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5. Electroforesis de proteínas
Realizar electroforesis vertical discontinua denaturante de proteínas
5.1 Ensamblaje de la cámara de electroforesis
5.1.1 La cámara de electroforesis ya ensamblada deberá estar ubicada sobre una
superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el
momento en el que se vierte la solución del gel dentro de la cámara, ya que
se evita el derrame de la solución y la generación de matriz desnivelada. Esta
última podría generar la distorsión del perfil de las bandas de las proteínas al
final de la electroforesis.
5.2 Preparación de los geles de poliacrilamida
5.2.1 La electroforesis de proteínas descrito corresponde al sistema discontinuo
denaturante, está conformado por dos geles de poliacrilamida de
resolución y empacamiento que presentan diferente concentración,
composición y pH. Ambos geles se encuentran unidos pero limitados por
una fase de separación visible al trasluz. Debido a que en estado líquido
ambos geles pueden mezclarse fácilmente, deben ser preparados por
separado esperando la total polimeración del primero para continuar con la
polimerización del otro.
5.3 Preparación del gel de resolución
5.3.1 El gel de resolución es la matriz de poliacrilamida donde las moléculas de
ADN o proteínas, van a migrar generando un perfil de bandas o patrón
electroforético. Dicho patrón varía de acuerdo al peso molecular de cada
una de las moléculas y a la concentración del gel mismo.
5.3.2 Marcar el límite hasta donde la matriz de acrilamida será vertida,
trazando una línea horizontal en el vidrio con un marcador indeleble.
Para saber la ubicación exacta de la línea, colocar el peine entre
ambos vidrios y medir entre uno y cinco centímetros (dependiendo
del tamaño de la cámara) por debajo de los dientes del peine.
5.3.3 Realizar la preparación del gel de resolución a una concentración de
acuerdo a las necesidades, mezclando los componentes en el orden
correspondiente.
 5.3.4 Una vez finalizada la preparación de la solución, añadir los
catalizadores APS y TEMED uno por uno, tratando de mezclar cada
reactivo de manera uniforme en todo el volumen.
5.3.5 Agregar un volumen de la solución de poliacrilamida entre las placas
de vidrio hasta la línea trazada. Posteriormente, añadir una capa de
butanol-agua (aproximadamente 100 µL) sobre la solución de
poliacrilamida para evitar el ingreso de moléculas de oxígeno que
retarden la polimerización.
5.3.6 Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos,
usando como control polimerización la solución de poliacrilamida
remanente.
5.3.7 Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte
superior del gel varias veces con
5.3.8 agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida
no polimerizada y butanol.
5.4 Preparación del gel de empacamiento
5.4.1 Mezclar los componentes del gel
5.4.2 Una vez finalizada la preparación de la solución, agitar moderadamente sin
hacer burbujas a fin de asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan
uniformemente en todo el volumen de la solución.
5.4.3 Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cámara y sobre el gel de
resolución ya polimerizado. Inmediatamente después, colocar el peine
entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos de poliacrilamida
que lleguen a derramarse.
5.4.4 Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30
minutos usando como control de la polimerización la solución de
poliacrilamida que quedó remanente en el tubo
5.4.5 Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los
pocillos ya formados con chorro suave de agua destilada.

5.5 Preparación de la muestra biológica

5.5.1 Mezclar la proteína con el buffer de la muestra concentrada por cuatro
veces (4x) en proporción 3:1 (tres partes de la muestra y una de buffer).
5.5.2 Asegurar la tapa de los tubos con lámina extensible de parafina y someter
la muestra a una temperatura de 100° C durante 5 minutos. Para tal efecto
 colocar los viales en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente o
vaso de precipitación con agua hirviendo.
5.5.3 Controlar la temperatura con un termómetro adecuado.
5.5.4 Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitación y
centrifugarlos por diez segundos a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla
para microtubos dentro de un recipiente con hielo hasta el proceso de
electroforesis.
5.6 Electroforesis
5.6.1 Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un tanque
conteniendo buffer de electroforesis o de resolución para proteínas 1X.
Dicho tanque lleva dos electrodos: uno positivo y otro negativo
(frecuentemente representados por colores rojo y negro, respectivamente)
que serán conectados a una fuente poder (Figuras N° 1 y 5). Al momento de
sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los pocillos del gel estén
totalmente cubiertos por el buffer.
5.6.2 Mediante el uso de puntas de hasta 20 µL y 30 µL de capacidad
proceder a depositar cuidadosamente la muestra en los pocillos
evitando la contaminación del pocillo contiguo.
5.6.3 Considerar el uso de un marcador estándar de proteínas para la
medición del peso molecular de la muestra. Dicho marcador debe ser
sometido a los mismos tratamientos de la proteína, excepto cuando
se trate de un marcador previamente teñido en que el que se obviará
el uso del buffer de la muestra.
5.6.4 Una vez finalizada la colocación de las proteínas en cada pocito del
gel, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables
correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
5.6.5 Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y
amperaje correspondientes.
5.6.6 Para el cálculo del voltaje es importante conocer la distancia en
centímetros del gel desde la parte superior hasta la parte inferior de
la matriz. La distancia multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitirá
determinar el voltaje total. El voltaje óptimo dependerá de la
naturaleza de la molécula de ADN que se piensa separar, en
consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento.
5.6.7 El valor del amperaje o corriente eléctrica (medida en amperios o
miliamperios) dependerá de la fuerza iónica del buffer. En el caso de
 trabajar con buffer Tris-Glicina 1X (Ver solución stock, Anexo A), el
valor recomendado es de 25 a 30 miliamperios.
5.7 Coloración y visualización de las proteínas usando azul brillante de
coomasie
5.7.1 Sumergir el gel de poliacrilamida en un envase de vidrio o teflón,
conteniendo solución de trabajo de azul brillante de coomasie en un
volumen que permita cubrir completamente el gel. Dejar incubando con un
suave movimiento rotatorio por 15 a 20 minutos. Es importante precisar
que el tiempo de incubación dependerá del grado de sensibilidad requerida
en la prueba, de la concentración del gel y de la sensibilidad del azul brillante
de coomasie propiamente dicho. En ese sentido, una máxima sensibilidad
de coloración puede ser obtenida incubando por ejemplo un gel al 5% en 1
hora y un gel al 10% por 2 horas.
5.7.2 Evitar la coloración del gel por más de dos horas, debido a que el
colorante puede quedar retenido fuertemente en el gel generando un
fondo oscuro por sobretinción que impediría la visualización de las
proteínas.
5.7.3 Cubrir el gel teñido con solución de decoloración rápida e incubar por
30 minutos. Eliminar la solución decolorante rápida y añadir un
segundo volumen de la misma solución hasta apreciar las primeras
bandas. Acto seguido, eliminar la solución de decoloración rápida y
añadir la solución decolorante lenta. Dejar destiñendo a movimiento
constante por lo menos una hora, cambiando la solución por una
nueva cuantas veces sea necesario. Seguir destiñendo hasta que las
bandas de las proteínas puedan ser apreciadas claramente.
5.7.4 Finalizada la remoción del azul de coomasie, descartar el decolorante
usado y lavar el gel. Para poder analizar los resultados es
recomendable secar el gel usando un equipo secador a vacío o
manualmente.
5.7.5 Secado manual de geles de poliacrilamida
5.7.6 Remojar el gel teñido en el reactivo glicerol-metanol por 2 horas con
un movimiento de rotación suave.
5.7.7 Posteriormente, remojar una lámina de celofán de aproximadamente
15 x 15 cm en agua y colocarlo encima de un bastidor cuyo tamaño
dependerá del tamaño del gel. Seguidamente, colocar el gel sobre el
celofán y observar que no se formen burbujas.
5.8 Interpretación de resultados
5.8.1 Las proteínas fijadas en geles de poliacrilamida y teñidas con azul
brillante de coomasie se observan como bandas azules de diferentes
pesos moleculares.
5.8.2 El peso molecular de una proteína se mide en kilodaltons
(Equivalente a 1 000 Daltons) y puede ser determinado comparando
la banda con un patrón de proteínas estándar de peso conocido
denominado marcador de peso molecular.
5.8.3 La distribución de las proteínas depende de la concentración del gel,
por lo tanto, el operador deberá seleccionar el marcador de peso
molecular más adecuado.