finalmente se filtraron a través de Berkefeld Filtros en V Incluso podrían calentarse a 90 ° C.
por períodos cortos, o pasó a través de los filtros W de Berkefeld y aún permanece activo.
Controles de esterilidad eran excesivamente rígidos. Los extractos fueron inyectados en
grandes cantidades en ratones sin ningún efecto adverso. Todas las culturas de los extractos
y de los animales sacrificados a diversos intervalos después de la inyección de material
activo, eran estériles.

La naturaleza exacta del material activo en estos extractos aún permanece estar
determinado. Que actúa como un estímulo específico para el R células que tienen
potencialmente la capacidad de elaborar el capsular polisacáridos de cualquiera de los
varios tipos de neumococos parece claro.

RESUMEN
Los extractos de neumococo son muy activos para inducir la transformación in vitro de los
tipos específicos de Pneumococcus han sido preparados por disolviendo células S con
desoxicolato de sodio, precipitando la disolución material en alcohol en el cual la sal biliar
permanece soluble, y extraer el precipitado en solución salina La purificación adicional de
estos extractos activos se han logrado mediante la eliminación de considerables material
inactivo por adsorción de carbón y por reprecipitación del extracto adsorbido en alcohol o
acetona. La importancia de usar cultivos jóvenes para la extracción y para prevenir la
autólisis durante el preparación de los extractos, se enfatiza. Los extractos preparados por
el método descrito se han filtrado a través de Berkefeld Candles (V, N y W) sin pérdida
apreciable en actividad, siempre que la reacción del extracto sea ligeramente alcalina en el
tiempo de filtración Los extractos purificados y filtrados son waterclear, y estéril por
pruebas culturales y animales rígidas. Ellos han estado calentado a temperaturas de 60 ° C.
durante 30 minutos sin apreciable pérdida en su capacidad para inducir cambios específicos
en el tipo. Y aunque en general, han demostrado una disminución definitiva en la potencia
después de calentando a temperaturas superiores a 80 ° C., se han encontrado algunos
extractos activo incluso después de una exposición de 10 minutos a una temperatura de 90
° C. Han sido completamente inactivados por ebullición. Cantidades relativamente
pequeñas de extracto han sido efectivas cuando se agregan a un medio de caldo que
contenga suero normal o fluido seroso. En esto neumococos medianos, R,
independientemente de su derivación tipo, tienen desarrollado y, a partir de entonces,
conservado todas las características específicas de tipo de las células S encapsuladas a partir
de las cuales se preparó el extracto. La acción específica de los extractos se discute con
referencia a sus propiedades transformantes y antigénicas.
BIBLIOGRAPHY
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